楊久玲，謝 和，杜超峰

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.藍(lán)茅生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，貴州 黔東南 557500)

紅茶是市場(chǎng)上的主銷茶類，2015年，中國(guó)紅茶的產(chǎn)量為25.8萬噸，較2014年增長(zhǎng)了12.95%，其中內(nèi)銷 15.84萬噸，占國(guó)內(nèi)茶葉銷量的9%，出口2.8萬噸，占茶葉總出口量的8.7%[1]。為了滿足不同消費(fèi)者的需求，更好的占有市場(chǎng)，一些廠商開始研發(fā)具有獨(dú)特風(fēng)味的紅茶制品。目前，已經(jīng)開發(fā)出的紅茶產(chǎn)品有各種花香型紅茶：如金銀花香型[2]、橘子花香型[3]、梔子花香型[4]紅茶等；果香型紅茶：如藍(lán)莓香型[5]紅茶；其他香型紅茶：如麥香型[6]、香草香型紅茶[7]等。醬香是我國(guó)傳統(tǒng)食品特有的一種香型，在食品、制醬、釀酒等方面都得到了廣泛的應(yīng)用。如在釀酒方面，醬香型白酒茅臺(tái)酒被譽(yù)為國(guó)酒；以茅臺(tái)酒為原料生產(chǎn)的國(guó)酒香型卷煙也已上市銷售；在風(fēng)味食品方面，利用芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的醬香風(fēng)味牛肉[8]等獲得了成功。因此，本實(shí)驗(yàn)主要通過微生物發(fā)酵技術(shù)將醬香風(fēng)味與紅茶的特有香味有機(jī)地結(jié)合起來，研制出一種新型的具有醬香風(fēng)味的紅茶。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1發(fā)酵菌種 枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)E20菌株，由貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2主要培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，自來水1000 mL， pH7.2～7.4，121℃，0.1 Mpa，滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，自來水1000 mL，pH7.2～7.4，121℃，0.1 Mpa，滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆用水浸泡24 h，分裝三角瓶(100 g/500 mL)，121℃，0.1 Mpa，滅菌30 min。

1.1.3主要原料及試劑 紅茶：產(chǎn)地為貴州都勻。分析純?cè)噭毫姿釟涠c、磷酸二氫鉀、茚三酮、堿式乙酸鉛、濃鹽酸、濃硫酸、甲醇、福林酚、碳酸鈉、乙酸乙酯、乙醇、碳酸氫鈉、草酸。標(biāo)準(zhǔn)品：茶氨酸、茶多酚、咖啡堿。

1.1.4主要儀器與設(shè)備 DH 5000 型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、ZWYR-D2403氣浴恒溫振蕩器(上海智成公司)、TG-W型微量高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、SW-CJ-1FD型凈化工作臺(tái)(上海錦昱科學(xué)儀器有限公司)、XFS-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司)、TY紫外分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T-23776-2009《茶葉感官審評(píng)方法》[9]、GB/T-14487-1993《茶葉感官審評(píng)術(shù)語》[10]為依據(jù)，對(duì)研制的醬香風(fēng)味紅茶感官審評(píng)。醬香風(fēng)味紅茶得分主要是由醬香風(fēng)味紅茶香氣及滋味決定。

1.2.2發(fā)酵菌劑的制備 菌種活化：將E20菌株接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h，重復(fù)2～3次，活化菌種。

擴(kuò)大培養(yǎng)：挑取活化好菌種的單菌落接種至50 mL種子培養(yǎng)基，30℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，制取菌懸液。

發(fā)酵培養(yǎng)：在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種2 mL菌懸液，程序升溫發(fā)酵6 d。

1.2.3單因素篩選試驗(yàn) 在浸提時(shí)間12 h、發(fā)酵提取液添加量為20%、35℃干燥3 d的條件下，探究不同乙醇溶液濃度對(duì)醬香風(fēng)味紅茶品質(zhì)的影響。發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵完成后，加入100 mL濃度分別為0.0087、0.0095、0.0104、0.0113、0.0122、0.013 04 mol/L的乙醇溶液。對(duì)制得的醬香風(fēng)味紅茶進(jìn)行感官審評(píng)。

在乙醇溶液濃度為0.0104 mol/L、發(fā)酵提取液添加量為20%、35℃干燥3 d的條件下，探究不同浸提時(shí)間對(duì)醬香風(fēng)味紅茶品質(zhì)的影響。加入乙醇溶液，分別浸提6、12、24 h。4000 r/min離心20 min。對(duì)制得的醬香風(fēng)味紅茶進(jìn)行感官審評(píng)。

在浸提時(shí)間12 h、乙醇溶液濃度為0.0104 mol/L、35℃干燥3 d的條件下，探究不同發(fā)酵提取添加量液對(duì)醬香風(fēng)味紅茶品質(zhì)的影響。往紅茶中分別噴施重量體積比分別為10、15、20、25、30%的發(fā)酵提取液，充分混勻。對(duì)得到的醬香風(fēng)味紅茶進(jìn)行感官審評(píng)。

