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(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122; 2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

分支酶(Branching Enzyme,簡(jiǎn)稱BE,EC 2.4.1.18),屬于糖苷水解酶家族GH13[1]。它的主要作用一方面催化供體線性α-1,4葡聚糖鏈的降解(直鏈淀粉和支鏈淀粉),另一方面又可以通過(guò)α-1,6糖苷鍵將降解分子片段連接到受體上,形成更多的支鏈,從而改變淀粉的支化程度,該酶可以廣泛應(yīng)用于修飾淀粉,催化α-1,6糖苷鍵的生成,因此目前工業(yè)中主要用于制備高支化淀粉,在食品和醫(yī)藥行業(yè)用途廣泛[2-4]。

抗性糊精又稱難消化糊精,它是以淀粉為原料加工制成,擁有抗人體消化酶作用成分,具有持水性高,飽腹感強(qiáng),在消化道內(nèi)不易被吸收等重要作用,還可促進(jìn)腸道蠕動(dòng)和益生菌增殖[5]。此外,抗性糊精產(chǎn)品具有水溶性好、溶速快、無(wú)色無(wú)味等特性,在改善食品口感、優(yōu)化食品加工性能等方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì),因此在飲料、烘焙、乳制品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用[6]。抗性糊精的研究最早起源于日本,我國(guó)在20世紀(jì)九十年代才開(kāi)始對(duì)抗性糊精進(jìn)行研究,1995年林勤保等以淀粉為原料制備焦糊精,并將焦糊精用α-淀粉酶處理后再用葡萄糖淀粉酶處理制備抗性糊精[7]。2006年,廣東省食品研究所申請(qǐng)了一種抗性麥芽糊精的制備工藝的專利,它先對(duì)焦糊精用α-淀粉酶水解,然后用普魯蘭酶處理,后進(jìn)行脫色離子交換和噴霧干燥得到抗性麥芽糊精[8]。

分支酶能夠進(jìn)一步利用焦糊精里的α-1,4糖苷鍵,合成人體抗消化成分的α-1,6糖苷鍵,提高焦糊精中抗性成分的含量。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)利用分支酶來(lái)制備抗性糊精的相關(guān)報(bào)道。由于天然菌株的產(chǎn)酶能力較低,為了克服天然菌株的低生產(chǎn)能力,將其基因進(jìn)行過(guò)量表達(dá)以提高產(chǎn)量是降低生產(chǎn)成本的有效途徑之一[2]。本文通過(guò)構(gòu)建基因工程菌,將來(lái)源于Thermusthermophilus的淀粉分支酶(TtSBE)在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá),并研究此酶的酶學(xué)性質(zhì)及其在抗性糊精制備過(guò)程中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌E.coliBL21(DE3)、E.coliJM109、表達(dá)載體pET-24a(+) 本實(shí)驗(yàn)室保藏;pMD18-T-simple載體、T4 DNA連接酶、堿性磷酸酶CIAP、DNA聚合酶PrimeSTAR?HS、限制性內(nèi)切酶(NdeI、HindⅢ) 大連寶生物公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、PCR純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒 北京天根生化科技有限公司;PCR引物 上海生工生物工程有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG)、氨芐青霉素(Ampicillin,Amp)、卡那霉素(Kanamycin,Kan) 上海捷瑞有限公司;蛋白質(zhì)凝膠電泳試劑盒 碧云天生物技術(shù)(南通)有限公司;焦糊精 山東百龍創(chuàng)園生物科技有限公司;直鏈淀粉 美國(guó)Sigma公司;分子級(jí)酵母粉和蛋白胨 Oxoid公司;其它常規(guī)試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

細(xì)胞超聲波破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;Unic 7200可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼科(上海)有限公司;蛋白電泳儀、UVP凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司;pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司;恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床 上海精密儀器儀表有限公司;恒溫水浴搖床 太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有公司;PTC-200型基因擴(kuò)增儀 美國(guó)MJ Research公司;Eppendorf高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;DYY-6C型核酸電泳儀 北京六一電泳儀廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 聚合酶鏈(PCR)反應(yīng)體外擴(kuò)增目的基因 以Thermusthermophilus的基因組為模板,分別設(shè)計(jì)正、反向引物,PCR擴(kuò)增TtSBE基因。

正向引物含有NdeI酶切位:5′-CATATGATG GCGCGCTTCGCCCTG-3′,

反向引物含有HindIII酶切位:5′-AAGCTT TCACGCCTCCCGGAAAAGG-3′

PCR反應(yīng)的體系:5×PS Buffer 10 μL,dd H2O 34 μL,dNTP Mix 4 μL,模板1 μL,正、反向引物各0.5 μL,PrimeSTAR? HS DNA Polymerase 0.5 μL。

