丁 倩，張 瑾，馬鈺泱，沈玉君，沈玉先，馮利杰

(安徽醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2.藥學(xué)院，3.生物藥物研究所，安徽 合肥 230001)

◇論 著◇

自噬降低異常磷酸化tau蛋白所致的神經(jīng)細胞毒性

丁 倩1,3，張 瑾2,3，馬鈺泱1,3，沈玉君1,3，沈玉先1,3，馮利杰1,3

(安徽醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2.藥學(xué)院，3.生物藥物研究所，安徽 合肥 230001)

目的 觀察雷帕霉素和饑餓誘導(dǎo)的自噬對表達異常磷酸化tau蛋白的神經(jīng)細胞形態(tài)、tau蛋白聚集和磷酸化tau降解的影響，探討這兩種經(jīng)典的誘導(dǎo)自噬方式抑制磷酸化tau的細胞毒性，發(fā)揮細胞保護作用的可能機制。方法 體外培養(yǎng)小鼠神經(jīng)瘤母細胞株N2a并轉(zhuǎn)染tau真核表達質(zhì)粒，蛋白磷酸酯酶抑制劑岡田酸(okadaic acid, OA)誘導(dǎo)tau蛋白異常磷酸化，雷帕霉素(rapamycin, Rapa)或Earle′s平衡鹽溶液(Earle′s balanced salts, EBSS)誘導(dǎo)細胞自噬，巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1, Baf A1)抑制自噬，DAB染色觀察表達tau細胞的形態(tài)變化；激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)tau聚集體；TUNEL染色和caspase-3活性檢測細胞凋亡；免疫印跡(immunoblot，IB)檢測磷酸化tau和細胞自噬水平。結(jié)果 過表達tau的細胞胞體變圓，突起減少；OA處理后細胞突起進一步減少甚至消失，胞質(zhì)出現(xiàn)明顯tau聚集體，凋亡細胞增加，剪切型caspase-3水平上調(diào)；Rapa和EBSS處理后的細胞形態(tài)均有一定程度改善，tau聚集體明顯減少，細胞凋亡減少，剪切型caspase-3表達降低；而自噬抑制劑Baf A1處理的細胞變圓，皺縮，胞質(zhì)大量tau聚集體，凋亡細胞明顯增加。IB結(jié)果顯示Rapa明顯降低高分子量的磷酸化tau，而EBSS能明顯減少低分子量磷酸化tau的水平。結(jié)論 Rapa和EBSS誘導(dǎo)的細胞自噬均能抑制磷酸化tau蛋白的細胞毒作用，但其發(fā)揮細胞保護作用的機制不同，Rapa誘導(dǎo)自噬傾向于降解磷酸化tau的寡聚體，而EBSS更易于降解低分子量的磷酸化tau蛋白。

tau；磷酸化；雷帕霉素；自噬；蛋白降解；細胞毒性

Tau蛋白是一種廣泛存在于神經(jīng)元內(nèi)的微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated proteins, MAPs)。正常腦中的tau蛋白能與微管蛋白單體結(jié)合并促進其聚合形成微管，對維持神經(jīng)元正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，軸漿運輸和突觸傳遞起著重要作用[1]。Tau蛋白為含磷蛋白質(zhì)，正常成熟腦中tau蛋白分子含2～3個磷酸基。在病理條件下，如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者腦內(nèi)tau蛋白過度磷酸化，每分子tau蛋白可含5～9個磷酸基。Tau蛋白異常磷酸化后構(gòu)象發(fā)生改變，喪失促進微管組裝和維持微管穩(wěn)定的功能，并自身聚集成成對螺旋絲(paired helical filaments, PHFs)，PHFs進一步聚集沉積形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元功能紊亂和神經(jīng)退行性病變[2]。 因此，減少神經(jīng)細胞內(nèi)異常磷酸化tau的聚集可能是降低tau細胞毒性和保護神經(jīng)元的有效策略之一。

