幾種中藥提取液對番茄病害病原真菌的抑制效果

嚴希+田山君+裴蕓+陳穎+張萬萍

摘要：為探索中藥在防治4種番茄病害病原真菌中的應用價值，對供試中藥的水、乙醇提取液進行室內(nèi)抑菌活性測定。結(jié)果表明，在7種中藥中，肉桂、黃芩和桑白皮的乙醇提取液具有較好的抑菌活性，對4種病原真菌均有較好的抑制作用，且肉桂乙醇提取液的抑菌效果最佳，同時乙醇提取液的抑菌活性優(yōu)于水提取液。肉桂乙醇提取液對4種供試菌的抑菌毒力方程和EC50分別為灰葡萄孢菌y=0.346x+0.122，EC50=1.09 g/L；尖孢鐮刀菌y=1.638x+0.167，EC50=0.20 g/L；極細鏈格孢菌y=0.601x+0.177，EC50=0.54 g/L；草酸青霉菌y=1.719x+0.131，EC50=0.21 g/L。

關(guān)鍵詞：中藥提取物；番茄病害；病原菌；乙醇提取液；抑菌活性

中圖分類號： S436.412.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0129-06

近年來，化學抑菌劑的使用已滿足不了多樣化的市場需求，而生物源抑菌劑以其低毒、高選擇性[1]、易降解等特點，獲得了新的發(fā)展機遇。國外對植物提取物抑菌性的研究比較深入，對紫衫[2]、夏季香薄荷[1]、木蘭[3]等藥用植物的研究均證實了藥用植物提取液對植物病原菌的抑制效果。我國有豐富的中藥資源，中藥中含有大量具有抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物，因此，研究中藥的抑菌活性是生物抑菌劑開發(fā)的重要途徑。有研究表明，部分中藥對果蔬病原菌具有良好的抑制作用。喻大昭等發(fā)現(xiàn)，肉桂可以完全抑制白菜黑斑病病菌、黑曲霉病病菌等8種植物病原真菌，具有較強的廣譜抑菌活性[4]；張新強等研究發(fā)現(xiàn)，黃芩對辣椒炭疽病病菌和番茄灰霉病病菌的抑制效果突出[5]；孫偉等比較了55種中藥的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)白芍和桑白皮對蘋果腐爛病病菌和棉花立枯病病菌有強烈的抑制活性[6]；有研究表明，黃柏對灰葡萄孢菌和鏈格孢菌的抑制作用顯著[7]，半夏對霉菌也有顯著的抑制作用[8]。

本試驗選取肉桂、黃芩、黃連、白芍、桑白皮、黃柏、半夏等7種中藥，采用離體抑菌試驗測定不同中藥的浸提液對供試菌菌絲和孢子的抑制率，并以此作為抑菌效能的評價指標研究中藥在番茄病害防治中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選取的7種中藥均購于貴陽市太升中藥材名品特產(chǎn)市場，中藥的詳細信息如表1所示。

1.2 供試病原菌

4株供試真菌分別為引起番茄灰霉病的灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、引起鐮刀果腐病的尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、引起番茄假黑斑病的極細鏈格孢（Alternaria tenuissima）、引起番茄青霉果腐病的草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂條、1 000 mL蒸餾水。

1.4 試驗方法

1.4.1 中藥水、乙醇提取液的制備 將中藥簡單分揀，選取完整、無霉斑的中藥置于鼓風干燥箱中20 ℃低溫烘干過夜，粉碎后經(jīng)80目的過濾篩篩選，制成中藥粉末樣品。精確稱取4.0 g中藥粉末樣品，加100 mL水或乙醇混勻（物料比為 4 g ∶ 100 mL），然后置于35 ℃恒溫搖床中，180 r/min振蕩 24 h，抽濾濾去藥渣，得水、乙醇粗提取液，待下一步濃縮精制。

將水粗提取液置于蒸發(fā)皿中，冷凍后進行低溫冷凍干燥，然后取適量蒸餾水溶解，移至離心管離心，取上清液，再移至刻度試管定容，低溫備用；將乙醇粗提取液置于蒸發(fā)皿中，于 20 ℃ 鼓風干燥箱中揮發(fā)，然后取適量乙醇溶解，移至離心管離心，取上清液，再移至刻度試管中定容，低溫備用[9]。