PCR反應(yīng)條件:DNA模板經(jīng)過(guò)94 ℃預(yù)變性4 min之后,然后開(kāi)始進(jìn)入35個(gè)循環(huán):先98 ℃變性10 s形成單鏈,然后在55 ℃下退火10 s使得引物分別與其同源序列相結(jié)合,之后72 ℃在PrimeSTAR? HS DNA聚合酶的作用下延伸2 min形成雙鏈,72 ℃再延伸10 min,最后4 ℃保存。

1.2.2 基因工程菌的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物與pMD18-T simple載體相連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,37 ℃培養(yǎng)3 h左右后涂布含有100 mg/L氨芐青霉素的LB平板。經(jīng)37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,挑選菌落,接入LB液體培養(yǎng)基,8～10 h后提取質(zhì)粒[9],命名為TtSBE/pMD18-T simple,采用質(zhì)粒小提試劑盒來(lái)提取質(zhì)粒DNA,具體參照操作按照試劑盒說(shuō)明書,并稍作修改。

將該質(zhì)粒與表達(dá)載體pET-24a(+)經(jīng)雙酶切后用T4連接酶連接,得到重組表達(dá)質(zhì)粒,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)37 ℃培養(yǎng)8 h,挑轉(zhuǎn)化子在含有100 mg/L卡那青霉素的LB中振蕩培養(yǎng)8～10 h[10],挑取基因工程菌到含有卡那青霉素的TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h后加入IPTG終濃度為0.2 mmol/L,誘導(dǎo)48 h后收集菌體[11]。

1.2.3 酶活測(cè)定 配制50 mmol/L,pH6.5的磷酸緩沖液(Na2HPO4.12H2O和NaH2PO4·2H2O)。

魯戈碘液(母液):0.26 g碘與2.6 g碘化鉀溶于10 mL的容量瓶中(提前3 d配制,確保碘完全溶解),避光室溫保存(6個(gè)月)[12]。

終止反應(yīng)液:0.1 mL的魯戈碘液+50 μL的2 mol/L鹽酸溶液,定容到26 mL(現(xiàn)配現(xiàn)用)[12]。

底物:0.01 g直鏈淀粉(0.1 g支鏈淀粉)+0.2 mL 96%乙醇。3～4 min后加入0.5 mL,2 mol/L的NaOH溶液,加入10 mL的水,攪拌10 min溶解淀粉,再加入0.5 mL,2 mol/L的HCl溶液,加入pH6.5的緩沖液定容到10 mL調(diào)節(jié)pH。(現(xiàn)配現(xiàn)用)

50 μL的酶液+50 μL的底物,在60 ℃下水浴30 min,在加入2 mL的終止反應(yīng)液,室溫放置20 min后660 nm處測(cè)吸光值。

酶活定義:常溫下在660 nm處,吸光值每分鐘降低1%為一個(gè)酶活單位。

1.2.4 TtSBE的分離純化 采用AKTA avant蛋白純化系統(tǒng),具體步驟為:將發(fā)酵液裝入離心杯中配平,于4 ℃、12000 r/min條件下離心20 min收集菌體,用20 mmol/L pH6.5 Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·2H2O緩沖液懸浮菌體,在輸出功率為325 W,總工作時(shí)間為20 min,工作/間歇時(shí)間為2 s/3 s,超聲破碎后12000 r/min離心15 min,破壁上清即為TtSBE粗酶液。然后在60 ℃下熱處理0.5 h左右,采用60%的(NH4)2SO4鹽析,鹽析過(guò)夜,12000 r/min離心收集沉淀。然后將沉淀用pH6.5的緩沖液懸浮均勻,在pH7.5,20 mmol/L Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·2H2O緩沖液中,用透析袋4 ℃透析過(guò)夜,經(jīng)過(guò)無(wú)機(jī)膜過(guò)濾后制成上樣樣品[13]。最后,用monoQ陰離子交換色譜柱進(jìn)行純化(A液:20 mmol/L pH7.5 Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·2H2O緩沖液;B液:20 mmol/L pH7.5 Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·2H2O緩沖液+1 mol/L NaCl),280 nm紫外在線監(jiān)測(cè),分步收集含TtSBE的洗脫液。測(cè)定酶活并進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)。

1.2.5 TtSBE的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.5.1 TtSBE的最適溫度和熱穩(wěn)定性分析 以直鏈淀粉為底物,分別在30、40、50、60、70、80 ℃下測(cè)定活力,按照1.2.3酶活測(cè)定方法計(jì)算TtSBE的酶活,定義最高酶活力為100%,并計(jì)算各個(gè)溫度下的相對(duì)酶活,以此確定TtSBE的最適溫度,為了研究TtSBE的熱穩(wěn)定性,將重組酶在60 ℃下保溫,定期取樣測(cè)定重組酶的殘留酶活(定義初始酶活力為100%)。