自噬是廣泛存在于真核細胞內(nèi)的一種高度保守的降解途徑。在此過程中，胞內(nèi)損傷的或被標記的蛋白質(zhì)和細胞器被自噬體膜包裹后形成自噬體，接著自噬體與溶酶體膜融合并釋放底物到溶酶體中，最終在一系列水解酶的作用下將其降解[3]。近來研究發(fā)現(xiàn)在AD病人腦神經(jīng)元內(nèi)自噬體明顯增加[4]；自噬關(guān)鍵基因Atg5/Atg7 敲除的大鼠出現(xiàn)典型的神經(jīng)元退化[5-6]。體外實驗證實自噬抑制能減少tau 降解，促進tau聚集體形成[7-8]；以上實驗均證實自噬參與了異常磷酸化tau的降解。目前關(guān)于tau自噬降解的研究中，Earle′s平衡鹽溶液(Earle′s balanced salts, EBSS)和雷帕霉素(rapamycin，Rapa)是最常用的細胞自噬誘導(dǎo)劑，那么這兩種方式誘導(dǎo)的自噬對磷酸化tau細胞毒作用的影響是否一致，目前仍不清楚。因此，我們建立表達異常磷酸化tau的細胞模型，分別采用EBSS和Rapa誘導(dǎo)細胞自噬，觀察這兩種方式誘導(dǎo)的自噬對磷酸化tau蛋白降解的影響以及對神經(jīng)細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、試劑和抗體 pEGFP-C1-tau真核表達質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建[9]。自噬誘導(dǎo)劑Rapa購自Santa Cruz公司，自噬抑制劑巴佛洛霉素A1 (Bafilomycin A1, Baf A1)、蛋白磷酸酯酶抑制劑岡田酸(okadaic acid, OA)購自Sigma公司。DMEM 高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基和EBSS購自Gibco公司，小牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自康源生物技術(shù)有限公司，lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，PVDF膜購自Millipore公司，ECL化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑盒購自Pierce公司，TUNEL凋亡檢測試劑盒購于Roche公司，DAB 顯色試劑盒購自中杉金橋公司。tau-5單克隆抗體購于Biosourse公司，AT-8單克隆抗體購自Pierce公司，p62、LC3和α-tubulin多克隆抗體購自Sigma公司。剪切型caspase-3抗體購自Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 小鼠神經(jīng)瘤母細胞株N2a用含10%胎牛血清，100 mg·L-1鏈霉素和105U·L-1青霉素的DMEM培養(yǎng)液置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞用濃度為0.25%胰酶消化后，調(diào)整細胞密度為3～5×105個/孔，重新接種于6孔板中。細胞密度長至70%～80%匯合后，采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000按說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)6 h更換培養(yǎng)液。

1.2.2 DAB 染色 N2a細胞接種于24孔板，轉(zhuǎn)染tau表達質(zhì)粒24 h后加OA(10 nmol·L-1)處理12 h誘導(dǎo)tau過度磷酸化，Rapa(10 mg·L-1)、EBSS和Baf A1(100 nmol·L-1)分別處理6 h后去除培養(yǎng)液，4%多聚甲醛4 ℃固定20 min，PBS洗5 min×3次。0.1% Triton X-100室溫孵育15 min， PBS洗5 min×3次后再用3%的H2O2于37 ℃處理15 min。5% BSA常溫封閉30 min。加入一抗37 ℃孵育2 h，PBS洗5 min×3次。依次加入SP試劑盒中的B液(生物素標記二抗)和C液(辣根過氧化物酶標記液)，DAB顯色，鏡下觀察判斷，洗1～2次終止反應(yīng)。用80%甘油封片，鏡下觀察拍照。

1.2.3 共聚焦顯微鏡觀察tau聚集體形成 N2a細胞同上轉(zhuǎn)染、加藥處理，DAPI(5 mg·L-1) 孵育10 min襯染核，PBS洗5 min×3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察tau聚集體。

