董一鳴

（濰坊市人民醫(yī)院，山東濰坊 261041）

目前，肺癌患者的數(shù)量持續(xù)增加，肺癌死亡的人數(shù)也在逐年攀升，已成為我國目前發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一，嚴(yán)重地威脅了我國居民的健康和生命。在肺癌患者當(dāng)中，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）比例70%～80%，現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，在這些細(xì)胞當(dāng)中，NSCLC的變異率十分高，加快了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。因此，對NSCLC進(jìn)行基因突變檢測具有很強(qiáng)的現(xiàn)實意義，能夠?qū)Ψ伟┗颊叩闹委熎鸬胶艽蟮淖饔?。與傳統(tǒng)的EGFR基因檢測相比，這種被稱為“液體活檢”的新型檢測技術(shù)，能夠最大限度的排除外界環(huán)境的干擾，減少外界細(xì)菌的侵入等等，能夠使得檢測結(jié)果更加的準(zhǔn)確，而且能夠進(jìn)行多次重復(fù)的利用，由于新型檢測方法的優(yōu)越性，受到了醫(yī)學(xué)界人士的廣泛借鑒與運用[1]。

1 循環(huán)腫瘤癌細(xì)胞與肺腺癌的關(guān)系

1.1 CTCs可以用于癌癥早期判斷

腫瘤細(xì)胞是隨著時間的推遲，不斷擴(kuò)散和增多。在時間的推移當(dāng)中，一部分細(xì)胞的上皮組織出現(xiàn)了變異和轉(zhuǎn)化。這時，腫瘤細(xì)胞運動能力就會增強(qiáng)，吸附能力就會減弱，腫瘤細(xì)胞的攻擊性會逐漸增強(qiáng)，向身體其他部位擴(kuò)散。進(jìn)入血循環(huán)的CTCs具有較強(qiáng)的異質(zhì)性，會受到自身免疫系統(tǒng)的攻擊，僅有少部分的細(xì)胞可以存活。因此，如果在患者的其他血液當(dāng)中進(jìn)行檢測到了CTCs細(xì)胞，就可以初步對肺癌進(jìn)行診斷。因此，對于CTCs的單細(xì)胞的EGFR基因突變檢測，能夠及時發(fā)現(xiàn)肺癌患者，在早期進(jìn)行治療，減少死亡率。

1.2 CTCs與肺癌分期的關(guān)系

目前，在臨床上采用的肺癌的劃分標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)美國的癌癥聯(lián)合委員會提出的TNM分期系統(tǒng)。美國的癌癥委員會的分期主要依據(jù)的是手術(shù)中的所見和影像學(xué)的檢測。但是，對于已經(jīng)進(jìn)入晚期的肺癌患者，單純的影像技術(shù)已經(jīng)不能準(zhǔn)確的反映癌細(xì)胞在患者體內(nèi)的擴(kuò)散情況，因為在長期的細(xì)胞變異過程中，癌細(xì)胞的表現(xiàn)形式并不單一。有研究表明，肺癌的CTCs和肺癌的分期具有很大的關(guān)聯(lián)性。在研究的過程當(dāng)中，研究人員還選取了177名身體健康的志愿者進(jìn)行相關(guān)的檢測，然后對CTCs細(xì)胞進(jìn)行EGFR基因突變檢測。最終檢測的結(jié)果顯示，手術(shù)分期pT1/pT2，pT3，pT4患者CTCs檢測陽性率分別是5.6%、11.3%、83%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）。臨床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者CTCs陽性率分別是15.4%、29.7%、47.9%、75.0%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。這些研究的結(jié)果和數(shù)據(jù)都說明了CTCS和癌癥分期的關(guān)聯(lián)性，因此，我們在對肺腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞EGFR基因突變進(jìn)行檢測時，能夠初步判斷該患者患病的時間和治愈的可能性，并且可以根據(jù)癌癥的分期，來選取最適當(dāng)?shù)闹委煼椒ǎ沟没颊吣軌虻玫阶詈玫闹委焄2]。

