甜味蛋白Monellin及其基因工程

趙萌，蔡成固，劉波

（齊魯工業(yè)大學（山東省科學院），食品科學與工程學院，濟南 250353）

隨著人們物質(zhì)水平的不斷提高，對甜味物質(zhì)的需求量日益劇增，但近年來糖類的過多攝入引起了一系列的健康問題，如齲齒病、高血糖、過度肥胖等。為了滿足消費者對甜味物質(zhì)的需求，現(xiàn)在市場上存在的非糖類甜味劑主要有3類［1］，分別為：（1）人工合成的非營養(yǎng)型甜味劑，如糖精、阿斯巴甜，其不含任何營養(yǎng)成分且過多攝入會破壞人體內(nèi)氨基酸的代謝平衡［2］；（2）糖醇類甜味劑，如山梨糖醇、木糖醇等，它們由于甜度低、熱量低而成為高甜度甜味劑的替代品，但過量食用會導致腹瀉［3］；（3）營養(yǎng)性非糖甜味劑，如甜味蛋白thaumatin，monellin，brazzein等，甜味蛋白作為新型甜味劑具有甜度高、熱量低、甜味持續(xù)時間長、安全無毒、營養(yǎng)價值高、可降解為氨基酸供人體吸收利用等其他甜味劑無法比擬的優(yōu)勢［4］。鑒于其高營養(yǎng)價值和應用價值，自其被發(fā)現(xiàn)后就成為食品和藥品領域的研究熱點。甜味蛋白主要分離于熱帶植物的果實或種子，目前發(fā)現(xiàn)的一共有8種，分別是 miraculin，pentadin，monellin，thaumatin，mabinlin，curculin，brazzein，neoculin。其中miraculin，neoculin具有甜味調(diào)節(jié)功能，即自身不產(chǎn)甜味但能將酸味覺變?yōu)樘鹞?，curculin既能自產(chǎn)甜味又具有甜味調(diào)節(jié)功能，而其余5種甜味蛋白本身具有甜味。繼thaumatin蛋白被美、英、日、德等國批準應用于食品、醫(yī)藥和化妝品領域后，美國食品和藥品管理局（FDA）批準 monellin蛋白為“一般公認為安全（GRAS）”的食品添加劑［5］，但其耐受溫度低限制了其工業(yè)化生產(chǎn)，因此monallin蛋白在提高熱穩(wěn)定性和甜味方面具有極高的研究價值。

1 甜味蛋白monellin的來源及生化特性

天然monellin蛋白分離純化于西非熱帶植物Dioscoreophyllumcumminsii的果實中，由 A，B 2條肽鏈的94個氨基酸組成，A鏈45個氨基酸，B鏈50個氨基酸且只有1個半胱氨酸，蛋白分子量為10.7kDa，2條鏈通過非共價鍵鏈接。天然monellin蛋白由5個反向平行的β－折疊和1個含有17個氨基酸殘基組成的α－螺旋構(gòu)成，其β－折疊和α－螺旋呈現(xiàn)十字交叉的空間結(jié)構(gòu)［6］。其甜味是等質(zhì)量蔗糖的3000左右，在酸性條件下加熱至50℃就會喪失甜味活性［7］。

2 影響monellin蛋白穩(wěn)定性因素

2.1 共價鍵作用力

蛋白中分子內(nèi)部作用力是保持蛋白穩(wěn)定性和生物學活性的關鍵因素，一般分子間作用力大小順序為共價鍵＞離子鍵＞金屬鍵＞氫鍵＞范德華力。天然monellin蛋白的2條肽鏈以分子間疏水作用、氫鍵和離子鍵維持蛋白的三級結(jié)構(gòu)［8］。其在高溫下不穩(wěn)定，對pH的穩(wěn)定性差且易失去甜味。Kim等［9］通過基因改造在A，B鏈之間插入Gly－Phy 2個氨基酸使得A，B鏈以共價鍵形式相連，從而使單鏈蛋白的穩(wěn)定性得到了很大提升。由此證明共價鍵作用力對monellin蛋白穩(wěn)定起到重要作用。