1.2.4 TUNEL染色 N2a細胞接種于24孔板后轉(zhuǎn)染帶His標簽的tau質(zhì)粒，加藥處理后，去除培養(yǎng)液，4%多聚甲醛4 ℃固定25 min，PBS洗 5 min×3次，再用PBS稀釋的0.1% Triton X-100室溫孵育15 min，PBS洗5 min×3次。加入TUNEL孵育緩沖液37 ℃避光孵育1 h，PBS洗5 min×3次，DAPI孵育10 min襯染核，PBS洗5 min×3次，熒光顯微鏡采集圖片。分別計數(shù)5張切片上5個不同視野中TUNEL陽性細胞和DAPI陽性細胞數(shù)的比例來判斷細胞凋亡情況。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡 N2a細胞同上轉(zhuǎn)染，加藥處理后，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗細胞后用含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液冰上裂解細胞30 min，100 ℃變性10 min。SDS-PAGE膠電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜。用含5%脫脂奶粉和0.05%吐溫20的PBS(PBST)封閉1 h后，加入適當稀釋度的一抗室溫孵育2 h，PBST洗10 min×3次，再加入適當稀釋度的二抗，室溫孵育1 h，PBST洗10 min×3次，ECL顯影。Image J軟件進行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 Rapa和EBSS誘導(dǎo)的自噬對表達異常磷酸化tau細胞形態(tài)的影響 為觀察兩種方式誘導(dǎo)的自噬對表達磷酸化tau細胞形態(tài)的影響，我們將GFP-tau質(zhì)粒轉(zhuǎn)染N2a細胞，OA(10 nmol·L-1)處理細胞12 h誘導(dǎo)tau異常磷酸化，分別用Rapa(10 mg·L-1)、EBSS和Baf A1(100 nmol·L-1)處理細胞6 h，IB檢測p62和LC3表達水平，DAB法檢測細胞形態(tài)和tau表達情況。IB結(jié)果顯示，EBSS和Rapa能增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例，降低p62水平，有效增加細胞自噬水平；而Baf A1明顯抑制LC3Ⅱ和p62的降解，抑制自噬(Fig 1B)。DAB結(jié)果顯示，少量表達tau的細胞形態(tài)基本正常(Fig 1A1)，而OA處理的細胞胞體變圓，突起減少甚至消失，胞質(zhì)內(nèi)tau表達增加(Fig 1A2)；Rapa處理組細胞形態(tài)有所改善，胞體基本正常，有少量突起，tau表達量明顯減少(Fig 1A3)；EBSS處理后細胞形態(tài)基本恢復(fù)正常，胞體飽滿，突起較多，tau表達量減少(Fig 1A4)；而自噬抑制劑Baf A1處理后細胞胞體變小，皺縮，突起消失，胞質(zhì)出現(xiàn)大量 tau聚集體(Fig 1A5)。同時我們對不同處理組的細胞進行細胞計數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨OA處理組相比，Rapa和EBSS處理對細胞數(shù)目沒有明顯影響，而Baf A1組細胞數(shù)量明顯減少(Fig 1C)。以上結(jié)果提示EBSS和Rapa均能改善表達磷酸化tau細胞的形態(tài)。

2.2 Rapa和EBSS誘導(dǎo)的自噬對細胞內(nèi)tau聚集體的影響 為了進一步觀察Rapa和EBSS對細胞內(nèi)tau聚集體的影響，我們同上轉(zhuǎn)染并處理細胞后，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)tau聚集情況。結(jié)果顯示，過表達tau細胞胞質(zhì)中tau蛋白多以彌散形式存在，可見少量tau聚集；而OA處理細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯tau聚集體；Rapa和EBSS能在一定程度上減少tau聚集，尤其是Rapa處理組細胞tau聚集明顯減少，tau多彌散分布在胞質(zhì)中；反之，Baf A1明顯增加tau聚集體(Fig 2)。提示Rapa和EBSS誘導(dǎo)的自噬能明顯減少神經(jīng)細胞中磷酸化tau聚集，其中Rapa作用更加明顯。

Fig 1 Effect of rapamycin (Rapa) and EBSS on cell morphology in hyperphosphorylated tau expressing cells

Fig 2 Effect of Rapa and EBSS on tau aggregation formation

N2a cells transfected with GFP-tau were incubated with or without OA for 12 h and then treated with DMSO, Rapa, EBSS, or Baf A1 for 6 h, tau aggregation was observed under confocal microscopy. Scale bar=20 μm

2.3 Rapa和EBSS誘導(dǎo)的自噬對表達磷酸化tau細胞凋亡的影響 為了觀察EBSS和Rapa對表達磷酸化tau細胞凋亡的影響，我們同上轉(zhuǎn)染并處理細胞，采用TUNEL染色觀察細胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染tau細胞中有少量TUNEL陽性細胞，OA處理后TUNEL陽性的凋亡細胞數(shù)增加；與單獨OA處理組相比，EBSS或Rapa明顯減少凋亡細胞數(shù)，而Baf A1抑制自噬后細胞凋亡明顯增加(Fig 3 A～B)。IB結(jié)果同樣顯示，與DMSO處理組相比，OA單獨處理的細胞中cleaved caspase-3水平增加，EBSS或Rapa處理能明顯降低cleaved caspase-3水平；反之，Baf A1能上調(diào)cleaved caspase-3表達(Fig 3C)，提示Rapa和EBSS誘導(dǎo)的自噬能明顯抑制磷酸化tau誘導(dǎo)的細胞凋亡。

