高麗娟,曹 夏

(1山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系,太原 030001;2山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;*通訊作者,E-mail:gaolijuan913@126.com)

胃癌(gastric cancer,GC)是全球高發(fā)惡性腫瘤之一[1]。近幾年歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率和死亡率已顯著降低,然而中國(guó)胃癌的新發(fā)病例數(shù)依然居于全球首位,而且總體生存率明顯低于國(guó)外,這和胃癌早期癥狀十分不明顯有極大的關(guān)系。大多數(shù)患者出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)已進(jìn)入進(jìn)展期,而且早期的臨床表現(xiàn)常與胃炎混淆,導(dǎo)致大多數(shù)胃癌患者已至進(jìn)展期或者晚期也沒(méi)有明顯的臨床癥狀出現(xiàn),如此看來(lái),簡(jiǎn)單依靠臨床表現(xiàn)來(lái)診斷胃癌顯然無(wú)法實(shí)現(xiàn),有必要提高早期診斷手段。

胃腺癌(stomach adenocarcinoma,STAD)是胃癌的一種,由胃腺體細(xì)胞惡變而來(lái),其發(fā)生率高達(dá)胃惡性腫瘤的95%,大多數(shù)胃腺癌患者確診時(shí)已處進(jìn)展期或晚期,外科切除手術(shù)已作用不大,5年術(shù)后生存率低于30%,而早期胃腺癌患者術(shù)后5年生存率高于90%,這說(shuō)明早期診斷、早期治療對(duì)胃腺癌治療的重要性[2]。本研究首次基于R語(yǔ)言對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃腺癌數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,經(jīng)過(guò)篩選得到與預(yù)后密切相關(guān)的生存基因,為胃腺癌的早期分子診斷提供有效的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

TCGA(The Cancer Genome Atlas,https://cancergenome.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)是美國(guó)政府發(fā)起的癌癥和腫瘤基因圖譜計(jì)劃,該數(shù)據(jù)庫(kù)包含了豐富的腫瘤數(shù)據(jù),本研究選擇STAD數(shù)據(jù),并下載RNA-seq數(shù)據(jù),獲得32個(gè)正常樣本和375個(gè)胃腺癌樣本數(shù)據(jù)及其臨床數(shù)據(jù)信息。

1.2 差異基因的篩選方法

本研究中數(shù)據(jù)主要采用R語(yǔ)言edgeR包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,edgeR包是bioconductor中專門用于處理RNA-seq數(shù)據(jù)的基于R語(yǔ)言的軟件包,可對(duì)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析。差異基因的篩選條件為差異倍數(shù)FC>1,P<0.05。

1.3 GO和Pathway富集方法

使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)在線基因注釋軟件對(duì)差異基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)功能和Pathway生物通路富集分析,FDR<0.01為篩選條件。

1.4 預(yù)后基因的分析方法

Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型主要用于腫瘤和其他慢性病的預(yù)后分析,通過(guò)檢測(cè)高低風(fēng)險(xiǎn)基因,可以預(yù)測(cè)病人的生存率。本研究使用R語(yǔ)言中survival包對(duì)差異基因進(jìn)行Cox生存分析,篩選出與該疾病預(yù)后密切相關(guān)的基因。

1.5 作圖方法

火山圖、熱圖、GO富集圖以及生存曲線的作圖采用R語(yǔ)言ggplot2包繪制,KEGG網(wǎng)絡(luò)圖采用Cytoscape軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 差異基因的篩選結(jié)果分析

通過(guò)R語(yǔ)言edgeR包對(duì)差異基因進(jìn)行篩選,得到1 634個(gè)差異基因,其中上調(diào)差異基因857個(gè),下調(diào)差異基因777個(gè)(見(jiàn)圖1)。

2.2 GO富集結(jié)果及分析

GO分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要集中于消化吸收(GO:0007586),細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(GO:0005578),激素活性(GO:0005179),角質(zhì)化包膜(GO:0001533),結(jié)構(gòu)分子活性(GO:0005198),表皮發(fā)育(GO:0008544),蛋白質(zhì)水解(GO:0006508),肽交聯(lián)(GO:0018149)等(見(jiàn)圖2)。

圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因,其中紅點(diǎn)表示上調(diào)差異基因,綠點(diǎn)表示下調(diào)差異基因,黑點(diǎn)表示無(wú)差異基因圖1 胃腺癌差異基因的火山圖Figure 1 Volcano plot of the differentially expressed genes in STAD

紅點(diǎn)表示上調(diào)差異基因,藍(lán)點(diǎn)表示下調(diào)差異基因圖2 差異基因的GO富集分析Figure 2 Gene ontoloy(GO) function analysis of differentially expressed genes

2.3 Pathway富集結(jié)果及分析

Pathway通路分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要集中在細(xì)胞色素P450對(duì)有害物質(zhì)的代謝(hsa00980),化學(xué)致癌(hsa05204),脂肪消化與吸收(hsa04975),甾類激素的生物合成(hsa00140),蛋白質(zhì)的消化與吸收(hsa04974)等生物通路(見(jiàn)圖3)。

2.4 Cox分析結(jié)果及預(yù)后基因的分析

經(jīng)過(guò)R語(yǔ)言survival包對(duì)差異基因進(jìn)行Cox分析,篩選到兩個(gè)與胃腺癌預(yù)后密切相關(guān)的基因ATAD2和SERPINE1(見(jiàn)圖4),從圖中生存曲線可以看出這兩個(gè)基因與胃腺癌的生存率顯著相關(guān)(P<0.05)。

2.5 ATAD2和SERPINE1基因在不同研究中的表達(dá)情況分析

通過(guò)Cox分析發(fā)現(xiàn),ATAD2與SERPINE1對(duì)胃腺癌的預(yù)后有顯著影響,ATAD2和SERPINE1基因的高表達(dá)患者總體死亡率較高,低表達(dá)的患者預(yù)后較好。結(jié)合Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中其他人對(duì)這兩個(gè)基因的研究,進(jìn)一步證實(shí)ATAD2和SERPINE1基因在胃腺癌中的表達(dá)情況,Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中ATAD2的表達(dá)情況(見(jiàn)圖5),SERPINE1的表達(dá)情況(見(jiàn)圖6)。

3 討論

本研究對(duì)TGCA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃腺癌數(shù)據(jù)進(jìn)行了深入分析,經(jīng)過(guò)差異基因的初步篩選和深入分析獲得兩個(gè)與胃腺癌密切相關(guān)的基因ATAD2和SERPINE1,證明了胃腺癌的發(fā)生與相關(guān)基因的表達(dá)水平密切相關(guān),并進(jìn)一步深入分析了ATAD2和SERPINE1基因與胃腺癌的發(fā)生及預(yù)后的關(guān)系。

ATAD2(ATPase family,AAA domain containing 2)是三磷酸腺苷酶家族蛋白2,又稱ANCCA(AAA+nuclear coregulator cancer-associated),具有組織、細(xì)胞分布以及發(fā)育時(shí)期的特異性,廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生、發(fā)展等生理、病理過(guò)程[5],已有相關(guān)研究證明ATAD2基因在癌癥細(xì)胞中高表達(dá),ATAD2基因的抑制研究是未來(lái)治療癌癥的一個(gè)藥物靶點(diǎn),特別是直接針對(duì)ATAD2溴域(BRD)的研究可能是一項(xiàng)非常具有挑戰(zhàn)性的目標(biāo),目前已陸續(xù)有研究針對(duì)次結(jié)構(gòu)域開(kāi)發(fā)小分子藥物來(lái)治療該疾病[6]。除此之外,有研究者對(duì)其表達(dá)與腫瘤發(fā)生相關(guān)性做了較多的研究,Zhang等[7]通過(guò)qRT-PCR和免疫組化的手段驗(yàn)證了胃癌中ATAD2基因的mRNA和蛋白都有高表達(dá),并且證明ATAD2的過(guò)度表達(dá)與臨床分期、腫瘤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān),驗(yàn)證了ATAD2蛋白質(zhì)過(guò)度表達(dá)是胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因子,這項(xiàng)研究與本研究的分析結(jié)果一致,進(jìn)一步證明了結(jié)果的可靠性。Wu等[8]研究證明了ATAD2在肝癌組織中的高度表達(dá),ATAD2與MYC(Myc proto-oncogene protein)原癌基因共同調(diào)節(jié)SMO(smoothened homolog)和Gli(transcriptional activator GLI3)基因的表達(dá),從而激活Hh通路及其反饋通路。Zheng等[9]證明子宮頸癌組織中ATAD2高度表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)狀況有關(guān),通過(guò)減少HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞中ATAD2的表達(dá),減少了腫瘤的入侵和遷移能力,并抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和克隆能力,證明癌基因ATAD2在子宮頸癌的擴(kuò)散、入侵和遷移中扮演重要的角色,可作為一種預(yù)后標(biāo)志和治療宮頸癌的治療靶點(diǎn)。Luo等[10]證明在直腸癌患者中ATAD2基因的過(guò)度表達(dá)有不良的預(yù)后,并證明ATAD2的高表達(dá)與腫瘤大小、血清CEA、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān),可作為直腸癌的預(yù)后標(biāo)志和治療靶點(diǎn)。除此之外,ATAD2在非小細(xì)胞肺癌[11]、前列腺癌[12]中也均有研究,可見(jiàn)該基因與腫瘤發(fā)生的密切相關(guān)性。