2.2 非共價鍵作用力

支撐蛋白三級結(jié)構(gòu)的重要因素有穩(wěn)定蛋白構(gòu)象的分子間庫侖力、范德華力、氫鍵作用、帶電性質(zhì)、分子距離以及氨基酸極性［10，11］，這些作用力也主導蛋白執(zhí)行特定功能，它們在蛋白內(nèi)分子距離為5內(nèi)時起主導作用。Olga Szczepankiewicz等［12］通過將不同性質(zhì)的氨基酸突變組合后發(fā)現(xiàn)通過削弱monellin蛋白分子間的非共價作用導致該蛋白集聚趨勢增加，其熱穩(wěn)定性也出現(xiàn)相對的減弱。另外，他們通過定點突變方法改變5內(nèi)的氨基酸，將不同帶電性質(zhì)的氨基酸替換肽鏈中關鍵氨基酸位點后，通過熒光實驗和投射電鏡發(fā)現(xiàn)突變后的蛋白出現(xiàn)了不同程度的聚沉現(xiàn)象。

靜電作用力也是影響蛋白穩(wěn)定的重要因素，其影響程度會隨著蛋白外部環(huán)境的變化而變化，不同的pH 環(huán) 境 對 蛋 白 穩(wěn) 定 性 有 一 定 的 影 響［13，14］。Nilesh等［15］通過monellin蛋白折疊實驗將野生型和位于疏水區(qū)域的突變型蛋白E23A在不同pH環(huán)境中用不同濃度的鹽酸胍溶液處理后，蛋白在展開和重新重疊過程中出現(xiàn)了較大差異。

3 影響monellin蛋白甜味活性因素

3.1 關鍵氨基酸殘基

Catherine研究組將monellin蛋白中G16，V37定點突變?yōu)镚16A和V37A后甜味明顯降低，而甜味降低最明顯的G16A并非最不穩(wěn)定的突變體，說明monellin蛋白的甜度和穩(wěn)定性之間不存在協(xié)同關系。分析表明這2個位點與蛋白C末端聚脯氨酸螺旋的彈性有關，因此C末端聚脯氨酸螺旋的彈性可能參與了甜味蛋白分子與甜味受體的相互作用與激活［16］。Yoon－Hui Sung等發(fā)現(xiàn)在monellin蛋白中存在著影響其甜度的關鍵區(qū)域即第一個β－轉(zhuǎn)角的 E2－I5區(qū)域［17］。此外，C41位點位于疏水性較強的β－折疊和α－螺旋之間，是monellin蛋白序列中唯一的半胱氨酸，與蛋白中二硫鍵能形成相互作用力，是維持蛋白活性、影響蛋白甜度的重要位點［18］。

3.2 蛋白表面電荷

Monellin蛋白表面正電荷是影響其甜度的重要因素。Xue Wei－feng等認為增強蛋白表面正電荷即減少蛋白表面負電荷會提高蛋白甜度。然而，增加monellin蛋白表面正電荷改變蛋白甜度也并非完全正確，Esposito等人根據(jù)可增加蛋白表面正電荷的氨基酸位點設計了突變體 M42R，Y63R，Y65R和Y68R，其中只有Y65R相對野生型甜度增加［19］。雖然單因素在甜味蛋白與甜味受體T1R2－T1R3多點攻擊現(xiàn)象中一般不會使其性質(zhì)改變，但該研究中的突變體Y65R甜味提高的同時也表現(xiàn)出良好的酸堿及溫度耐受［20］。

4 Monellin蛋白的基因工程進展

通過基因改造的以共價鍵連接的單鏈monellin基因在工程菌中進行表達，具備原有甜味的同時耐受溫度達到60℃，且經(jīng)高溫處理后在弱酸環(huán)境中可以恢復甜味活性。目前，單鏈monellin基因已經(jīng)成功在微生物和植物中進行異源表達。