1.2.4醬香風(fēng)味紅茶生產(chǎn)工藝的優(yōu)化 以感官審評(píng)為標(biāo)準(zhǔn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，參考《生物統(tǒng)計(jì)附實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)》[11]，運(yùn)用SPSS 20.0設(shè)計(jì)正交表，對(duì)醬香風(fēng)味紅茶的生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)的生產(chǎn)工藝。

1.2.5醬香風(fēng)味紅茶主要化學(xué)成分的測(cè)定 根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定醬香風(fēng)味紅茶的總游離氨基酸、茶多酚、咖啡堿、茶紅素、茶黃素、茶褐素等主要化學(xué)成分。游離氨基酸總量：GB/T8314-2013《茶游離氨基酸總量的測(cè)定》[12]采用茚三酮比色法；茶多酚：GB/T8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測(cè)方法》[13]采用福林酚顯色法；咖啡堿：GB/T8312-2013《茶咖啡堿測(cè)定》[14]采用紫外分光光度法；茶色素：《茶葉生物化學(xué)》[15]采用紫外分光光度法。并對(duì)醬香風(fēng)味紅茶主要化學(xué)成分含量與對(duì)照茶樣進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 乙醇溶液濃度

乙醇是良好的有機(jī)溶劑，能與水任意比互溶，且能食用，是本研究的最佳溶劑。往發(fā)酵完成的培養(yǎng)基中加入濃度分別為0.0087、0.0095、0.0104、0.0113、0.0122、0.013 04 mol/L的乙醇溶液提取醬香物質(zhì)。

圖1 乙醇溶液濃度對(duì)醬香風(fēng)味紅茶審評(píng)得分的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on soy sauce flavor Black Tea review score

圖1結(jié)果表明，當(dāng)乙醇溶液為0.0087 mol/L時(shí)，制得的醬香風(fēng)味紅茶得分較低，其香氣不純正，雜味在紅茶的香味中顯得突兀，影響醬香風(fēng)味紅茶的品質(zhì)。隨著乙醇溶液濃度的增加，醬香越濃郁，滋味越醇正，得分越高。且在濃度為0.0113 mol/L時(shí)，得分最高，其醬香濃郁，滋味醇厚，雜味最淡。乙醇溶液濃度超過0.0113 mol/L時(shí)，紅茶香氣中的雜味明顯增加。可能是因?yàn)橐掖既芤簼舛葹?.0113 mol/L時(shí)，呈雜味的物質(zhì)溶解得較少。

2.2 浸提時(shí)間

浸提時(shí)間太短，不能將大部分呈醬香的物質(zhì)提取出來，浸提時(shí)間過長(zhǎng)，微生物會(huì)產(chǎn)生其他異味，導(dǎo)致醬香風(fēng)味不純。因此，選擇合適的浸提時(shí)間尤為重要。將濃度為0.0104 mol/L的乙醇溶液溶液加入到黃豆發(fā)酵培養(yǎng)基，分別浸提6、12、24 h。

圖2結(jié)果顯示，浸提6 h時(shí)，得分較低，制得的紅茶醬香風(fēng)味不足，滋味淡薄。浸提時(shí)間為12 h時(shí)，得分較高，有較濃郁的醬香風(fēng)味，雜味淡，滋味平和。當(dāng)浸提時(shí)間為24 h，感官評(píng)分最高，醬香濃郁，滋味較醇和，雜味淡。

2.3 發(fā)酵提取液添加量

往茶葉添加發(fā)酵提取液的量直接影響呈香的效果，若添加的量過少，茶葉則不能呈醬香或醬香不夠濃郁；發(fā)酵提取液添加量過多，茶葉除了呈現(xiàn)醬香風(fēng)味外，還會(huì)呈現(xiàn)更多的雜味。往紅茶中分別加入10、15、20、25、30%的發(fā)酵提取液，充分混合。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)醬香風(fēng)味紅茶審評(píng)得分的影響Fig.2 Effect of extraction time on soy sauce flavor Black Tea reviewer score

圖3 發(fā)酵提取液添加量對(duì)醬香風(fēng)味紅茶審評(píng)得分的影響Fig.3 The fermentation extract effect of the adding quantity of Maotai-flavor Black Tea review score

圖3結(jié)果顯示，發(fā)酵提取液的添加量在20%以前，醬香風(fēng)味紅茶的醬香味不足，在添加量為10%時(shí)，甚至感受不到明顯的醬香味，因此感官評(píng)分較低。當(dāng)發(fā)酵提取液的添加量超過20%，茶葉中除了濃郁的醬香味外，還會(huì)有豆豉味、酸味等其他雜味，感官評(píng)分得分也較低。當(dāng)添加量為20%時(shí)，茶湯有濃郁的醬香風(fēng)味，其他的雜味較淡，醬香味和紅茶的本味能夠很好的融合，使得整體滋味更加醇和。因此，當(dāng)發(fā)酵提取液的添加量為20%時(shí)，感官評(píng)分最高。