表1 重組TtSBE的純化過(guò)程參數(shù)Table 1 Purification process parameters of recombinant TtSBE

1.2.5.2 TtSBE的最適pH 用Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O配制不同pH的磷酸鈉緩沖液,按照1.2.3酶活測(cè)定方法計(jì)算TtSBE分別在pH為5.5、6、6.5、7.0、7.5下的酶活,定義最高酶活力為100%,并計(jì)算各個(gè)pH下的相對(duì)酶活,來(lái)確定TtSBE的最適pH[1]。

1.2.6 TtSBE在抗性糊精制備中的應(yīng)用

1.2.6.1 抗性糊精的檢測(cè)方法 抗性糊精的純度測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T22224-2008《食品中膳食纖維的測(cè)定-酶重量法》。

抗性糊精的得率(%)=干燥后物質(zhì)重量/反應(yīng)前焦糊精重量×100[11,14]。

1.2.6.2 TtSBE在不同溫度下對(duì)生成抗性糊精的影響 以2%的焦糊精為底物,溶于50 mmol,pH6.5的磷酸鈉緩沖液,加入TtSBE酶液,加酶量為最適加酶量,依次在40、50、60、70、80 ℃下酶催化反應(yīng),然后沸水浴滅酶10 min,用1.2.6.1方法測(cè)定抗性糊精的得率。

1.2.6.3 TtSBE在不同pH下對(duì)生成抗性糊精的影響 以2%的焦糊精為底物,溶于50 mmol,pH依次為5、5.5、6、6.5、7.0、7.5的磷酸鈉緩沖液中,加入TtSBE酶液,在最適酶轉(zhuǎn)化溫度下反應(yīng),然后沸水浴滅酶10 min,用1.2.6.1方法測(cè)定抗性糊精的得率。

1.2.6.4 TtSBE不同加酶量對(duì)生成抗性糊精的影響 以2%的焦糊精為底物,溶于50 mmol,pH6.5的磷酸鈉緩沖液,混合均勻后加入TtSBE酶液,加酶量依次為1000、2000、3000、4000、5000 U/g(焦糊精),進(jìn)行酶催化反應(yīng),然后沸水浴滅酶10 min,用1.2.6.1方法測(cè)定抗性糊精的得率。

1.2.6.5 TtSBE在不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)生成抗性糊精的影響 以2%的焦糊精為底物,溶于50 mmol,pH6.5的磷酸鈉緩沖液,加入TtSBE酶液,加酶量為最適加酶量,在最適酶轉(zhuǎn)化溫度下催化時(shí)間依次為0、4、8、12、16 h,然后沸水浴滅酶10 min,用1.2.6.1方法測(cè)定抗性糊精的得率。

2 結(jié)果與討論

2.1 TtSBE的克隆表達(dá)

將Thermusthermophilus來(lái)源的淀粉分支酶基因克隆表達(dá)于E.coli中,搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后收集菌體,破壁離心取上清后測(cè)得TtSBE酶活為700 U/mL。然后將破壁上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析,重組TtSBE的分子量大小為59.2 kDa,如圖1所示,表明重組TtSBE在大腸桿菌中成功表達(dá)。

圖1 重組TtSBE破壁上清SDS-PAGE圖Fig.1 Intracellular soluble fraction SDS-PAGE of recombinant TtSBE注:M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品;1.重組酶TtSBE。

2.2 重組TtSBE的分離純化

經(jīng)過(guò)60%(NH4)2SO4沉淀、monoQ陰離子交換色譜柱等步驟純化后重組TtSBE的比活由88.50 U/mg提高到773.27 U/mg(表1),純化后的重組TtSBE在SDS-PAGE電泳圖(圖2)中呈現(xiàn)單一條帶,表明得到電泳純的重組TtSBE。

圖2 重組TtSBE的SDS-PAGE蛋白電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of purified recombinant TtSBE注:M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品;1.純化重組酶TtSBE。

2.3 TtSBE酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 重組TtSBE的最適溫度及溫度穩(wěn)定性 酶受溫度的影響較大,溫度會(huì)對(duì)酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,從而影響酶促反應(yīng)的催化速率。為了研究重組TtSBE的最適溫度和熱穩(wěn)定性,在不同溫度下測(cè)定重組TtSBE的酶活力,結(jié)果如圖3所示,發(fā)現(xiàn)溫度在60 ℃時(shí),酶活達(dá)到最大,高于或低于60 ℃,酶活都有所下降,說(shuō)明TtSBE的最適溫度為60 ℃;并在60 ℃進(jìn)行熱穩(wěn)定分析,發(fā)現(xiàn)該酶在60 ℃條件下半衰期接近40 h(圖4),60 ℃的熱穩(wěn)定性較好。

