皇幼明 樊一斌 陶小華 潘衛(wèi)利

·論著·

浙江省人民醫(yī)院皮膚科，杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院，浙江杭州，310014

潘衛(wèi)利，E-mail：doctorpan163@163.com

HOG1對(duì)格特隱球菌應(yīng)對(duì)壓力應(yīng)激、毒力因子和抗藥性的影響

皇幼明 樊一斌 陶小華 潘衛(wèi)利

目的明確HOG1基因?qū)Ω裉仉[球菌應(yīng)對(duì)壓力應(yīng)激、毒力因子產(chǎn)生和抗藥性的影響。方法比較格特隱球菌原始株、hog1Δ菌株和重建株在含高滲透壓培養(yǎng)基、抗真菌藥物培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)差異，以及在YEPD培養(yǎng)基中莢膜的合成和咖啡因培養(yǎng)基中黑素產(chǎn)生的差異。結(jié)果hog1Δ菌株在高壓力和抗真菌培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受限，在YEPD培養(yǎng)基中莢膜合成減弱，在咖啡因培養(yǎng)基中黑素生成減少。結(jié)論HOG1基因在格特隱球菌應(yīng)對(duì)壓力應(yīng)激、毒力因子產(chǎn)生、抗藥性中有重要作用。

格特隱球菌； HOG1基因； HOG-MAPK通路

隱球菌是擔(dān)子菌類酵母真菌微生物，在自然界分布廣泛。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年隱球菌病例約100萬(wàn)例，致死率50%以上，在非洲艾滋病患者中，隱球菌病已超過(guò)結(jié)核病成為最主要的致病病因[1]。隱球菌在宿主中生存和繁殖必須要適應(yīng)外界環(huán)境應(yīng)激如高滲、氧化反應(yīng)。隱球菌對(duì)環(huán)境應(yīng)激的調(diào)節(jié)通過(guò)多種信號(hào)途徑來(lái)完成，而HOG-MAPK信號(hào)途徑是其中之一。新生隱球菌是隱球菌病的主要致病菌，國(guó)外研究表明，該途徑同樣參與調(diào)控新生隱球菌對(duì)抗菌藥物、溫度等應(yīng)激反應(yīng)[2]，同時(shí)也調(diào)控兩個(gè)重要的隱球菌毒力因子——莢膜和黑素的生成[3]。而作為它的姐妹種屬，格特隱球菌在形態(tài)特征、生化性質(zhì)方面均有所不同。本文將通過(guò)比較格特隱球菌HOG1基因敲除后菌株對(duì)外界應(yīng)激反應(yīng)、毒力因子、對(duì)抗真菌藥物的敏感性等方面的變化來(lái)驗(yàn)證HOG1在隱球菌致病機(jī)制中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 格特隱球菌(血清B型)臨床株CZ2012原始株、hog1Δ菌株(缺陷株)和重建株(均來(lái)自第二軍醫(yī)大學(xué)隱球菌保藏中心)。

1.1.2 培養(yǎng)基 RPMI1640培養(yǎng)液、SDA及改良型SDA培養(yǎng)基、YEPD固體培養(yǎng)基、咖啡酸玉米培養(yǎng)基、尿素瓊脂培養(yǎng)基等均按照標(biāo)準(zhǔn)配方配制。

1.1.3 主要試劑 兩性霉素B、酮康唑、伊曲康唑、氟康唑和5氟胞嘧啶。

1.1.4 主要儀器和器材 2.5 μL、10 μL、100 μL、1000 μL 各式加樣器；0.02 μm孔徑過(guò)濾器濾頭；pH計(jì)；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。

2 方法

2.1 對(duì)外界應(yīng)激如滲透壓、溫度、氧化反應(yīng)測(cè)試 配制用于不同應(yīng)激反應(yīng)測(cè)試的YEPD培養(yǎng)基(壓力測(cè)試：含1 mol/L、1.5 mol/L KCl的YEPD固體培養(yǎng)基；氧化應(yīng)激：含H2O25 mmol/mL的YEPD固體培養(yǎng)基；含20%甘油、20%葡萄糖、20%甘油果糖的YEPD培養(yǎng)基)，配制各組菌懸液，并依次倍比稀釋，取5 μL菌懸液點(diǎn)種相應(yīng)的培養(yǎng)基中，3～5天后觀察結(jié)果。

2.2 莢膜和黑素生成的測(cè)定 配制各組菌液，調(diào)整菌懸液至5×106個(gè)/mL，點(diǎn)種改良型SDA平板上，分別置于30℃、37℃條件下培養(yǎng)48 h，然后挑取菌落制備菌懸液，墨汁染色，顯微鏡下觀察，拍照。利用photoshop軟件計(jì)算菌體莢膜相對(duì)大小。然后SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析；取同種菌液，調(diào)整同樣濃度，點(diǎn)種于固體咖啡酸培養(yǎng)基上，分別于30℃、37℃溫度下培養(yǎng)3 d、7 d后觀察結(jié)果。

