牛樟芝se原核表達載體構建及重組蛋白的表達、純化

李晶　李芳娜　林雄杰

摘要：鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SE）是多數(shù)中草藥植物、藥用菌中三萜合成途徑中的限速酶，能影響三萜含量的積累。構建了牛樟芝鯊烯環(huán)氧酶基因（se）原核表達載體，并進行其重組蛋白誘導表達條件優(yōu)化。以牛樟芝cDNA為模板擴增se，純化后將其克隆到pMD18-T載體上，篩選陽性克隆并將其連接到原核表達載體pET28a，構建重組質(zhì)粒pET-28a-se，經(jīng)酶切驗證后轉(zhuǎn)化Ecoil BL21（DE3）感受態(tài)細胞進行誘導表達，利用L9（34）[JP2]正交試驗優(yōu)化目的蛋白誘導表達條件及純化。結果表明，不同正交處理間的蛋白表達差異顯著（P<005），其誘導因素的主次為時間>溫度>IPTG濃度，誘導時間對重組蛋白表達影響最顯著（P<005）。而IPTG濃度和溫度對重組蛋白表達影響并不顯著（P>005），且當IPTG終濃度為02 mmol/L，誘導時間為7 h，誘導溫度為26 ℃時，對SE重組蛋白的誘導效果最佳。

關鍵詞：牛樟芝；鯊烯環(huán)氧酶；原核表達；正交設計

中圖分類號： S5673+901文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0050-04

收稿日期：2016-04-10

基金項目：福建農(nóng)林大學發(fā)展研究基金（編號：KF2015111）；福建省2011計劃（編號：K80ND8002）。

作者簡介：李晶（1985—），女，湖北武漢人，博士，助理研究員，主要從事食用菌研究。E-mail：13959197195@163com。

通信作者：林占熺，研究員，主要從事菌草技術推廣研究。E-mail：lzxjuncao@163com。

三萜是多數(shù)食藥用菌和藥用植物中重要的活性物質(zhì)之一，研究表明三萜具有保肝、抗炎癥、抗過敏和抗腫瘤等功效，因此具有顯著的經(jīng)濟效益。鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SE）是三萜合成途徑中的一種重要調(diào)控酶，它位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微粒體中，催化鯊烯（squalene，SQ）合成2，3-氧化鯊烯（2，3-oxidosqualene），可進一步合成三萜、甾醇、膽固醇等重要萜類物質(zhì)[2-3]。同時，SE也催化氧原子插入到C-C雙鍵在P450類型反應中形成環(huán)氧結構的重要酶[4]。目前，已在人類、動物、植物和真菌中克隆到鯊烯環(huán)氧酶基因（se），王森等對中草藥五味子se的研究表明其mRNA的表達量與三萜的生成量呈正相關[5]；Han等在人參根中克隆se后利用RNAi技術抑制其表達后三萜的產(chǎn)量顯著下降，因此SE被認為是三萜生物合成中限速酶；人參SE蛋白的表達證實了其與人參皂苷含量相關。

牛樟芝（Antrodia cinnamomea），別稱樟芝、牛樟菇、樟生薄孔菌，是20世紀90年代發(fā)現(xiàn)于我國臺灣的傳統(tǒng)藥用菌，通常生長在空心、腐爛的牛樟木中[8]，其生長極其緩慢，但三萜類化合物含量較高，對抗腫瘤、降血脂、降血糖等具有良好的療效，深受消費者歡迎[9]。在牛樟芝中SE催化生成的2，3-氧化鯊烯是合成羊毛甾醇（Lanosterol）的重要底物，進而形成膽固醇、三萜等化合物，SE作為反應中的限速酶具有重要意義[10]。大腸桿菌（Escherichia coli，Ecoil）BL21（DE3）是高效表達異源蛋白常用的原核表達菌株之一，具有表達效率高等優(yōu)點，但是外源蛋白的表達效率，受到培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和誘導劑等因素的影響差別較大[11]，為在體外獲得牛樟芝SE蛋白表達的最佳條件，將pET28a-se重組質(zhì)粒導入Ecoil BL21（DE3）中，利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、誘導時間和誘導溫度進行篩選，通過正交試驗優(yōu)化誘導條件，篩選出牛樟芝se原核表達最佳條件，為進一步探討牛樟芝SE蛋白活性和三萜合成機制奠定基礎。

1材料與方法

11材料與試劑

臺灣牛樟芝菌株AC001（GenBank登錄號：KM925002）由臺灣神農(nóng)真菌生物技術有限公司惠贈，保存于國家菌草工程技術研究中心；原核表達載體pET28a由福建農(nóng)林大學功能基因組學研究中心提供。