2.4 Rapa和EBSS誘導(dǎo)的自噬對磷酸化tau水平的影響 為了進一步觀察Rapa和EBSS誘導(dǎo)的自噬對磷酸化tau水平的影響，我們同上處理細胞，采用AT-8抗體檢測Ser202/Thr205位點磷酸化的tau。同F(xiàn)ig 1B,EBSS和Rapa增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例，降低p62水平，有效增加細胞自噬水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rapa處理組中高分子量磷酸化tau明顯減少，而低分子量磷酸化tau水平相對增加；EBSS處理的細胞中低分子量磷酸化tau蛋白明顯減少，而高分子量磷酸化tau水平變化不明顯(Fig 4)。提示Rapa誘導(dǎo)的自噬主要降解高分子量磷酸化tau寡聚體，而EBSS主要促進低分子量的磷酸化tau降解。

Fig 3 Rapa and EBSS significantly reduced neuronal apoptosis in hyperphosphorylated tau expressing cells

3 討論

我們前期研究發(fā)現(xiàn)自噬參與過表達tau和異常磷酸化tau的降解，而對內(nèi)源性tau水平無明顯影響[10]，提示自噬主要參與病理狀態(tài)下tau蛋白降解。本研究中我們采用神經(jīng)細胞株N2a瞬時轉(zhuǎn)染GFP-tau質(zhì)粒，并用選擇性蛋白磷酸酯酶PP1和PP2A 抑制劑OA來誘導(dǎo)tau蛋白異常磷酸化，模擬AD病人腦中PP2A活性下降導(dǎo)致tau異常磷酸化的病理狀態(tài)[11]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EBSS和Rapa誘導(dǎo)的自噬均能改善異常磷酸化tau導(dǎo)致的細胞形態(tài)異常，減少細胞凋亡，提示EBSS和Rapa誘導(dǎo)的自噬對表達異常磷酸化tau的細胞均有保護作用。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，與EBSS相比，Rapa處理的細胞中tau聚集體減少更加明顯；IB結(jié)果證實Rapa能明顯降低高分子量的磷酸化tau，即tau寡聚體水平，而EBSS對低分子量磷酸化tau降解作用比較明顯；提示這兩種自噬誘導(dǎo)方式可能參與了不同毒性形式tau蛋白的降解過程。

