馬艷，宋娜，牛建一，丁剛

(1 濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261042；2 聊城市人民醫(yī)院；3 濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院)

原發(fā)性PD患者SMPD1基因3、4號(hào)外顯子突變及其臨床意義

馬艷1，宋娜2，牛建一3，丁剛3

(1 濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261042；2 聊城市人民醫(yī)院；3 濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院)

目的 探討SMPD1基因3、4號(hào)外顯子突變與原發(fā)性帕金森病(PD)的關(guān)系。方法 選擇臨床確診的原發(fā)性PD患者103例(PD組)、體檢健康者103例(對(duì)照組)，按照SMPD1基因序列和相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，采用PCR技術(shù)對(duì)SMPD1基因3、4號(hào)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)序和突變分析。結(jié)果 經(jīng)對(duì)測(cè)序結(jié)果序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，兩組SMPD1基因存在p.A402T位點(diǎn)突變，均為雜合突變，即基因型為GA型。其中，PD組SMPD1基因p.A402T位點(diǎn)突變概率為11.65%(12/103)，對(duì)照組為0.97%(1/103)，兩組比較P<0.01。生物信息學(xué)分析顯示，該突變導(dǎo)致其編碼的溶酶體酶SMase穩(wěn)定性降低。Mutation Taster和PolyPhen2軟件檢測(cè)結(jié)果顯示，SMPD1基因存在p.A402T位點(diǎn)致病性突變。結(jié)論 原發(fā)性PD患者SMPD1基因存在p.A402T位點(diǎn)突變，該位點(diǎn)突變可能增加PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

帕金森病；SMPD1基因；p.A402T突變

帕金森病(PD)又稱震顫性麻痹，是一種僅次于阿爾茨海默病的常見(jiàn)神經(jīng)退行性疾病，多見(jiàn)于60歲以上老年人。其臨床癥狀主要表現(xiàn)為靜止性震顫、行動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)不穩(wěn)[1]?，F(xiàn)已證實(shí)，原發(fā)性PD(本研究以下稱PD)的發(fā)病與某些基因突變有關(guān)。在德系猶太人群中LRRK2、GBA初始突變與PD的發(fā)病關(guān)系密切，而LRRK2基因p.G2019S和GBA初始突變的概率分別為15%、20%[2，3]。SMPD1基因突變最早報(bào)道能夠引起一種常染色體隱性遺傳性溶酶體貯積病——尼曼匹克病。最近研究發(fā)現(xiàn)，SMPD1基因突變可引起溶酶體功能喪失，導(dǎo)致體內(nèi)的α突觸核蛋白聚合和路易小體沉積，從而導(dǎo)致PD[4，5]。在猶太人群中，PD的發(fā)病與SMPD1基因p.L302P[4]、c.996delC(fsP330)[6]位點(diǎn)突變有關(guān)，特別是p.L302P位點(diǎn)，但在中國(guó)人群中并未發(fā)現(xiàn)p.L302P位點(diǎn)突變[5,7]；另有研究發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)人群中SMPD1基因p.R591C位點(diǎn)突變和Leu-Ala(Val)重復(fù)變異與PD的發(fā)病有關(guān)[8,9]。以上研究提示，PD可能在不同區(qū)域、不同種族中具有遺傳異質(zhì)性。本研究分析103例PD患者SMPD1基因3、4號(hào)外顯子突變情況，旨在為進(jìn)一步尋找中國(guó)PD患者SMPD1基因外顯子上可能的致病突變位點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年6月～2016年6月聊城市人民醫(yī)院和益都中心醫(yī)院收治的PD患者103例(PD組)，其中，男67例、女36例，發(fā)病年齡50～78歲(66.5±11.39)歲。PD均為散發(fā)；其診斷符合英國(guó)BrainBank標(biāo)準(zhǔn)[10]：運(yùn)動(dòng)遲緩且至少具備肌強(qiáng)直、靜止性震顫或姿勢(shì)平衡障礙(并非由于原發(fā)的視覺(jué)、前庭、小腦或本體感覺(jué)造成)中的一項(xiàng)。排除繼發(fā)性PD、帕金森疊加綜合征和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病，甲亢及其他遺傳性疾病。同期另選與PD組性別、年齡匹配的體檢健康者103例(對(duì)照組)，男67例、女36例，年齡(65.4±12.1)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 SMPD1基因3、4號(hào)外顯子測(cè)序及突變分析