2×Taq Master Mix、Ecoli DH5α、Ecoli BL21（DE3）感受態(tài)細胞購于天根生化科技（北京）有限公司；His60 Ni Superflow Resin、pMDTM18-T購于TaKaRa公司；D2000 Plus Marker、Direct-load Color prestained Marker、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）購于Genestar公司；TRIzol試劑購于Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TOYOBO公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購于OMEAG公司；氨芐（Amp）、卡那霉素（Kan）、IPTG、丙烯酰胺（Acr）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥基甲基氨基甲烷（Tris）等購自北京索萊寶科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購于Thermo公司；其他藥品均為國產(chǎn)分析純。引物合成及測序均由鉑尚生物技術（上海）有限公司完成。

12方法

121牛樟芝菌絲體RNA提取及cDNA合成

收集液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d的新鮮牛樟芝菌絲體，按TRIzol法提取樣品RNA[12]，檢測純度和濃度合格后，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明合成cDNA，每20 μL體系中含有500 ng RNA樣品，產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

122se的擴增及回收

從已克隆并上傳至NCBI的se序列（GenBank 登錄號：KT070558）設計引物se-pe-F：CG-GGATCCATGTGGTCAACTAACTACG和se-pe-R：CCCA-AGCTTTCACCACCACCGAATCTC，上下游引物中分別加入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點及相應的保護堿基，PCR擴增反應條件為95 ℃預變性3 min；32個循環(huán)進行94 ℃變性30 s，623 ℃退火40 s，72 ℃延伸100 s；最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收，克隆到pMDTM18-T載體上，轉(zhuǎn)化到Ecoli DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，進一步擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并送樣測序。

123重組質(zhì)粒pET28a-se的構建

將測序正確的的pMD18-se和pET28a質(zhì)粒分別用BamHⅠ和HindⅢ進行雙切，酶反應體系為30 μL：含3 μL 10×Fast Digest Buffer，20 μL pMD18-se或pET28a質(zhì)粒，BamHⅠ、HindⅢ各 15 μL、4 μL ddH2O，反應條件為37 ℃ 20 min，80 ℃滅活 10 min。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收后用T4連接酶進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Ecoli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，并篩選陽性轉(zhuǎn)化子，進一步擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進行酶切驗證，將驗證后的菌液保存?zhèn)溆谩?/p>

124pET28a-se融合蛋白誘導的單因素篩選

針對影響蛋白誘導表達的3個因素，分別進行單因素試驗和正交試驗。蛋白誘導表達及純化方法參考林雄杰等的方法進行，分別取10 μL破碎后上清液及沉淀樣品進行SDS-PAGE電泳檢測，結果表明目的蛋白位于樣品上清中。

IPTG濃度對目的蛋白誘導表達的影響：將培養(yǎng)液中的IPTG終濃度分別設為01、02、04、06、08 mmol/L，15 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)5 h后收集菌體并用超聲波破碎后進行SDS-PAGE電泳檢測，以不添加IPTG試驗組為對照（CK）。

培養(yǎng)時間對目的蛋白誘導表達的影響：培養(yǎng)液的IPTG終濃度為06 mmol/L，培養(yǎng)溫度為15 ℃，200 r/min分別振蕩培養(yǎng)3、5、7、9、11 h，收集菌體破碎后進行SDS-PAGE電泳檢測。

培養(yǎng)溫度對目的蛋白誘導表達的影響：培養(yǎng)液的IPTG終濃度為06 mmol/L，培養(yǎng)溫度分別為15、18、21、24、27 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)5 h后收集菌體破碎后進行SDS-PAGE電泳檢測。

125L9（34）正交試驗對目的蛋白誘導及純化

根據(jù)單因素試驗結果設計L9（34）正交試驗（表1），進行蛋白誘導表達及純化，提取樣品總蛋白和純化后的目的蛋白進行SDS-PAGE電泳（5%濃縮膠，12%分離膠），觀察試驗結果。

126數(shù)據(jù)處理

利用ExPASy數(shù)據(jù)庫預測分子量、等電點；通過Gel Pro Analysis軟件對SDS-PAGE電泳結果進行分析；利用SPSS 200對正交試驗設計結果進行方差分析。

2結果與分析

21pET-28a-se表達載體的構建及驗證

以牛樟芝菌絲體cDNA為模板進行se片段的PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得與預期片段大小相符的單一條帶（1 446 bp），將其純化后克隆至pMD18-T載體，篩選出陽性克隆并提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后與經(jīng)相同的酶雙切的pET28a載體相連，轉(zhuǎn)入Ecoli DH5α后獲得陽性克隆后提取其質(zhì)粒，進行BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切驗證，結果得到與目的片段大小相同的條帶（圖1），表明載體pET28a-Se已構建成功。