Fig 4 Effect of Rapa and EBSS on phosphorylated tau levels in N2a cells

目前關(guān)于異常磷酸化tau與神經(jīng)元退化之間關(guān)系的研究很多，但對于tau的毒性形式還存在爭議。過去研究普遍認為，NFTs與神經(jīng)元退化有關(guān)。但目前研究發(fā)現(xiàn)，tau的不溶性聚集體的形成可能不是導(dǎo)致tau病理的原發(fā)機制，而可溶性的tau中間體在神經(jīng)元變性中起著更重要的作用[12-13]。在本研究中，我們同樣發(fā)現(xiàn)，EBSS主要降解低分子量磷酸化tau，Rapa更傾向降解高分子量的磷酸化tau寡聚體，但EBSS對磷酸化tau細胞毒性的抑制作用比Rapa更加明顯。這也從另一個角度提示低分子量可溶性tau可能具有更強的細胞毒作用。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyin，mTOR)是雷帕霉素在哺乳動物細胞內(nèi)的靶點。mTOR作為自噬啟動階段關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，抑制其活性可正向調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生。細胞內(nèi)的mTOR存在兩種不同的復(fù)合體：對雷帕霉素敏感的mTORC1和對雷帕霉素不敏感的mTORC2。前者主要調(diào)節(jié)細胞生長、能量代謝和自噬，后者主要通過活化PKB/Akt激活自噬通路來調(diào)控細胞骨架和細胞存活[14-15]。近年國內(nèi)外研究顯示mTOR信號通路與AD密切相關(guān)。已有研究報道Rapa能作用于mTOR，抑制mTORC1，誘導(dǎo)自噬發(fā)生，促進神經(jīng)細胞存活[16]。這也部分解釋了Rapa降低異常磷酸化tau細胞毒性的作用機制。細胞對氨基酸的攝入水平主要通過RagA家族成員GTPases和Ste家族蛋白MAP4K3來影響mTORC1活性，在營養(yǎng)充足時抑制自噬；在營養(yǎng)匱乏時自噬得以激活[17]。因此在本研究中，EBSS模擬氨基酸饑餓能通過影響mTORC1活性上調(diào)自噬，促進磷酸化tau降解，從而發(fā)揮細胞保護作用。Rapa和EBSS雖然都能通過抑制mTOR通路誘導(dǎo)自噬，但具體機制上可能還存在著差異。Rapa除了能直接抑制mTORC1，激活自噬外，還可能通過激活mTORC2，抑制Akt磷酸化，而后者能促進tau異常磷酸化[18]，因此Rapa除了增加tau聚集體降解外，還可能抑制tau過度磷酸化。這也部分解釋了Rapa處理細胞中磷酸化tau寡聚體明顯減少。 綜上所述，Rapa和EBSS誘導(dǎo)的自噬均能不同程度的抑制異常磷酸化tau的細胞毒作用，減少細胞凋亡，促進磷酸化tau蛋白降解。但Rapa誘導(dǎo)的自噬明顯減少磷酸化tau寡聚體，而饑餓誘導(dǎo)的自噬更傾向于降解低分子量的磷酸化tau，但這兩種自噬誘導(dǎo)方式對不同形式tau蛋白的降解機制還有待于進一步研究。

(致謝:本文實驗內(nèi)容在安徽醫(yī)科大學(xué)科教大樓生物藥物研究所完成，感謝實驗室同學(xué)老師的關(guān)心與幫助。)

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Autophagy alleviates neuronal toxicity induced by abnormally phosphorylated tau protein

DING Qian1,3, ZHANG Jin2,3, MA Yu-yang1,3, SHEN Yu-jun3, SHEN Yu-xian3, FENG Li-jie1,3

(1.SchoolofBasicMedicalSciences,2.SchoolofPharmacy,3.InstituteofBiopharmaceuticalResearch,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

Aim To observe the effects of rapamycin (Rapa) and starvation-induced autophagy on the morphology of neuronal cells, tau protein aggregation and expression of phosphorylated tau protein, to explore the possible mechanism of cytoprotective effect of these two classical autophagy inducers on phosphorylated tau expressing cells.Methods N2a cells were transfected with GFP-tau plasmid, and equal amount of empty vector was used as control. Then cells were incubated with or without okadaic acid(OA) for 12 h, followed by treatment with autophagy inducers rapamycin(Rapa) and EBSS, autophagy inhibitor Bafilomycin A1(Baf A1) for 6 h. DAB was used to observe tau expression and cell morphology. Confocal microscopy was used to observe the intracellular tau aggregation. TUNEL assay and cleaved caspase-3 level were used to detect cell apoptosis. Immunoblot was used to detect the expression of phosphorylated tau and autophagy-related proteins.Results Our study showed that the N2a cells treated with OA exhibited small cell body, retracted processes and increased tau aggregation, compared with only tau-expressing cells.Rapa and EBSS treatment significantly improved cell morphology, decreased tau aggregation and reduced cell apoptosis. On the contrary, Baf A1 treatment induced aberrant cell shape and increased tau aggregation and cell apoptosis. In addition, Rapa significantly decreased the high molecular weight, phosphorylated tau whereas EBSS especially decreased the low molecular weight phosphorylated tau.Conclusions Rapa and EBSS is alleviate hyperphosphorylated tau-induced cytotoxicity through different mechanism. Rapamycin mainly decreases phosphorylated tau oligomers, while EBSS liable to decrease the soluble phosphorylated tau.

tau;phosphorylation; rapamycin; autophagy; protein degradation; cytotoxicity

時間：2017-5-25 17:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.012.html

2017-01-13,

2017-02-10

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81302755)

丁 倩(1989-)，女，碩士生，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail：18356029206@163.com； 馮利杰(1980-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: fenglijie1128@sina.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.006

A

1001-1978(2017)06-0761-07

R329.24; R341; R745.7;R977.6