1.2.1 DNA提取 收集所有研究對(duì)象肘正中靜脈血5 mL，置于含EDTA的抗凝管中，混勻，置于-80 ℃冰箱保存。采用血液基因組DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA，然后將提取的DNA溶于50～100 μL無(wú)菌ddH2O中。NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度和濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 查詢文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)SMPD1基因3、4號(hào)外顯子擴(kuò)增引物，并根據(jù)SMPD1基因序列(GenBank NC 000011.10)進(jìn)行修正，兩個(gè)外顯子通用一個(gè)引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物：5′-ACTGTGAGCTCCTTGCAGGT-3′，下游引物：5′-TGCTCAAGGGAATTTTCAGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度667 bp。PCR反應(yīng)體系共25 μL：Taq DNA聚合酶1 μL，DNA模板(50～100 ng/μL)1 μL，上下游引物各0.5 μL，10×PCR緩沖液(含有MgCl2)2.5 μL和2.5 mmol/L dNTP 1 μL，無(wú)菌ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃充分延伸5 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物基因測(cè)序 取PCR產(chǎn)物5 μL+6×Loading Dye 1 μL混勻，行1%瓊脂糖凝膠電泳，D100Marker作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。紫外分光光度計(jì)確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量，將質(zhì)量符合要求(條帶大小正確，無(wú)雜帶)的未純化PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行基因突變測(cè)序。

1.2.4 基因序列比對(duì) 采用NCBI網(wǎng)站提供的Blast軟件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果判別基因有無(wú)突變。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 采用SIFT(Scale Invariant Feature Transform，http://sift.jcvi.org/)、I-Mutant2.0(http://folding.biofold.org/i-mutant/i-mutant2.0.html)和MUpro(http://mupro.proteomics.ics.uci.edu/)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，檢驗(yàn)SMPD1基因上新的突變點(diǎn)對(duì)其編碼的溶酶體酶SMase穩(wěn)定性的影響。使用Mutation Taster(http://www.mutationtaster.org/)和PolyPhen2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)檢測(cè)突變點(diǎn)的致病性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件?；蝾l率和基因型分析采用基因計(jì)數(shù)法，計(jì)數(shù)資料以比例和率(%)表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶呈單一明亮條帶且清晰無(wú)雜質(zhì)，目的條帶大小為667 bp。見(jiàn)插頁(yè)Ⅳ圖6。

2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序突變分析 基因庫(kù)中SMPD1基因p.A402T位點(diǎn)共有3種基因型：GG(野生純合子)、GA(雜合子突變)、AA(純合子突變)。經(jīng)對(duì)測(cè)序結(jié)果序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，兩組SMPD1基因存在p.A402T位點(diǎn)突變，均為雜合突變，即基因型為GA型。見(jiàn)插頁(yè)Ⅳ圖7。其中PD組SMPD1基因p.A402T位點(diǎn)突變概率為11.65%(12/103)，對(duì)照組為0.97%(1/103)，兩組比較P<0.01。

2.3 生物信息學(xué)分析 SMPD1基因p.A402T突變很可能編碼的溶酶體酶SMase穩(wěn)定性降低(在I-Mutant2.0軟件和MUpro軟件上完成)，影響蛋白質(zhì)的功能(在SIFT軟件上完成)。Mutation Taster軟件檢測(cè)結(jié)果顯示，SMPD1基因p.A402T存在致病突變位點(diǎn)；PolyPhen2軟件檢測(cè)結(jié)果顯示，HumDiv為0.999，HumVar為0.939。見(jiàn)插頁(yè)Ⅳ圖8、表1。

表1 SMPD1基因突變的軟件預(yù)測(cè)情況

注：SIFT得分<0.05為有害突變；PolyPhen2得分越接近1，突變致病性越高。

3 討論

PD是一種以運(yùn)動(dòng)障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其主要病理學(xué)特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性和脫失，以及細(xì)胞內(nèi)以泛素和α-突觸核蛋白為主要成分的路易小體的形成。迄今為止，PD的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，越來(lái)越多的研究認(rèn)為，遺傳因素在其發(fā)病中具有重要作用。據(jù)GWAS報(bào)道，很多易感基因或候選基因可導(dǎo)致PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高[12,13]，這些易感基因或候選基因通過(guò)不同路徑損害細(xì)胞的新陳代謝。在PD發(fā)病機(jī)制中，細(xì)胞的溶酶體自我吞噬通路(ALP)即是其中的一種重要途徑[14]。多巴胺能神經(jīng)元胞質(zhì)中異常蛋白質(zhì)的積累可能是由于正常ALP通路功能紊亂引起，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和PD的臨床表現(xiàn)。GBA和SMPD1編碼的溶酶體酶在維持ALP通路的正常功能方面具有重要作用[14,15]。有研究已發(fā)現(xiàn)，SMPD1基因p.L302P位點(diǎn)突變使PD的發(fā)生率提高了9倍[4]，此為ALP通路在PD發(fā)病機(jī)制中的作用提供了額外證據(jù)。