淺藍(lán)色方框表示KEGG通路,橢圓內(nèi)基因表示匯集在該通路上的差異基因,其中紅色表示上調(diào)差異基因,黃色表示下調(diào)差異基因圖3 差異基因的Pathway通路分析Figure 3 Pathway analysis of differentially expressed genes

圖4 ATAD2基因和SERPINE1基因的表達(dá)對(duì)總生存期的影響Figure 4 The expression of ATAD2 and SERPINE1 effect on the overall survival

圖5 ATAD2基因在正常組織和癌癥組織的表達(dá)Figure 5 The expression of ATAD2 in normal tissue and cancer tissue

SERPINE1基因在D’Errico等[3]研究的混合型胃腺癌組織中表達(dá)量高于胃黏膜(正常)組織圖6 SERPINE1基因在正常組織和癌癥組織的表達(dá)Figure 6 The expression of SERPINE1 in normal tissue and cancer tissue

纖溶酶原激活物抑制因子1(plasminogen activator inhibitor 1,SERPINE1)是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑[13],是組織型電漿素原激活劑(PLAT)和尿激酶型質(zhì)原激活劑(PLAU)的抑制因子,其作為PLAT抑制劑,主要負(fù)責(zé)纖維蛋白溶解下調(diào)以及纖維蛋白溶解過(guò)度所致出血性疾病[14],而作為PLAU抑制劑,主要參與調(diào)控細(xì)胞黏附和擴(kuò)散[15]。除此之外,SERPINE1基因與腫瘤基因激活有關(guān)[16],目前在食管癌[17],直腸癌[18],子宮內(nèi)膜癌[19],頭頸腫瘤[20]等癌癥中已均有研究,并且SERPINE1基因的高表達(dá)在這些癌癥中有較差的預(yù)后。但是關(guān)于SERPINE1基因表達(dá)與胃癌的具體研究還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

胃腺癌發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,除了與預(yù)后基因的高表達(dá)相關(guān)外,與miRNA,lncRNA[21],甲基化水平[22]都密切相關(guān)。本研究對(duì)胃腺預(yù)后基因進(jìn)行了分析研究,為該疾病的分子標(biāo)志物篩選和靶向用藥研究提供了一定的參考信息。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙玉洲.胃癌血清蛋白標(biāo)記物的篩選、鑒定及生物學(xué)特性研究[D].鄭州:鄭州大學(xué),2016.

[2] 徐攀.人早期胃腺癌新膜標(biāo)志物的表征及臨床前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)研究[D].蘭州:蘭州大學(xué),2015.

[3] D'Errico M, de Rinaldis E, Blasi MF,etal. Genome-wide expression profile of sporadic gastric cancers with microsatellite instability[J]. Eur J Cancer, 2009, 45(3): 461-469.

