枯草芽孢桿菌Bs—15對柿樹炭疽病的離體防治效果

余賢美+侯長明+王潔+張坤鵬+艾呈祥

摘要：為探討枯草芽孢桿菌Bs-15對柿樹炭疽病的防治潛能，通過平板對峙試驗研究Bs-15對柿樹炭疽病菌的抑制作用，并通過離體接種試驗，研究Bs-15對柿樹炭疽病的防治效果。結(jié)果顯示，在對峙平板中形成穩(wěn)定而明顯的抑菌帶，寬為（0.56±0.05）cm；離體接種試驗中，先接種Bs-15菌懸液后接種菌餅處理比先接種菌餅再接種Bs-15菌懸液處理對柿樹炭疽病的防治效果好，其抑制率分別為54.76%和47.62%，防治效果分別為78.54%和70.04%，說明枯草芽孢桿菌Bs-15可能通過產(chǎn)生誘導抗性提高防效。本試驗結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌Bs-15對柿樹炭疽病有較好的防治效果，可作為潛在的生防菌株，為柿樹炭疽病的防治提供新的途徑和方法。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；柿樹炭疽病；哈銳炭疽菌；平板對峙試驗；離體接種試驗

中圖分類號：S436.65 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2017）07-0125-03

Abstract To investigate the control potential of Bacillus subtilis Bs-15 on persimmon anthracnose， the inhibition of Bs-15 to Colletotrichum horri was studied via dual-culture test， and the control effect of Bs-15 on persimmon anthracnose was studied via in vitro inoculation experiment. The results showed that the inhibition zone in dual-cultured plate was （0.56±0.05）cm. The in vitro inoculation experiment showed that the control effect of spraying the bacterium suspension of Bs-15 before inoculating the pathogenic disk was better than that of spraying the bacterium suspension of Bs-15 after inoculating the pathogenic disk with the inhibition ratio of 54.76% and 47.62% and the control efficiency of 78.54% and 70.04%， respectively. It indicated that Bs-15 might have better control efficiency by producing the induced resistance. The results indicated that because of good effect on persimmon anthracnose， Bs-15 could be used as a potential biocontrol bacterial strain and provide a new path and method for control of persimmon anthracnose.

Keywords Bacillus subtilis； Persimmon anthracnose； Colletotrichum horri； Dual-culture test； In vitro inoculation experiment

柿樹炭疽病是危害柿樹的一種毀滅性病害，嚴重時可造成巨大的經(jīng)濟損失，已成為阻礙柿樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[1，2]。對于柿樹炭疽病的防治，在加強栽培管理措施的基礎上，仍以化學防治為主要手段，而多年連續(xù)使用，已使病原菌產(chǎn)生抗藥性，同時還造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題，甚至危害人類健康[3-5]。

生物防治是一種環(huán)境友好型的防治方法，具有廣泛的應用價值，已成為病害防治的熱點。芽孢桿菌是目前生防細菌中被研究較多的一類，尤其是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）?？莶菅挎邨U菌是一類重要的生防菌，對多種植物病原真菌具有抑制作用，對茄子立枯病、甜椒枯萎病、大豆根腐病、橡膠炭疽病、桑椹腐爛病、棉花黃萎病、玉米紋枯病、梨褐腐病、水稻稻瘟病、葡萄霜霉病等病害，均具有較好的防治效果[6-10]，說明枯草芽孢桿菌在生物防治方面具有廣泛的應用前景。本課題組分離鑒定的枯草芽孢桿菌Bs-15對甜椒枯萎病菌的抑制率達93.15%，防效達56.94%[11，12]，在生物防治方面具有一定潛能。

本課題通過室內(nèi)平板對峙試驗和離體接種試驗，研究枯草芽孢桿菌Bs-15對柿樹炭疽病菌的抑制作用和對柿樹炭疽病的防治效果，以探討該菌株在柿樹炭疽病防治方面的應用潛能，為柿樹炭疽病的防治提供可行的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌Bs-15為本課題組分離保存；柿樹炭疽病菌哈銳炭疽菌Colletotrichum horri分離自山東省果樹研究所萬吉山試驗基地柿子園三年生牛心柿樹[13]；離體接種所用柿樹葉片采自山東省果樹研究所萬吉山試驗基地柿子園三年生健康牛心柿樹。