使用水分測定儀測定含水率，重復3次。參照2010版中國藥典附錄X_A的浸出物測定法[10]，各取20 mL制備好的水、乙醇粗提液至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，冷卻30 min，精確稱其質(zhì)量，測出浸出物含量，按公式（1）計算提取率。

1.4.2 中藥水、乙醇提取液抑菌活性的篩選

1.4.2.1 中藥提取液抑制菌絲生長能力的測定 采用菌絲生長速率法，將中藥水、乙醇提取液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后與PDA培養(yǎng)基按1 ∶ 49混合鋪平板，接種病原菌菌餅，27 ℃恒溫培養(yǎng)至鋪滿2/3平板時，用十字交叉法測量菌落直徑，菌落凈直徑=菌落直徑-菌餅直徑，按公式（2）計算菌絲抑制率。每個處理重復3次，以相應的提取劑作為對照。

1.4.2.2 中藥提取液抑制孢子萌發(fā)能力的測定 采用崔志峰等的方法[11]配制孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計算孢子濃度，并稀釋至濃度為105個/mL。將中藥提取液制成所需濃度的培養(yǎng)基（厚度≤3 mm），吸取0.1 mL孢子懸浮液，表面涂布，晾干后切取約2 cm×2 cm的小塊，正面向上，置于平板內(nèi)保濕，21 ℃黑暗培養(yǎng)24 h，記錄孢子總數(shù)及萌發(fā)數(shù)量，按公式（3）計算孢子萌發(fā)抑制率。每個處理設(shè)3次平行，隨機觀察的視野數(shù)應在3個以上，觀察的孢子總數(shù)不低于100個，以孢子的芽管長度超過孢子直徑視為萌發(fā)。

1.4.2.3 中藥提取液的抑菌活性測定 采用菌絲生長速率法，設(shè)5個濃度梯度，每個濃度設(shè)3個平行，以水、乙醇為空白對照，將數(shù)據(jù)線性擬合，得出毒力回歸方程，并計算出抑制中濃度EC50。

1.4.2.4 雷達圖法綜合評價中藥提取液的抑菌能力 中藥提取液抑菌能力的評價指標包括4種病原菌的菌絲抑制率和孢子萌發(fā)抑制率。采用雷達圖法，進行多指標評價分析。

（1）評價指標的無量綱化處理：根據(jù)張衛(wèi)華等的方法[12]，將菌絲抑制率和孢子萌發(fā)抑制率進行極差化處理，按照公式（4）進行轉(zhuǎn)換。

式中：xi為第i個評價指標；xi′為轉(zhuǎn)換后的評價指標；M、m分別為該指標中最大值、最小值。endprint

（2）評價指標的權(quán)重設(shè)置和轉(zhuǎn)換：采用鄧祿軍等的方法[13]處理數(shù)據(jù)，本試驗的評價指標有8個，各指標的權(quán)重ω1、ω2、…、ω8均設(shè)置為0.125，通過公式（5）將權(quán)重轉(zhuǎn)換為角度，共8個數(shù)軸。

θi=360ωi。（5）

式中：θi為夾角角度，ωi為權(quán)重。轉(zhuǎn)換結(jié)果如表2所示。

（3）雷達圖的繪制：將無量綱化處理數(shù)據(jù)投影在對應的評價指標數(shù)軸上，數(shù)軸取值范圍設(shè)定為[1，0]。連線形成雷達圖，即可對參試樣品進行直觀的評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥提取液浸出物的含量和提取率

由表3可知，比較不同提取劑提取7種中藥的提取率發(fā)現(xiàn)，中藥的種類和提取劑的選擇對提取率有明顯的影響。從中藥種類方面來看，各中藥提取液的提取率之間差異明顯，黃芩的水溶液提取率最高，極顯著高于其他中藥提取液（P<001）；白芍的乙醇提取液提取率最低，極顯著低于其他中藥提取液（P<0.01），這說明不同中藥種類的提取率不同。從不同提取劑方面來看，與乙醇作為提取劑時相比，以水作為提取劑的提取率普遍較高；除了肉桂和桑白皮外，其他中藥水提取液的提取率均極顯著高于乙醇提取液的提取率（P<001），這說明中藥中的水溶性成分較多，脂溶性成分較少，但2類成分對抑菌作用的貢獻程度還取決于2種提取液的抑菌效果。