2.3 對(duì)尿素酶生成的影響 調(diào)整菌懸液濃度至5×106個(gè)/mL，離心，PBS純化3次后，每組取5 μL點(diǎn)種于尿素培養(yǎng)基(Christensen urea agar)，重復(fù)三次，分別30℃和37℃條件下培養(yǎng)，1～2 d后觀察結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)中主要通過(guò)測(cè)量原始株、hog1Δ缺陷株和重建株之間的莢膜相對(duì)面積比，分析HOG1基因?qū)ηv膜的影響，因此采用單因素方差分析(one-way ANOVA analysis)比較三種菌株之間的差異，若三種菌株間存在差異(P<0.05)，之后采用Bonfferoni檢驗(yàn)方法比較兩兩菌株間的差異；本實(shí)驗(yàn)所用統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 17.0。

4 結(jié)果

4.1 HOG1對(duì)外界應(yīng)激如滲透壓、溫度、氧化反應(yīng)的影響

4.1.1 三種菌株對(duì)5 mmol/L H2O2沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的差異，hog1Δ菌株對(duì)1 mol/L KCl、1.5 mol/L KCl的抵抗能力明顯減弱(圖1)。

4.1.2hog1Δ菌株對(duì)抵抗唑類藥物應(yīng)激的敏感性升高，而5氟胞嘧啶的敏感性差別較小(圖2)。

4.1.3hog1Δ菌株在高濃度甘油、高糖、高甘露醇應(yīng)激下活力下降(圖3)。

4.2 HOG1對(duì)莢膜和黑素生成的有正向調(diào)節(jié)作用

4.2.1 莢膜觀察 在30℃和37℃條件下，hog1Δ菌株的莢膜生成能力明顯減弱(圖4、5)。

同樣地，比較莢膜相對(duì)面積大小(30℃：WT 0.45、hog1Δ0.13、HOG1+hog1Δ0.41；37℃：WT0.43、hog1Δ0.10、HOG1+hog1Δ0.36)，在30℃和37℃條件下，hog1Δ菌株在同等條件下莢膜相對(duì)面積較小，而原始株和重建株莢膜相比，差異有顯著意義(圖6；*:P<0.001，vshog1Δgroup)。

4.2.2 黑素生成比較 格特隱球菌CZ2012hog1Δ菌株與原始株和重建株相比，hog1Δ菌株在不同溫度和不同時(shí)間點(diǎn)的黑素生成均明顯減少(圖7) 。

圖1 上至下三種菌株分別為WT、hog1Δ、HOG1+hog1Δ

圖2 上至下三種菌株分別為WT、hog1Δ、HOG1+ hog1Δ

圖3 上至下三種菌株分別為WT、hog1Δ、HOG1+ hog1Δ

圖4 30℃條件下，hog1Δ菌株的莢膜生成能力明顯減弱

圖5 37℃條件下，hog1Δ菌株的莢膜生成能力明顯減弱

圖6 在30℃和37℃條件下，hog1Δ菌株在同等條件下莢膜相對(duì)面積較小

5 討論

格特隱球菌主要感染免疫正常人群。該病原菌以前被認(rèn)為主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，而近來(lái)國(guó)內(nèi)也有越來(lái)越多的格特隱球菌感染病例報(bào)道[4]。HOG-MAPK信號(hào)通路在國(guó)外的研究主要限于新生隱球菌，國(guó)內(nèi)關(guān)于格特隱球菌致病性研究的試驗(yàn)研究尚少。在本研究中，我們通過(guò)比較格特隱球菌原始株、hog1Δ菌株及重建株的毒力方面的差異來(lái)驗(yàn)證HOG1在格特隱球菌致病中的作用。

通過(guò)觀察hog1Δ菌株在正常條件和高滲條件下的生長(zhǎng)情況，我們發(fā)現(xiàn)hog1Δ菌株對(duì)外部高滲透性離子、20%糖、20%甘露醇均表現(xiàn)為對(duì)高滲透壓的抵抗力減弱，表明hog1Δ菌株對(duì)高滲透壓表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性。Jung等[5]在新生隱球菌H99中發(fā)現(xiàn)，hog1Δ菌株在富含高糖的高Na+、K+的YEPD培養(yǎng)基表現(xiàn)出明顯的差別，低糖、低PH的高滲培養(yǎng)基中生長(zhǎng)顯著受限。所以，我們認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)的hog1Δ菌株對(duì)外部高滲應(yīng)激的抵抗力明顯降低，證實(shí)HOG1蛋白作為HOG-MAPK通路中重要的因子在細(xì)胞抵抗外界高滲壓力中發(fā)揮著重要的作用。在新生隱球菌中，HOG-MAPK在菌體抵抗多種氧化應(yīng)激損害中有重要作用，本研究中，hog1Δ菌株并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的變化，提示在菌株中，HOG1在菌體對(duì)外界氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮的作用有限，這可能與隱球菌有多個(gè)信號(hào)途徑和調(diào)控機(jī)制在應(yīng)對(duì)壓力刺激時(shí)發(fā)揮作用有關(guān)。