1.2 平板對峙試驗

1.2.1 接種菌液的制備 將Bs-15接種到LB液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)過夜，備用。

1.2.2 菌餅的制備 將柿樹炭疽病菌接種于PDA培養(yǎng)基平板中，28℃恒溫培養(yǎng)5天，用打孔器從菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅，備用。

1.2.3 室內(nèi)平板對峙試驗 按5點接種法進行接種。將病原菌菌餅接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，在菌餅四周用接種針對稱等距離點接Bs-15菌液，重復3次。于28℃條件下培養(yǎng)7～10天，觀察兩種菌的生長情況及抑菌帶，待形成穩(wěn)定的抑菌帶后測量其寬度并求平均值。

1.3 室內(nèi)離體接種試驗

1.3.1 菌懸液的制備 將Bs-15接種到LB液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)過夜，用10 mmol/L無菌硫酸鎂溶液制備成菌懸液，使菌體數(shù)約為106～107 cfu/mL。

1.3.2 菌餅的制備 離體接種所需菌餅的制備，同1.2.2。

1.3.3 離體接種 取柿子葉片，用無菌大頭針刺傷形成傷口，采用以下2種方式進行接種：①先噴Bs-15菌懸液，兩天后再于傷口處接種柿樹炭疽病菌菌餅；②于傷口處先接種柿樹炭疽病菌菌餅，兩天后再噴Bs-15菌懸液。每處理接種30片葉片，以接種菌餅+噴無菌硫酸鎂溶液為對照，重復3次。于28℃條件下保濕培養(yǎng)，觀察病斑的形成，于第7天統(tǒng)計發(fā)病率。按照鄧維萍等[14]的方法測定病斑面積S，不發(fā)病記為0級（-）；1級（+）：S≤1 cm2；2級（++）：1 cm24 cm2，并統(tǒng)計各處理不同病級的葉片數(shù)。

根據(jù)以下公式計算抑制率、病情指數(shù)及防治效果。

抑制率（%）=（對照發(fā)病率-處理發(fā)病率）/對照發(fā)病率×100 ；

病情指數(shù)=Σ（各級病葉數(shù)×相應病級）/（葉片總數(shù)×最高病級）×100 ；

防治效果（%）=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100 。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bs-15對柿樹炭疽病菌的拮抗作用

接種平板，于28℃條件下培養(yǎng)7天后，形成了穩(wěn)定而明顯的抑菌帶，帶寬為（0.56±0.05）cm（圖1）。說明枯草芽孢桿菌Bs-15對柿樹炭疽病菌有較強的拮抗作用。

2.2 Bs-15對柿樹炭疽病的離體防效

表1可見，對照發(fā)病葉片的病級主要集中在3級，其次是2級，部分葉片病級為4級和5級；2個處理發(fā)病葉片的病級主要集中在1級，其次是2級，無4級和5級病葉。表2可見，Bs-15極顯著降低了柿樹炭疽病的發(fā)病率和病情指數(shù)；菌懸液噴施時間對防治效果有顯著影響，先噴施Bs-15菌懸液再接種炭疽病菌菌餅的效果明顯高于先接種炭疽病菌菌餅再噴施Bs-15菌懸液，前者抑制率為54.76%，防治效果為78.54%，后者抑制率為47.62%，防治效果為70.04%。