SMPD1基因位于11p15.1～p15.4，全長(zhǎng)共4 685 bp，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。其編碼產(chǎn)物是由629個(gè)氨基酸組成的鞘磷脂酸性二酯酶1(SMase)，其是一種溶酶體酶，可裂解鞘磷脂膽堿磷酸頭基，由此生成的神經(jīng)酰胺在壓力條件下作為第二信使啟動(dòng)凋亡反應(yīng)。溶酶體是降解α突觸核蛋白的主要的細(xì)胞器[16]，PD的病理特點(diǎn)是蛋白質(zhì)(以α突觸核蛋白為主)聚集形成路易小體[17]。SMPD1與GBA均是溶酶體基因，GBA和SMPD1基因編碼的溶酶體分解酶GCase和SMase是否以類似的方式參與PD的發(fā)病機(jī)制尚無(wú)定論。有研究發(fā)現(xiàn)，他們有一個(gè)共同特點(diǎn)，即酶法分解的最終產(chǎn)物均是神經(jīng)酰胺。神經(jīng)酰胺代謝途徑缺失能改變?nèi)苊阁w酶的性能和功能，從而導(dǎo)致α突觸核蛋白的積累和路易小體的形成，繼而導(dǎo)致PD發(fā)病。PANK2和PLA2G6基因參與神經(jīng)酰胺引起的神經(jīng)退行性疾病(PANK2和PLA2G6分別引起1型和2型大腦鐵沉積性神經(jīng)退行性變)，其中也有路易小體的形成[16]，進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)論。

近年研究發(fā)現(xiàn)，GBA突變可引起葡萄糖神經(jīng)酰胺的聚集，從而阻止α突觸核蛋白的降解，集聚的α突觸核蛋白可促進(jìn)其低聚物形成和神經(jīng)毒性作用[17,18]；α突觸核蛋白積累可阻礙GCase從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)一步損害溶酶體GCase的活性，從而增加路易小體的形成。因此，GCase活性的喪失創(chuàng)建了一個(gè)溶酶體功能減弱和α突觸核蛋白積累的正反饋回路，最終導(dǎo)致神經(jīng)退化。與GCase缺乏類似，SMase缺乏與α突觸核蛋白相互作用從而促進(jìn)神經(jīng)毒性，繼而導(dǎo)致PD的發(fā)展。

本研究在SMPD1基因上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的突變點(diǎn)p.A402T，即該基因402號(hào)位點(diǎn)上的丙氨酸被蘇氨酸取代，從而改變了其編碼的蛋白質(zhì)酶作用和活性。SIFT系統(tǒng)表明，該突變能夠改變蛋白質(zhì)的功能，I-Mutant2.0軟件和MUpro軟件對(duì)SMPD1基因p.A402T突變的評(píng)估亦支持上述結(jié)論。表明SMPD1基因p.A402T位點(diǎn)突變能夠降低SMase的穩(wěn)定性，該位點(diǎn)突變具有致病性。此外，本研究在PD患者中發(fā)現(xiàn)在尼曼匹克病中未出現(xiàn)過(guò)的p.A402T突變，這可能與篩選的中國(guó)尼曼匹克病病例數(shù)量有限有關(guān)。SMPD1突變引起的PD并不伴有獨(dú)特的PD臨床特點(diǎn)，其臨床表現(xiàn)與GBA以及其他基因突變攜帶者表現(xiàn)相似。目前無(wú)法估計(jì)SMPD1基因突變?cè)谌澜鏟D發(fā)病機(jī)制中的作用，但這個(gè)發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步了解PD潛在的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

綜上所述，PD患者SMPD1基因存在p.A402T位點(diǎn)突變，該位點(diǎn)突變可能增加PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。今后我們將加大樣本對(duì)SMPD1基因進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)p.A402T位點(diǎn)進(jìn)一步研究，為PD發(fā)病機(jī)制和治療提供新的線索和潛在的藥物作用靶點(diǎn)。

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