2 肺腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞EGFR基因突變檢測的步驟

2.1 選取實驗的材料

本次試驗，我們向中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提出了申請，提取了研究院的3種非小細(xì)胞肺癌，它們的型號分別是AS49、NCI-H1650和NCI-H1975，之所以選取研究院的材料，主要是由于研究院在進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)時，選用的是90% RPM1-1640培養(yǎng)基，并且添加了10%的優(yōu)質(zhì)血清，使得細(xì)胞更加的純凈，能夠使得研究檢測的數(shù)據(jù)更加的準(zhǔn)確。這3種細(xì)胞各有各的特點，AS49主要攜帶的病菌是KRAS，但是KRAS與EGFR之間互相排斥，不能共融，所以，在進(jìn)行基因突變的檢測過程當(dāng)中，可以將KRAS作為陰性對照，而NC1-H1650攜帶EGFR外顯子19缺失突變，C1-H1975攜帶外顯子20（T790M）和21（L858R ）雙突變。

2.2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲方法及釋放

在進(jìn)行本次試驗時，我們對于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲主要是采用微流控系統(tǒng)將血液當(dāng)中的CTCs與其它細(xì)胞分離出來，這種分離技術(shù)高效并且分離的細(xì)胞非常干凈。在運用微流控系統(tǒng)對CTCs進(jìn)行捕獲的時候，要用UV光線對細(xì)胞進(jìn)行照射，因為光線的照射可以對多聚和稀酸當(dāng)中的光敏基因進(jìn)行切割，從而使得CTCs能夠得到徹底的釋放。單細(xì)胞由于其體積十分小，在進(jìn)行試驗操作的過程當(dāng)中，十分容易丟失，這時就需要將捕捉到的CTCs細(xì)胞固定在試劑盒內(nèi)，在進(jìn)行顯微鏡觀察時，選用微型操作臺，在進(jìn)行CTCs細(xì)胞的取用時，可以利用毛細(xì)玻璃管的負(fù)壓作用進(jìn)行吸取，在轉(zhuǎn)移的過程也要注意防止細(xì)胞的掉落和混亂。在觀察完成之后，可以進(jìn)行拍照記錄，然后將細(xì)胞快速的放回試劑盒當(dāng)中。

3 EGFR基因突變的特征及檢測方法

3.1 EGFR的基因突變的生物特征

EGFR（epidermal growth factor receptor）是 表 皮 生長因子受體的組成部分之一，主要用于肺癌患者的檢驗。EGFR的突變主要表現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)的18-21的外顯子上，異常的EGFR突變會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散、繁殖和分化。EGFR導(dǎo)致癌癥主要是通過3種形式，分別是EGFR的擴(kuò)散、EGFR的活化和EGFR的配體過程。EGFR的檢測是目前在醫(yī)學(xué)界普遍被接受的一種腫瘤靶向治療分子，與傳統(tǒng)的癌癥治療方法相比，EGFR基因突變檢測的方法能夠使得患者得到更加準(zhǔn)確、及時的治療。

3.2 EGFR基因突變的檢測方法

EGFR基因突變檢測的方法主要分為3種：測序法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法和突變體富集檢測法。DNA的測序法是目前用于EGFR基因突變檢測最可靠和運用范圍最廣的一種方法。但是這種方法耗時長、費用高和技術(shù)要求高，在國內(nèi)的專業(yè)的檢測機(jī)構(gòu)較少。所以在進(jìn)行EGFR基因突變檢測時，往往是根據(jù)癌癥分期，來選用不同的檢測方法。