[4] Chen X, Leung SY, Yuen ST,etal. Variation in gene expression patterns in human gastric cancers[J]. Mol Biol Cell, 2003, 14(8): 3208-3215.

[5] Zou JX, Revenko AS, Li LB,etal. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ATPase coactivator for ERalpha, is required for coregulator occupancy and chromatin modification[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(46): 18067-18072.

[6] Hussain M, Zhou Y, Song Y,etal. ATAD2 in cancer: a pharmacologically challenging but tractable target[J]. Expert Opin Ther Targets, 2018, 22(1): 85-96.

[7] Zhang M, Zhang C, Du W,etal. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker[J]. Clin Transl Oncol, 2016, 18(8): 776-781.

[8] Wu G, Lu X, Wang Y,etal. Epigenetic high regulation of ATAD2 regulates the Hh pathway in human hepatocellular carcinoma[J]. Int J Oncol, 2014, 45(1): 351-361.

[9] Zheng L, Li T, Zhang Y,etal. Oncogene ATAD2 promotes cell proliferation, invasion and migration in cervical cancer[J]. Oncol Rep, 2015, 33(5): 2337-2344.

[10] Luo Y, Ye GY, Qin SL,etal. ATAD2 Overexpression identifies colorectal cancer patients with poor prognosis and drives proliferation of cancer cells[J]. Gastroenterol Res Pract, 2015, 2015: 936564.

[11] Couto PP, Bastos-Rodrigues L, Schayek H,etal. Spectrum of germline mutations in smokers and non-smokers in Brazilian non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients[J]. Carcinogenesis, 2017, 38(11): 1112-1118.

[12] Urbanucci A, Barfeld SJ, Kytola V,etal. Androgen receptor deregulation drives bromodomain-mediated chromatin alterations in prostate cancer[J]. Cell Rep, 2017, 19(10): 2045-2059.

[13] Szabo R, Netzelarnett S, Hobson JP,etal. Matriptase-3 is a novel phylogenetically preserved membrane-anchored serine protease with broad serpin reactivity[J].Biochem J,2005,390(1):231-242.

[14] Lee MH, Vosburgh E, Anderson K,etal. Deficiency of plasma plasminogen activator inhibitor 1 results in hyperfibrinolytic bleeding[J]. Blood, 1993, 81(9): 2357-2362.

[15] Planus E, Barlovatzmeimon G, Rogers RA,etal. Binding of urokinase to plasminogen activator inhibitor type-1 mediates cell adhesion and spreading[J]. J Cell Sci, 1997, 110 (9): 1091-1098.

[16] Rivas-Ortiz CI,Lopez-Vidal Y,Arredondo-Hernandez LJR,etal.Genetic Alterations in Gastric Cancer Associated with Helicobacter pylori Infection[J].Front Med,2017,4:47.

[17] Klimczak-Bitner AA, Kordek R, Bitner J,etal. Expression of MMP9, SERPINE1 and miR-134 as prognostic factors in esophageal cancer[J]. Oncol Lett, 2016, 12(5): 4133-4138.

[18] Wang T, Xu H, Liu X,etal. Identification of key genes in colorectal cancer regulated by miR-34a[J]. Med Sci Monit, 2017, 23: 5735-5743.

[19] Yildirim ME, Karakus S. The association of plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) level and PAI-1 4G/5G gene polymorphism with the formation and the grade of endometrial cancer[J]. Biochem Genet, 2017, 55(4): 314-321.

[20] Pavon MA, Arroyo-Solera I, Cespedes MV,etal. uPA/uPAR and SERPINE1 in head and neck cancer: role in tumor resistance, metastasis, prognosis and therapy[J]. Oncotarget, 2016, 7(35): 57351-57366.

[21] Chong DQ, Shan JL, Yang CS,etal. Clinical prognostic value of A FOXM1 related long non-coding RNA expression in gastric cancer[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2018, 22(2): 417-421.

[22] Maeda M, Yamashita S, Shimazu T,etal. Novel epigenetic markers for gastric cancer risk stratification in individuals after Helicobacter pylori eradication[J].Gastric Cancer,2018,(1113-1124):1-11.