2.2 不同中藥提取液的抑菌活性比較

2.2.1 不同提取方式對中藥提取液抑菌活性的影響 當中藥提取液與培養(yǎng)基按1 ∶ 9混合時，即有效物質(zhì)濃度為10%時，測定各中藥的水提取液對供試菌株菌絲的抑制效果。由圖1可知，各種中藥水提取液對4種病菌的抑制效果差異明顯。

由圖1-a可知，黃連、白芍和黃柏的水提取液對灰葡萄孢菌菌絲的抑制效果較佳，抑制率分別為75.36%、78.26%、75.36%，均極顯著高于其他中藥水提取液的抑制率（P<0.01），肉桂、半夏水提取液對灰葡萄孢菌菌絲的抑制率分別為 52.17%、53.62%，均極顯著高于黃芩和桑白皮水提取液對灰葡萄孢菌菌絲的抑制率（P<0.01），而黃芩水提取液對灰葡萄孢菌菌絲的抑制率極顯著高于桑白皮水提取液的抑制率（P<0.01）。

由圖1-b可知，黃連水提取液對尖孢鐮刀菌菌絲的抑制效果最好，抑制率達73.02%，白芍和黃柏水提取液的抑制效果次之，抑制率分別為34.92%、33.33%，黃芩水提取液對尖孢鐮刀菌菌絲的抑制效果最差，抑制率僅為4.76%，極顯著低于白芍、黃柏提取液的抑制率（P<0.01）。

由圖1-c可知，黃連水提取液對極細鏈格孢菌菌絲的抑制效果最佳，抑制率達75.36%，與黃柏水提取液的抑制率差異極顯著（P<0.01），肉桂、黃芩、白芍和桑白皮水提取液對極細鏈格孢菌菌絲的抑制率極顯著低于黃柏水提取液（P<001），抑制率分別為27.54%、21.74%、27.54%、23.19%，半夏水提取液對極細鏈格孢菌菌絲的生長具有促進作用。

由圖1-d可知，半夏和黃柏水提取液對草酸青霉菌菌絲的抑制效果最佳，抑制率分別為53.97%、50.79%，與黃芩、桑白皮水提取液的抑制率差異極顯著（P<0.01），后兩者均為28.57%，黃芩、桑白皮水提取液對草酸青霉菌菌絲的抑制率均極顯著高于肉桂、黃連、白芍水提取液的抑制率（P<001）。

由表4可知，7種中藥的乙醇提取液對供試病原菌菌絲生長的抑制率均為100%，要了解這幾種中藥乙醇提取液抑菌效果的差異，還須降低乙醇提取液的濃度做進一步的比較研究。結(jié)合表3綜合分析來看，雖然水提取比乙醇提取具有更高的提取率（除肉桂和桑白皮以外），但是在同等濃度下，中藥乙醇提取液的抑菌能力顯著優(yōu)于水提取液，同時乙醇作為浸提溶劑，具有易過濾、易濃縮、易保存等優(yōu)點，因此采用乙醇作為提取劑更好。

2.2.2 不同中藥的乙醇提取液對4種病原菌的抑菌活性分析 當中藥提取液與培養(yǎng)基按1 ∶ 49混合時，即有效物質(zhì)濃度為2%時，測定各中藥乙醇提取液對供試菌的抑制效果。

由圖2、圖3可知，不同中藥乙醇提取液對4個菌株的菌絲和孢子的抑制效果差異明顯。

由圖2-a可知，黃芩和桑白皮乙醇提取液對灰葡萄孢菌菌絲的抑制率差異不顯著，分別為75.97%、70.13%，均與肉桂乙醇提取液的抑制率差異極顯著（P<0.01）。白芍乙醇提取液對灰葡萄孢菌絲的抑制率為19.48%，與肉桂、黃柏、半夏乙醇提取液的抑制率差異極顯著（P<0.01），黃柏、半夏乙醇提取液的抑制率之間差異不顯著，分別為1.3%、0.65%。