圖7 上至下三種菌株分別為WT、hog1Δ、HOG1+ hog1Δ

Hog1蛋白是HOG-MAPK通路的重要組分。目前已有國(guó)外相關(guān)學(xué)者對(duì)新生隱球菌該通路上游組分進(jìn)行了相關(guān)研究[5,6]。莢膜和黑素主要由cAMP信號(hào)通路調(diào)控，是隱球菌區(qū)別于其他真菌的兩個(gè)重要的毒力特征，HOG-MAPK信號(hào)通路通過(guò)與cAMP交叉作用參與莢膜和黑素的生成[7]。該通路的任何環(huán)節(jié)的突變都可能會(huì)造成莢膜和黑素生成的改變以及毒力的變化。而本實(shí)驗(yàn)hog1Δ缺陷株卻表現(xiàn)為莢膜和黑素的合成明顯減少，表明HOG1可以正向調(diào)節(jié)莢膜和黑素的合成。這與新生隱球菌的作用相反[7]，而同樣的研究中，新生隱球菌不同菌株間HOG1對(duì)莢膜和黑素的調(diào)控作用也存在差異，證明隱球菌種屬間HOG1對(duì)莢膜和黑素的調(diào)控機(jī)制存在差異，可能HOG1基因缺失后引起HOG-MAPK 通路上下游組分發(fā)生變化或同時(shí)存在其他平行途徑同時(shí)調(diào)控這莢膜和黑素的生成。

兩性霉素B和唑類作為經(jīng)典抗真菌藥物常被用于隱球菌病的一線治療。HOG-MAPK途徑控制菌體細(xì)胞麥角固醇的合成，從而影響對(duì)兩性霉素B和唑類抗真菌藥物的敏感性。已有研究表明高滲透壓力可導(dǎo)致真菌多種麥角固醇基因合成減少[8]，這與我們?cè)谂R床藥物治療后對(duì)隱球菌菌體在電鏡下觀察到的結(jié)果相似。低麥角固醇可引起細(xì)胞膜緊縮，靈活性減小，導(dǎo)致胞內(nèi)甘油等滲透性物質(zhì)流出減少。HOG-MAPK通路可能通過(guò)影響麥角固醇的生成，使新生隱球菌對(duì)抗真菌藥物的敏感性產(chǎn)生影響。新生隱球菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，臨床分離的耐藥菌株多與菌體內(nèi)麥角固醇生成有關(guān)[9]，可能是該成分主要影響抗真菌藥物(如多烯類和三唑類)的結(jié)合位點(diǎn)和細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中， CZ2012hog1Δ菌株表現(xiàn)出對(duì)兩性霉素B和5FC的敏感性減弱，而對(duì)唑類藥物的敏感性增強(qiáng)，這與國(guó)外新生隱球菌的情況正好相反[10]。說(shuō)明在格特隱球菌中可能存在其他的途徑共同調(diào)節(jié)麥角固醇的合成進(jìn)而影響抗真菌藥物的敏感性，具體的機(jī)制尚需我們進(jìn)一步進(jìn)行研究。

總之，本研究主要從體外毒力表型來(lái)證實(shí)HOG1對(duì)新生隱球菌毒力調(diào)控的影響。結(jié)果HOG1基因敲除后，格特隱球菌對(duì)外界應(yīng)激反應(yīng)有明顯變化，相關(guān)毒力因子如莢膜和黑素合成減少，對(duì)兩性霉素B、5-FC的敏感性減弱，而對(duì)唑類藥物的敏感性增強(qiáng)。因此，我們認(rèn)為，HOG1在格特隱球菌應(yīng)對(duì)外界應(yīng)激變化和毒力調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，但與其在新生隱球菌中的調(diào)控機(jī)制存在差異性，對(duì)該通路中相關(guān)靶點(diǎn)的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的分子研究來(lái)證實(shí)。

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TheroleofHOG1geneinstress,virulencefactorsandanti-fungaldrugsensitivityofCryptococcusgattii

HUANGYouming,FANYibin,TAOXiaohua,PANWeili.

DepartmentofDermatology,ZhejiangProvincialPeople'sHospital,People'sHospitalofHangzhouMedicalCollege,Zhejiang310014,China

PANWeili,E-mail:doctorpan163@163.com

Objective: To determine the influence of HOG1 gene on stress, virulence factors and anti-fungal drug sensitivity ofCryptococcusgattii.MethodsThe growth difference ofCryptococcusgattii(wild strain,hog1Δstrain and reconstruction strain) in high osmotic pressure medium and antifungal medium, and the bacterial capsule size in the YEPD medium and melanin production in the caffeine medium were compared.Resultshog1Δstrain showed growth limitation in high osmotic pressure medium and antifungal medium, reduction of capsule synthesis in YEPD medium and less melanin production in caffeine medium.ConclusionHOG1 gene plays an essential role in the environmental stress, production of virulence factors and antifungal drug sensitivity ofCryptococcusgattii.

Cryptococcusgattii; HOG1 gene; HOG-MAPK pathway

(收稿：2017-03-05 修回：2017-07-04)