4.1 Monellin蛋白的胞內(nèi)表達

4.2 Monellin蛋白的胞外表達

為了實現(xiàn)monellin蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)，研究者們致力于基因工程菌的胞外表達。李敏等人將單鏈monellin基因克隆到大腸桿菌－酵母菌穿梭質(zhì)粒pPICK9中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中得到的目的蛋白具有濃郁甜味，通過30L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的蛋白量能達到2.0g/L。金筱耘等［25］將單鏈monellin基因與綠色熒光蛋白EGFP基因鏈接，在酵母菌中成功表達的融合蛋白在80℃時仍未變性，在環(huán)境pH 3～12之間時，甜度大致為蔗糖的500倍。陳忠軍等人將釀酒酵母中的分泌信號肽α－factor基因插入到monellin基因表達質(zhì)粒中，在釀酒酵母中成功表達出有甜味活性的目的蛋白，他們還在枯草芽孢桿菌中成功表達了分泌性質(zhì)粒［26，27］。然而并非所有的胞外分泌表達的monellin蛋白都有甜味活性，于學紅和劉軍等人雖分別在畢赤酵母和釀酒酵母中將其成功表達，卻均未檢測到甜味［28，29］。

5 研究意義及前景

近年來許多流行病的增加都與糖的攝入有關，隨著人們生活水平的提高，對健康食品的需求日益增加。而甜味蛋白由于其安全健康、高甜度及高營養(yǎng)、可吸收的獨特優(yōu)點，極可能成為食品和飲料行業(yè)中人工甜味劑的替代品。其中作為甜度很高的monellin雖被美國食品和藥品管理局批準為“一般公認安全”的食品添加劑，但因其熱穩(wěn)定性差和生產(chǎn)成本高等原因限制了其大規(guī)模市場化。目前對monellin蛋白的研究主要處于實驗室階段，旨在通過對其二級結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的解析以及對甜味受體T1R2－T1R3與甜味物質(zhì)作用機理的研究，利用基因工程技術如常用的定點突變等方式提高monellin蛋白的穩(wěn)定性和甜味活性以及開發(fā)新的表達體系以尋求產(chǎn)量上的突破。重組的甜味蛋白monellin在原核表達系統(tǒng)、真核表達系統(tǒng)以及植物中的成功表達均為其市場化生產(chǎn)奠定了基礎。目前monellin蛋白在胞內(nèi)表達研究集中于提高其產(chǎn)量，尋找更便捷的純化提取方法，而其在胞外表達因具有高效、純度高等優(yōu)點吸引了越來越多的研究者。

甜味蛋白monellin在食品、醫(yī)藥及化妝品市場中進行規(guī)模化應用目前還未能實現(xiàn)。主要原因有：（1）天然monellin蛋白來源于熱帶植物，而重組甜味蛋白仍處于研究階段，生產(chǎn)成本高，因此在產(chǎn)量和價格上與市場上的人工合成甜味劑相比存有較大差距；（2）monellin蛋白雖然甜度高，但其熱穩(wěn)定性低等生化因素限制其在食品工業(yè)中的應用；（3）利用基因工程技術生產(chǎn)出的重組蛋白的安全性需經(jīng)過嚴格的生物學活性檢驗。另外，甜味物質(zhì)與甜味受體T1R2－T1R3的作用機理未完全明確，因此對甜味蛋白的甜度活性測定還未有一個系統(tǒng)的評判標準。

甜味蛋白其健康、安全的獨特優(yōu)點適用于各類人群，且可在食品、飲料、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)廣泛應用。隨著大眾對健康食品的需求日益劇增，生物技術的不斷進步，以及研究人員對其機理的深入研究，甜味蛋白在食品等相關工業(yè)中會有更大的發(fā)展前景，發(fā)揮更多的作用。