由圖2-b可知，肉桂乙醇提取液對尖孢鐮刀菌菌絲的抑制率最高，為100%，極顯著高于其他中藥乙醇提取液的抑制率 （P<0.01）， 黃芩乙醇提取液對尖孢鐮刀菌菌絲的抑制率次之，為61.73%，黃芩、桑白皮、白芍乙醇提取液的抑制率之間差異極顯著（P<0.01），但均極顯著高于黃連、黃柏、半夏乙醇提取液的抑制率（P<0.01），后三者之間差異不顯著，分別為5.56%、1.23%、6.17%。

由圖2-c可知，肉桂、桑白皮乙醇提取液對極細鏈格孢菌菌絲的抑制率差異不顯著，分別為77.78%、80.95%，均極顯著高于其他幾種中藥乙醇提取液對極細鏈格孢菌菌絲的抑制率（P<0.01），且其他幾種中藥乙醇提取液對極細鏈格孢菌菌絲的抑制率之間差異極顯著（P<0.01）。

由圖2-d可知，不同中藥乙醇提取液對草酸青霉菌菌絲的抑制率表現(xiàn)為肉桂>黃芩>桑白皮>半夏>黃柏>黃連>白芍，除桑白皮與半夏、黃柏與黃連的乙醇提取液對草酸青霉菌菌絲的抑制率之間差異不顯著外，其他中藥乙醇提取液的抑制率之間的差異均達到極顯著水平（P<0.01）。

由圖3-a可知，肉桂、黃芩中藥乙醇提取液對提取液對灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)的抑制率均為100%，極顯著高于其余幾種中藥乙醇提取液對灰葡萄孢菌孢子的抑制率，半夏乙醇提取液對灰葡萄孢菌孢子的抑制率顯著高于黃連乙醇提取液（P<0.05），但二者與白芍乙醇提取液的抑制率無差異，與桑白皮乙醇提取液的抑制率之間的差異達到極顯著水平（P<0.01），黃柏乙醇提取液對灰葡萄孢菌孢子的萌發(fā)幾乎無抑制效果，抑制率僅為0.18%，與黃連乙醇提取液的抑制率差異不顯著，而與半夏乙醇提取液的抑制率差異極顯著（P<001）。endprint

由圖3-b可知，桑白皮乙醇提取液能夠完全抑制尖孢鐮刀菌孢子的萌發(fā)，肉桂乙醇提取液對其抑制率達93.66%，兩者之間差異顯著（P<0.05），黃芩乙醇提取液對尖孢鐮刀菌孢子的抑制率為81.92%，與肉桂乙醇提取液對尖孢鐮刀菌孢子的抑制率差異顯著（P<0.05），其余中藥乙醇提取液對尖孢鐮刀菌孢子的抑制率均極顯著低于黃芩乙醇提取液對尖孢鐮刀菌孢子的抑制率（P<0.01），且相互之間差異極顯著（P<0.01），表現(xiàn)為黃柏>半夏>黃連>白芍。

由圖3-c可知，肉桂、黃連、半夏乙醇提取液對極細鏈格孢菌孢子萌發(fā)的抑制率均為100%，極顯著高于黃芩、桑白皮乙醇提取液的抑制率（P<0.01），后二者分別為87.01%、877%，黃芩、桑白皮乙醇提取液的抑制率極顯著高于黃柏、白芍乙醇提取液的抑制率（P<0.01），且黃柏、白芍乙醇提取液的抑制率之間差異極顯著（P<0.01）。

由圖3-d可知，肉桂、黃芩乙醇提取液均能夠完全抑制草酸青霉菌孢子的萌發(fā)，且兩者的抑制率極顯著高于黃連、黃柏、桑白皮乙醇提取液的抑制率（P<0.01），后三者的抑制率之間的差異也達到極顯著水平（P<0.01），分別為90.54%、70.03%、49.37%。白芍、半夏提取液的抑制率分別為 0.24%、9.91%，兩者差異顯著（P<0.05）。

