林 蓁

FR顯色劑在含色素組織免疫組化染色中的應用

林 蓁

色素； FR顯色劑；免疫組織化學

免疫組化染色技術在現(xiàn)代病理診斷工作中起著十分重要的作用。了解常規(guī)HE染色無法區(qū)分或較難辨別的情況，為病理腫瘤的鑒別診斷、預后判斷提供不可或缺的重要依據。但在一些病理組織標本中含有與免疫組化陽性顆粒相近的色素，如黑色素。這些色素沉積若大量存在會不同程度遮蓋組織細胞的結構與形態(tài)。特別是免疫組化染色時會與DAB顯色的陽性顆粒相互干擾，難以區(qū)分。對免疫組化結果判讀造成一定的影響。這就需要有一些辦法來解決。傳統(tǒng)的方法存在不少限制。根據病理診斷的需要及染色技術的許可性，我科對含有較多色素的組織運用羅氏免疫組化ultra View Universal AP Red Detection Kit(AP染色液)來標記。FR顯色，陽性顆粒為玫紅色，定位準確、清晰可辨，與組織原含色素顆粒顏色對比鮮明。標記效果佳，能較好解決上述問題，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集廈門大學附屬成功醫(yī)院病理科2015年間存檔的含有色素組織標本20例。

1.2 方法

1.2.1 組織處理與分組 標本均經10%中性緩沖福爾馬林固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟浸泡后包埋制成蠟塊。將蠟塊3 μm厚切片，裱在防脫載玻片上，每個蠟塊切3張切片，65 ℃ 30 min烤片待用。每個蠟塊3張切片均分3組，第一組HE染色，第二組免疫組化標記DAB顯色，第三組免疫組化標記FR顯色。

1.2.2 免疫組化 使用羅氏BenchMark XT免疫組化全自動染色儀，一組采用ultra View Universal DAB Detection Kit，DAB染色液(主要試劑包含：3%過氧化氫液，通用HRP多聚體，DAB顯色劑，5 g/L硫酸銅液)；另一組采用ultra View Universal AP Red Detection Kit，AP染色液(主要試劑包含：通用AP多聚體，快紅A、快紅B顯色劑，11%氯化鎂液)。上述染色試劑盒均購自羅氏診斷產品(上海)公司；一抗包括Melan-A、HMB-45、CKpan、Ki-67均購至福州邁新公司。根據預先優(yōu)化好的程序，打印并貼好條形碼上機操作。染色程序結束后，少許稀釋洗潔精去除油膜，清水將切片清洗干凈。DAB顯色切片用無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。FR顯色切片不可使用乙醇類脫水劑脫水。用水性封片劑封固，也可用電吹風微風吹干或自然晾干，中性樹膠封固。

1.2.3 結果判斷 CKpan陽性顆粒定位于胞質、Ki-67陽性顆粒定位于胞核、Melan-A陽性顆粒定位于胞質、HMB-45陽性顆粒定位于胞質。第1組：HE染色，可見切片較多原含色素顆粒。第2組：免疫組化染色，采用DAB顯色，陽性顆粒顯示棕褐色。第3組：免疫組化染色，采用FR顯色，陽性顆粒顯示玫紅色。

2 結果

第1組：HE染色可見組織切片中原含色素量較多(圖1)，可作對照。第2組：采用ultra View Universal DAB Detection Kit染色系統(tǒng)(DAB染色液)，可見DAB顯色陽性顆粒為棕色，與組織中原含色素顏色接近，不易辨認(圖2)。第3組采用ultra View Universal AP Red Detection Kit(AP染色液)，F(xiàn)R顯色陽性顆粒為鮮艷的玫紅色，定位準確，背景清晰(圖3)，與標本中原所含的色素(黑色、褐色、棕色等)形成鮮明對比，很容易做出分辨，大大提高免疫組化陽性判讀準確率。

圖1 皮膚組織切片：HE染色可見較多明顯的黑色素顆粒圖2 皮膚組織切片：免疫組化標記Melan?A，DAB顯色陽性顆粒棕褐色與組織原有的色素顆粒顏色接近，較難辨認，ultraViewUniversalDABDetectionKit染色 圖3 皮膚組織切片：免疫組化標記Melan?A，F(xiàn)R(A+B)顯色陽性顆粒玫紅色，表達清晰。與組織原有的色素顆粒棕褐色，對比分明，辨識度高，利于判讀，ultra View Universal AP Red Detection Kit染色系統(tǒng)染色