4 單細(xì)胞EGFR基因突變檢測對于臨床的意義

4.1 提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性

由于目前科技水平的限制，對于癌癥的治療效果的判斷只能依靠影像學(xué)的技術(shù)，根據(jù)治療的情況，也將治療效果劃分為了4個等級：完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定、病情進(jìn)展。但是影像學(xué)的局限性十分明顯，只能顯示宏觀的變化，例如細(xì)胞的運動和擴(kuò)散情況，患者的身體變化等等，但是對于微細(xì)胞的轉(zhuǎn)移卻不能反映。這時，就不得不發(fā)明一種新的檢測方法，使得一切細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散都在檢測范圍之下。研究顯示，肺腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞EGFR基因突變檢測結(jié)果對于肺癌患者的治療情況仍然具有很強(qiáng)的參考意義[3-5]。對CTCs細(xì)胞的數(shù)量、分布情況和轉(zhuǎn)移趨勢等方面的研究，可以實現(xiàn)對患者總體身體狀況的判斷，也可以更加準(zhǔn)確的知道癌細(xì)胞在患者體內(nèi)的具體情況。而且和傳統(tǒng)的檢測方法比較，對CTCs細(xì)胞進(jìn)行EGFR基因檢測的方式，不僅可以使得檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確，還使得檢測更加簡便高效。

4.2 保證治療時間的及時性

對于肺腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的EGFR的基因檢測，可以對肺腺癌的情況做到精準(zhǔn)的判斷。通過對于腫瘤細(xì)胞數(shù)量和分布情況和增長速度的限制等等，可以對患者的病情做出斷定，然后依據(jù)病情，對患者進(jìn)行及時準(zhǔn)確的治療。

4.3 減少對于患者的傷害，提高康復(fù)率

EGFR是國際上普遍被認(rèn)可的一種治療腫瘤的方法，使用范圍非常的廣，EGFR的治療方法可以運用到多種領(lǐng)域，這種方法對于患者產(chǎn)生的傷害更小，與傳統(tǒng)的治療癌癥的方法有著明顯的不同，可以最大限度的減少化療等手段給患者帶來的毒副作用。更為重要的一點是，選用EGFR腫瘤靶向治療的方法，能夠在治療的過程當(dāng)中，通過對于患者體內(nèi)CTCs細(xì)胞的監(jiān)控，實時對患者的治療情況進(jìn)行跟進(jìn)，能夠減少癌癥患者病情惡化的情況，而且能夠在一定程度上提高肺腺癌患者的痊愈率和康復(fù)率[6]。

5 單細(xì)胞EGFR基因突變檢測問題與展望

世界范圍內(nèi)的肺癌患者越來越多，除了吸煙造成的肺癌之外，空氣質(zhì)量下降、不知名氣體的泄露或者二手煙的危害、化學(xué)氣體的危害等等也會導(dǎo)致肺癌的產(chǎn)生。目前，肺癌的治療效果并不明顯，而且治療的效果也比較差。所以，對肺癌的關(guān)注也逐漸增高，對肺癌治療方法的關(guān)注度也顯著提高。因此，國內(nèi)外的專家學(xué)者和臨床的醫(yī)護(hù)人員，對于CTCs的研究也投入了大量的時間和精力，主要是由于CTCs細(xì)胞與肺癌之間有極大相關(guān)性。目前的檢測手法和臨床試驗與治療都存在著一些問題，例如臨床的實驗不足，檢測的方法和手段不夠準(zhǔn)確科學(xué)，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)等等[7]。相信隨著科技的發(fā)展和人們重視程度的提高，對于肺腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞EGFR基因突變檢測一定會更加的準(zhǔn)確。

6 結(jié)語

肺癌的問題在全球范圍內(nèi)都受到了廣泛的重視。對于肺腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞EGFR基因突變的檢測十分有必要，特別是CTCs細(xì)胞與肺癌具有強(qiáng)大的相關(guān)性[8]。近些年來，隨著研究的不斷深入單細(xì)胞的EGFR基因的突變檢測已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，這些進(jìn)展對于肺癌患者的臨床治療具有很強(qiáng)的指導(dǎo)意義。