3 討論與結(jié)論

為探討枯草芽孢桿菌Bs-15對柿樹炭疽病的防治效果，本課題通過室內(nèi)平板對峙試驗研究了枯草芽孢桿菌Bs-15對柿樹炭疽病菌的拮抗作用，結(jié)果顯示，Bs-15對柿樹炭疽病菌具有較好的拮抗作用，在對峙平板上形成了穩(wěn)定而明顯的抑菌帶，帶寬為（0.56±0.05）cm。然后通過離體接種試驗研究了Bs-15對柿樹炭疽病的防效，發(fā)現(xiàn)對照發(fā)病葉片的病級主要集中在3、2級，而接種處理發(fā)病葉片主要集中在1、2級，該結(jié)果與筆者之前的接種結(jié)果[13]相一致；菌株Bs-15顯著降低了柿樹炭疽病的發(fā)病率和病情指數(shù)，而且菌懸液的噴施時間對防治效果有顯著影響，先噴菌懸液再接菌餅效果明顯高于先接菌餅再噴菌懸液，說明，Bs-15有可能通過產(chǎn)生誘導抗性提高防治效果[15]。但是，由于本試驗采用室內(nèi)離體接種的方法進行，其環(huán)境相對穩(wěn)定，影響因子單一，防治效果相對較高，而對于在環(huán)境相對復雜的盆栽試驗或田間試驗，該菌株對柿樹炭疽病的防治效果有待于進一步研究。

參 考 文 獻：

[1]張敬澤， 徐同， 何黎平. 浙江無核柿炭疽病病菌鑒定及附著胞形成過程中的核相變化[J]. 菌物學報， 2005， 24（1）： 116-122.

[2]Zhang J Z. Anthracnose of persimmon caused by Colletotrichum gloeosporioides in China， Asian and Australasian [J]. Journal of Plant Science and Biotechnology， 2008， 2（2）： 50-54.

[3]華永剛， 姜禮元， 林福平， 等. 柿炭疽菌的室內(nèi)藥效試驗[J]. 中國森林病蟲， 2001， 20（6）： 11-13.

[4]曲健祿， 武海斌， 范昆， 等. 柿樹炭疽病菌的生物學特性及幾種殺菌劑對其的抑制作用[J]. 農(nóng)藥學學報， 2012， 14（5）： 503-509

[5]郗慧. 我國柿樹炭疽病調(diào)查、鑒定及其防治研究[D]. 洛陽：河南科技大學， 2015.

[6]Abeysinghe S. Effect of combined use of Bacillus subtilis CA32 and Trichoderma harzianum RU01 on biological control of Rhizoctonia solani on Solanum melongena and Capsicum annuum[J]. Plant Pathology Journal， 2009， 8： 9-16.

[7]陳成， 方銀， 金超， 等. 枯草芽孢桿菌對桑椹采后致腐微生物的抑菌作用[J]. 蠶業(yè)科學， 2016， 42（1）： 118-123.

[8]趙璐璐， 賀春萍， 鄭肖蘭， 等. 枯草芽孢桿菌Czk1 菌株對橡膠樹根病菌的抑制作用及對炭疽病生防效果研究初報[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報， 2011， 42（7）： 740-743.

[9]婁善偉， 張鵬忠， 王大光， 等. 枯草芽孢桿菌種子包衣對棉花黃萎病抑制作用的研究[J]. 中國棉花， 2016， 43（6）： 28-30.

[10]王丹， 姚曉東， 郝曉娟， 等. 枯草芽孢桿菌D-29對采后梨褐腐病的抑制效果研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版）， 2016， 36（3）： 182-185.

[11]余賢美， 鄭服叢， 林超， 等. 土壤產(chǎn)嗜鐵素拮抗細菌CAS15的分離鑒定[J]. 植物保護學報， 2009， 36（2）： 129-135.

[12]余賢美， 周廣芳， 辛力. 枯草芽孢桿菌Bs-15產(chǎn)嗜鐵素條件及其對甜椒的防病促生效應[J]. 農(nóng)藥學學報， 2010， 12（2）： 135-141.

[13]余賢美， 侯長明， 王潔， 等. 山東牛心柿炭疽病菌的分離鑒定及致病性[J]. 林業(yè)科學， 2015， 51（4）： 126-133.

[14]鄧維萍， 楊敏， 杜飛， 等. 云南葡萄產(chǎn)區(qū)葡萄炭疽病病原鑒定及致病力分析[J]. 植物保護學報， 2013， 40（1）：61-67.

[15]唐文， 梁艷瓊， 許沛冬， 等. 枯草芽孢桿菌Czk1誘導橡膠樹抗病性相關(guān)防御酶系研究[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報， 2016， 47（4）： 576-582.