圖3 重組TtSBE的最適溫度Fig.3 The optimum temperature for recombinant TtSBE

圖4 TtSBE在60 ℃的熱穩(wěn)定性Fig.4 The temperature stability of recombinant TtSBE at 60 ℃

2.3.2 重組TtSBE的最適pH 酶的活性容易受到環(huán)境pH的影響,過(guò)酸或過(guò)堿都能使酶發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的失活(極端耐酸耐堿酶除外)[15],因此研究重組TtSBE的最適pH至關(guān)重要。測(cè)定重組TtSBE在不同pH緩沖液下的最適pH的酶活力,結(jié)果如圖5所示,重組TtSBE最適pH為6.5,且pH在6.0和7.0時(shí),重組TtSBE的酶活均達(dá)到80%以上。

圖5 重組TtSBE最適pHFig.5 The optimum pH for recombinant TtSBE

2.4 重組TtSBE在抗性糊精制備中的應(yīng)用

2.4.1 不同溫度對(duì)TtSBE生成抗性糊精的影響 酶催化反應(yīng)速率存在最適反應(yīng)溫度,高于或低于最適酶催化反應(yīng)溫度,都會(huì)影響酶轉(zhuǎn)化效率[8]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)TtSBE催化溫度為60 ℃時(shí),生成抗性糊精的得率達(dá)到最大(圖6),為50.5%,比焦糊精中抗性成分提高了7%,而低于或者高于60 ℃時(shí),抗性糊精得率都有所減少,因此選擇在60 ℃制備抗性糊精。

圖6 不同溫度對(duì)TtSBE生成抗性糊精的影響Fig.6 The influence of different temperature on TtSBE synthesis resistance dextrin

2.4.2 不同pH對(duì)TtSBE生成抗性糊精的影響 為了研究TtSBE酶轉(zhuǎn)化制備抗性糊精的最適pH,分別在不同pH下進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化,結(jié)果如圖7所示,重組TtSBE制備抗性糊精的最適pH為6.5,低于或者高于6.5時(shí),抗性糊精得率都有所降低,因此選擇pH6.5為最佳酶轉(zhuǎn)化的初始pH。

圖7 不同pH對(duì)TtSBE生成抗性糊精的影響Fig.7 The influence of different pH for TtSBE synthesis resistance dextrin

2.4.3 不同TtSBE加酶量對(duì)生成抗性糊精的影響 底物濃度一定時(shí),隨著加酶量的增大,酶催化反應(yīng)效率也會(huì)隨之增加,當(dāng)加酶量達(dá)到某一數(shù)值時(shí),繼續(xù)增大加酶量,催化效率不再增加,會(huì)保持在某一數(shù)值,此時(shí)催化效率達(dá)到最大值。探究加酶量對(duì)生成抗性糊精得率的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)加入3000 U/g(焦糊精)的TtSBE時(shí),抗性糊精得率達(dá)到最大值為49.5%(圖8),較焦糊精中抗性成分提高了5.5%,之后繼續(xù)增大加酶量,抗性糊精得率并沒(méi)有增加。

圖8 不同TtSBE加酶量對(duì)生成抗性糊精的影響Fig.8 Effects of different amounts of enzyme for TtSBE synthesis resistant dextrins

2.4.4 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)TtSBE生成抗性糊精的影響 反應(yīng)時(shí)間會(huì)影響抗性糊精的產(chǎn)率,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),產(chǎn)率不斷提高,當(dāng)達(dá)到平衡時(shí),產(chǎn)率趨于穩(wěn)定。為了研究在不同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)TtSBE利用焦糊精生成抗性糊精的變化,分別在不同時(shí)間內(nèi)檢測(cè)抗性糊精,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為12 h時(shí),抗性糊精得率達(dá)到最大(圖9),當(dāng)繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間時(shí),抗性糊精得率沒(méi)有變化,因此,選擇酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間為12 h來(lái)制備抗性糊精。

圖9 不同反應(yīng)時(shí)間TtSBE對(duì)生成抗性糊精的影響Fig.9 The influence of different reaction time on TtSBE synthesis resistant dextrin

3 結(jié)論

本文通過(guò)構(gòu)建基因工程菌將分支酶異源表達(dá)于大腸桿菌,發(fā)酵得到重組TtSBE的酶活達(dá)700 U/mL;在此基礎(chǔ)上對(duì)重組TtSBE進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究,確定了TtSBE的最適pH為6.5,最適溫度為60 ℃,在60 ℃時(shí)的半衰期為40 h左右;并研究了分支酶制備抗性糊精的催化反應(yīng)條件,發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度為60 ℃,pH為6.5,反應(yīng)時(shí)間為12 h,加酶量為3000 U/g(焦糊精)時(shí),抗性糊精得率達(dá)到最大,為50%左右,比焦糊精原料提高約7%。該研究為利用分支酶制備抗性糊精提供了方法借鑒,具有潛在的工業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值。

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