由于評價指標較多，且各中藥的指標有高有低，不能直觀判定抑菌活性的相對大小，因此采用雷達圖法進一步進行分析。

2.2.3 雷達圖法比較抑菌活性 將圖2、圖3中的各評價指標進行無量綱化處理，并繪制雷達圖，結(jié)果分別如表5、圖4所示。由于采用了極差化的無量綱處理方法，數(shù)軸上取值范圍為[0，1]，離原點越遠，代表在同一指標比較中，抑制效果相對越好；離原點越近，抑制效果相對越差。

由圖4可知，半夏乙醇提取液有著明顯的專一性抑菌傾向，只對極細鏈格孢有抑制效果，其中，半夏乙醇提取液能夠完全抑制極細鏈格孢菌孢子的萌發(fā)，桑白皮乙醇提取液對極細鏈格孢菌菌絲生長的抑制率大于80%；黃芩的指標1、指標5、指標8的值均為1，表明黃芩乙醇提取液對灰葡萄孢菌菌絲的生長和孢子的萌發(fā)的抑制率均為100%；而黃連乙醇提取液則表現(xiàn)為明顯的選擇性抑菌偏向，黃連指標7、指標8的值均大于90%，表明黃連乙醇提取液能夠有效抑制尖孢鐮刀菌、草酸青霉菌孢子的萌發(fā)；肉桂乙醇提取液基本能夠完全抑制4種病菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長，無明顯的抑菌偏向。

2.3 肉桂乙醇提取液的抑菌能力測定

通過以上分析得出肉桂乙醇提取液的抑菌效果最佳，但是其抑菌所需的具體濃度尚不明確，因此對其抑菌所需濃度進行測定。

由表6可知，肉桂乙醇提取液的抑菌所需濃度較低，且對尖孢鐮刀菌和草酸青霉菌的抑制效果較強，EC50分別為 0.20、0.21 g/L，當肉桂乙醇提取液的濃度為0.45 g/L時，理論上，對2種菌的抑制率達90%。肉桂乙醇提取液對灰葡萄孢菌的抑制能力最低，其EC50為1.09 g/L，若要達到90%的抑制效果，其濃度須達到2.25 g/L；理論上，當肉桂乙醇提取液的濃度為2.25 g/L時，可以完全抑制尖孢鐮刀菌、極細鏈格孢菌、草酸青霉菌的生長，對灰葡萄孢菌的抑制率達90%。因此，可將肉桂乙醇提取液作為一種廣譜的番茄病害防治植物源抑菌劑加以開發(fā)利用。

3 討論

在提取過程中，雖然水提取比乙醇提取具有更高的提取率（肉桂除外），但乙醇提取液的抑菌活性優(yōu)于水提取液，說明中藥中的水溶性成分較多，但起主要抑菌作用的可能是一些脂溶性成分；半夏和白芍2種中藥乙醇提取液只對極細鏈格孢菌有抑制效果，二者配合可作為專一性抑菌劑加以開發(fā)利用，對番茄假黑斑病的防治有一定的應用價值，黃芩乙醇提取液對灰葡萄孢菌菌絲的生長和孢子的萌發(fā)的抑制率均為100%，可作為灰葡萄孢菌的專一性抑菌劑加以開發(fā)利用，對番茄黑霉病的防治有一定的應用價值；理論上，當肉桂乙醇提取液的濃度達到 2.25 g/L 時，對4株供試菌的生長均具有良好的抑制效果，因此，肉桂對番茄病害的防治具有一定的應用價值， 可以直接利用或研究其有效抑菌成分作為新型植物源抑菌劑加以開發(fā)利用。

本試驗采用雷達圖法綜合分析了多個指標，可以從大量數(shù)據(jù)中快速篩選出部分表現(xiàn)優(yōu)秀的樣品組，具有簡潔和直觀的優(yōu)勢，并且可以應用于食品風味、質(zhì)量評價等多指標評價。但是由于指標排列順序的不同會使圖形出現(xiàn)一定差別，因此只能用于快速篩選，而無法進一步比較尋找最優(yōu)的樣品組，限制了其應用。

本試驗僅對中藥的抑菌活性做了初步研究，而中藥成分比較復雜[14]，抑菌作用可能是多種成分共同作用的結(jié)果，且抑菌活性可能與供試樣品的生長地域、生長季節(jié)等諸多因素有關(guān)，想要分析其具體抑菌成分，還須進一步深入研究。

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