22原核表達條件優(yōu)化及目的蛋白純化

目的蛋白表達量太低不利于后續(xù)的蛋白純化，因此本試驗采用單因素正交試驗設計進行原核蛋白誘導表達條件的優(yōu)化。將驗證好的重組質(zhì)粒pET28a-se轉(zhuǎn)化到Ecoli BL21（DE3），利用不同誘導時間、誘導溫度及IPTG濃度進行優(yōu)化。結果表明，隨著IPTG終濃度的逐漸升高，目的蛋白表達量也逐漸增加，當濃度為01～06 mmol/L時，其表達量相當（圖2-a），對IPTG單因素誘導表達的蛋白進行純化后表明其大小約為50 ku（圖2-b）； 當誘導時間為3～5 h時， 目

的蛋白表達量逐漸上升，但當誘導時間大于7 h后，其表達量開始下降（圖3）；當溫度為15～27 ℃時，隨著溫度的升高，目的蛋白的表達量呈先增加后降低的趨勢，當溫度達到或高于26 ℃時，其表達量下降（圖4）。

23正交試驗對目的蛋白誘導優(yōu)化及純化

采用L34正交試驗設計對誘導劑IPTG終濃度、誘導時間和誘導溫度進行優(yōu)化，并將誘導表達后的蛋白用His60 Ni純化后進行SDS-PAGE，利用Gel Pro Analysis對蛋白濃度進行預測（圖5-a、圖5-b，表2），SPSS 20對正交試驗的主體間效應及處理因素效應曲線分析結果表明，當IPTG終濃度為02 mmol/L，誘導時間為7 h，誘導溫度為26 ℃時，se表達量達到最佳，模型具有顯著性差異（R2=0986，調(diào)整R2=0943，P<005）（表3、圖6），且對SE目的蛋白表達的誘導因素的主次為時間>溫度>IPTG終濃度，且時間對目的蛋白的表達具有顯著影響（P<005），而IPTG終濃度和溫度對目的蛋白的表達不具有顯著性（P>005）。

3討論與結論

三萜牛樟芝子實體和菌絲體中重要的活性物質(zhì)，具有抗氧化[14]、防止細胞凋亡[15]等顯著藥用價值和經(jīng)濟效益。SE是三萜類化合物合成途徑中重要的限速酶之一[10]，目前已從人參[16]、刺五加[17]、絞股藍[18]等中草藥中克隆到se。李寶財?shù)劝l(fā)現(xiàn)se的表達量與刺五加葉中皂苷含量之間存在顯著正相關性[19]；蔣世翠等研究發(fā)西洋參須根、側根、莖、葉片、葉柄

等14個器官中的皂苷含量也與鯊烯合酶基因（sqs）和se呈正相關[20]。胡薇等對人參中se原核表達和活性測定結果發(fā)現(xiàn)，其與人參皂苷的合成相關性較大。因此，SE重組蛋白的純化和制備體系的建立為牛樟芝菌絲體、子實體中三萜合成的研究奠定了基礎。

通常研究蛋白功能的主要手段為原核重組，且Ecoli是表達重組蛋白功能最強大的系統(tǒng)之一[21]。常見的原核表達載體pET28a中連有T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，其mRNA的合成速度是大腸桿菌的5倍，能使目的基因高效表達。同時，該載體中N、C端還含有組氨酸標簽（His-Tag），能夠特異地與鎳等金屬離子結合，且不影響重組蛋白的結構和功能，提高目的蛋白的純化效率，是原核表達常用載體之一[21]，選用該載體對牛樟芝se進行原核表達，具有高效、快速和準確等有點。

反應條件通常是生物反應中影響反應結果的主要因素，研究人員常常需要通過不同方式找到最佳的反應條件和影響反應的主次因素。通過單因素試驗和正交設計來考察原核表達的主要因素（誘導劑IPTG終濃度、誘導時間、誘導溫度3個因素）對se表達效率的影響，該方法具有處理次數(shù)少、試驗結果直觀、效率高等優(yōu)點[22]，通過破碎Ecoil BL21菌體所獲得上清蛋白SDS-PAGE電泳與標準蛋白電泳觀察結果和Gel Pro Analysis軟件分析電泳結果，可為研究SE理化性質(zhì)和酶活等奠定基礎。

本研究結果表明，牛樟芝se最佳誘導條件為IPTG終濃度為02 mmol/L，誘導時間為7 h，誘導溫度為26 ℃，誘導的主次因素為時間、溫度和IPTG終濃度，它對于大量蛋白樣品的收集具有指導意義，為se高效表達及后續(xù)功能驗證奠定了良好的基礎。

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