3 討論

許多色素在常規(guī)HE切片上看上去相似而不易區(qū)分，通常需要采用各種特殊染色方法以確定色素性質[1]。常見含鐵血黃素、黑色素或其他色素(脂褐素、膽色素、甲醛色素、碳顆粒等)。色素含量較多時，常覆蓋在組織細胞上，遮蓋了組織細胞的結構與形態(tài)，特別在免疫組化標記判讀時造成一定的干擾。

傳統(tǒng)的一些方法中，較具代表性的是對含有黑色素的組織切片進行祛黑色素，再進行免疫組化染色。黑色素十分穩(wěn)定，完全不溶于水及有機溶劑，但長時間在強堿中則可被溶解，其可被強氧化劑如過氧化氫和高錳酸鉀等脫色質[2]。最常用的祛黑色素法是使用強氧化劑，如高錳酸鉀脫去黑色素，再用草酸褪去高錳酸鉀的顏色；郭以河等[3]報道改良方法。祛黑色素方法較費時，不易掌握使用程度。使用強氧化劑處理后的組織玻片，防脫片作用減弱許多，該方法最終的效果不佳，組織切片在免疫組化抗原修復及后續(xù)的過程中有不同程度的脫片現(xiàn)象。

在一定耐受空間內，組織抗原不會過多丟失，只是估計抗原丟失的可能，對其丟失程度無法量化。強氧化劑的過度處理對組織切片中的抗原、抗體均會產生一定程度影響，在免疫組化標記中較難得到滿意的效果。另外，組織所含色素顆粒種類較多，如遇到肺碳顆粒沉著色素，即使強氧化劑高錳酸鉀也無法褪去，也不易用其他方法處理褪去，這就需要有其他的方法來解決問題。

本文使用羅氏BenchMark XT全自動免疫組化染色儀，采用AP染色液，通過沉積紅色有色沉淀物使特異性抗原的位點顯色，有效避免了組織切片中原含色素的干擾，陽性顆粒表達為玫紅色，重現(xiàn)性強，結果穩(wěn)定。光鏡觀察，切片常溫可長期保存。根據需要選擇抗體，陽性顆粒顯示的色彩與標本組織中所含色素(黑色、褐色、棕色等)對比鮮明，不會互相干擾。結果觀察表明，DAB染色液換成AP染色液，F(xiàn)R顯色較DAB顯色結果，更能區(qū)別組織中原有的色素顆粒。方法無需進行復雜的祛黑色素步驟，也避免了抗原、抗體丟失或減弱等顧慮，免疫組化染色步驟及時間并未增加，免疫組化染色效果明顯更佳。

需要注意的是，F(xiàn)R顯色后組織切片需用水洗，接觸乙醇類脫水劑可使標記的紅色陽性顆粒褪去，令實驗失敗。可參考ultra View Universal DAB Detection Kit的修復、孵育時間等，且必須設置陰性、陽性對照，優(yōu)化好的程序可用在ultra View Universal AP Red Detection Kit。免疫組化標記的判讀，在光鏡下觀察，先確定陰性、陽性對照表達清晰易辨，定位正確，才可對檢測的組織切片進行判讀。對原含色素的組織，參考HE切片了解組織原含色素顆粒的定位及強弱，確定標記抗體陽性定位，客觀地對表達結果的正確性進行分析。對定位或顯色不正確的應重新進行染色。有時候細胞中堆積過量色素，會妨礙抗體與細胞中抗原的結合，造成假陰性或染色減弱，就是更換成FR顯色劑也解決不了這個問題時，脫色素具有必要性。

在病理工作中還會遇見其他色素，如肺碳顆粒沉著(黑色)、含鐵血黃素(黃棕色)等。近年來，我們在工作實踐中不斷的探索和嘗試，上述方法也可推廣應用到其它色素免疫組化染色中。正確規(guī)范化操作，注意質量控制，盡可能使實驗條件最優(yōu)化，得到滿意結果。將優(yōu)化程序相對固定下來，并在以后的染色中觀察變化，并不斷完善，細致的工作才能得到較滿意的實驗結果。

[1] 來茂德. 病理高級教程[M]. 北京: 人民軍醫(yī)出版社, 2013:691.

[2] 梁英杰, 凌啟波, 張 威. 臨床病理學技術[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2011:161-162.

[3] 郭以河, 張閩峰, 孟家榕, 等. 快速祛除組織中黑色素的改良方法[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2011,27(2):214.

時間：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1015.058.html

廈門大學附屬成功醫(yī)院病理科，廈門 361003

林 蓁，女，副主任技師。E-mail: xmlinzhen@139.com

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1001-7399(2017)02-0217-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.026

接受日期：2016-09-21