2.4 醬香風(fēng)味紅茶生產(chǎn)工藝的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用 L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所采用的因素和水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Tab.1 The factors and the levels

優(yōu)化結(jié)果見表2。

表2 醬香風(fēng)味紅茶最佳生產(chǎn)工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.2 Maotai-flavor of black tea best production process of orthogonal experimental design

表1顯示，三個(gè)因素為乙醇濃度、浸提時(shí)間、發(fā)酵提取液添加量；乙醇濃度0.0104、0.0113、0.0122 mol/L，浸提時(shí)間6、12、24 h，發(fā)酵提取液添加量15、20、25%。

表2中，根據(jù)R值的大小可以看出三個(gè)因素對(duì)醬香風(fēng)味紅茶的影響存在顯著性的順序，A>C>B，即乙醇溶液濃度>發(fā)酵提取液添加量>浸提時(shí)間。醬香風(fēng)味紅茶生產(chǎn)的最優(yōu)條件是A2B2C2，乙醇溶液濃度為0.0113 mol/L、浸提時(shí)間為12 h、提取液的添加量為20%。

2.5 醬香風(fēng)味紅茶主要化學(xué)成分的測(cè)定

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定對(duì)照茶樣、醬香風(fēng)味紅茶、發(fā)酵提取液中的總游離氨基酸、茶多酚、咖啡堿、茶紅素、茶黃素、茶褐素，并對(duì)醬香風(fēng)味紅茶主要化學(xué)成分含量與對(duì)照茶樣進(jìn)行比較，結(jié)果如下。

表3結(jié)果顯示，對(duì)照茶樣中內(nèi)含物含量分別為：總游離氨基酸1.20%、茶多酚12.61%、咖啡堿2.13%、茶紅素4.72%、茶黃素0.62%、茶褐素6.97%；醬香風(fēng)味紅茶中內(nèi)含物含量分別為：總游離氨基酸2.83%、茶多酚12.62%、咖啡堿2.15%、茶紅素4.55%、茶黃素0.66%、茶褐素6.92%。運(yùn)用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)對(duì)對(duì)照茶樣及醬香風(fēng)味紅茶的主要化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行比較，表4發(fā)現(xiàn)：總游離氨基酸差異顯著，茶多酚、咖啡堿、茶紅素、茶黃素、茶褐素差異不顯著。對(duì)發(fā)酵提取液的內(nèi)含物檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：總游離氨基酸含量為 8.82 mg/ml，茶多酚、咖啡堿、茶紅素、茶黃素、茶褐素再發(fā)酵提取液中幾乎檢測(cè)不到。因此，醬香風(fēng)味紅茶中部分游離氨基酸是發(fā)酵提取液中加入的，為茶湯的鮮爽滋味提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

表3 主要化學(xué)成分含量(%，DW)Tab.3 Contents of main chemical components

表4 醬香風(fēng)味紅茶與對(duì)照茶樣主要化學(xué)成分的獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)Tab.4 The independent sample T test of main chemical components with Maotai-flavor black tea and comparison of tea sample

注：“**”表示差異極顯著。

3 討 論

本研究以E20菌株為發(fā)酵菌種，黃豆為發(fā)酵原料，研制醬香風(fēng)味紅茶，具體加工參數(shù)是：在100 g發(fā)酵培養(yǎng)基中接入2%的E20菌懸液，按程序升溫發(fā)酵6 d；將0.0113 mol/L的乙醇溶液100 mL加入到黃豆發(fā)酵培養(yǎng)基浸提12 h，4000 r/min離心20 min制得提取液；往紅茶中加入20%的發(fā)酵提取液，混勻；將茶葉置于35℃干燥箱3 d，即制得了醬香風(fēng)味的紅茶制品。對(duì)對(duì)照茶樣及醬香風(fēng)味紅茶的主要化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行比較，兩者總游離氨基酸差異顯著，茶多酚、咖啡堿、茶紅素、茶黃素、茶褐素差異不顯著。說明醬香風(fēng)味紅茶中部分游離氨基酸是由發(fā)酵提取液提供的。目前，在利用產(chǎn)醬香微生物開發(fā)醬香風(fēng)味食品，主要是將產(chǎn)醬香風(fēng)味的微生物接種到需要開發(fā)的材料上，如將大慶、謝和研發(fā)的風(fēng)味牛肉[9]，就是將產(chǎn)醬香微生物直接接種到牛肉上，使牛肉發(fā)酵產(chǎn)生獨(dú)特的醬香風(fēng)味。但是有的原料如茶葉，茶葉的內(nèi)含物如茶多酚類物質(zhì)具有廣譜的抑菌活性，對(duì)近百種細(xì)菌均有抑制作用[16-17]，且茶葉上營(yíng)養(yǎng)寡淡，使得產(chǎn)醬香微生物不能在茶葉上正常生長(zhǎng)并且產(chǎn)醬香。因此，要使這類原料產(chǎn)生醬香風(fēng)味，可以通過先制取發(fā)酵提取液，然后噴施到原料上得方法來制取醬香風(fēng)味食品。

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