唐 丹,張劍彬,郭繼光,陳 莉,段雪蓮

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院腎內(nèi)科,重慶 402160;*通訊作者,E-mail:906062731@qq.com)

特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)是成人腎病綜合征的常見病因,根據(jù)國內(nèi)外的相關(guān)報道,特發(fā)性膜性腎病約占原發(fā)性腎病綜合征的1/3,居于首位[1]。經(jīng)過免疫治療后仍有相當(dāng)部分的患者不能緩解,最后進展到終末期腎病。關(guān)于特發(fā)性膜性腎病的發(fā)病機制仍未完全闡明,且缺乏敏感而特異的檢測指標(biāo)。近年來,有研究發(fā)現(xiàn)細胞免疫紊亂可能在特發(fā)性膜性腎病發(fā)病機制中起了重要作用[2]。

Th17、Treg是近年來發(fā)現(xiàn)的有別于Th1、Th2的CD4+輔助性T細胞亞群,二者維持相對平衡在調(diào)節(jié)機體免疫耐受、抗排斥反應(yīng)、感染、腫瘤、炎癥等多種疾病中發(fā)揮重要作用[3]。大量的研究表明[4,5],Th17及其主要分泌物IL-17在狼瘡性腎炎、新月體性腎炎、增殖性腎小球腎炎等的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。TNF-α是存在于T淋巴細胞、腎小球系膜細胞內(nèi)的多效細胞因子,現(xiàn)已證實其可導(dǎo)致腎小球結(jié)構(gòu)和功能的嚴重破壞。TGF-β1是促進人類Treg細胞分化的重要細胞因子,Treg維持體內(nèi)免疫平衡主要依靠接觸抑制或分泌抗炎因子(如IL-10、TGF-β1)起作用。研究發(fā)現(xiàn),特發(fā)性膜性腎病患者外周血Treg細胞百分比較正常對照組顯著降低,使用免疫抑制劑治療后外周血Treg細胞百分比升高與臨床療效有密切關(guān)系[6]。

環(huán)孢素A(cyclosporine A,CsA)是一種具有高選擇性的強效免疫抑制劑,可有效抑制T淋巴細胞增殖和活化,目前有報道[7,8]指出在自身免疫性疾病中使用CsA對Th17/Treg存在重要影響,且Th17/Treg變化可能與療效有關(guān)。本研究旨在探討Th17/Treg在特發(fā)性膜性腎病患者環(huán)孢素A治療前后的變化及其與預(yù)后的關(guān)系,以進一步探討環(huán)孢素A作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2015-09～2016-10期間確診的特發(fā)性膜性腎病患者24例作為觀察組,年齡分布為20-77歲,平均年齡為(48.83±4.92)歲,其中男性15例,女性9例。所有患者經(jīng)腎活檢病理學(xué)診斷為膜性腎病,且尿蛋白定量≥4 g,并排除其他繼發(fā)性膜性腎病的可能。觀察組予以氫化潑尼松[0.5 mg/(kg·d)]聯(lián)合環(huán)孢素A[3-5 mg/(kg·d)]治療,同時監(jiān)測環(huán)孢素A血藥濃度達標(biāo)(100-180 ng/ml)。另外選擇12例與觀察組在年齡、性別相匹配的健康志愿者12例作為健康組,其中男性7例,女性5例,并排除相關(guān)免疫性疾病和近期感染史。所有患者及志愿者均自愿簽署知情同意書,表示愿意完全理解并配合本次研究。

納入標(biāo)準:①年齡≥18歲,性別不限;②經(jīng)腎活檢病理學(xué)診斷為特發(fā)性膜性腎病,且尿蛋白定量≥4 g;③初次診斷IMN,未使用過環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素A等細胞毒藥物或免疫抑制劑。排除標(biāo)準:①同時存在感染、腫瘤、高血壓及糖尿病等患者,②妊娠患者。

根據(jù)KDIGO指南危險分級方法對觀察組進行危險程度分級:①中危組:腎功能正常,6個月內(nèi)蛋白尿>4 g/24 h但<8 g/24 h;②高危組:腎功能不全或腎萎縮,蛋白尿>8 g/24 h。以24 h尿蛋白定量作為療效評價指標(biāo)。

經(jīng)環(huán)孢素治療6月后,根據(jù)2014中國成人腎病綜合征免疫抑制治療專家共識將觀察組分兩組。有效組:①完全緩解(complete remission,CR):24 h尿蛋白定量<0.3 g或尿蛋白/血肌酐<300 mg,腎功能正常,人血白蛋白>35 g/L,尿蛋白定性陰性；②部分緩解(partial remission,PR):24 h尿蛋白定量>0.3 g,但<3.5 g;或uPCR在300-3 500 mg/g;或24 h尿蛋白定量比基線水平下降50%且腎功能穩(wěn)定(血肌酐較基線水平上升<20%)。無效組:①未緩解(no remission,NR):24 h尿蛋白定量>3.5 g,且下降幅度小于基線水平的50%；②復(fù)發(fā)(relapse):經(jīng)治療后緩解的患者重新出現(xiàn)24 h尿蛋白定量>3.5 g,或uPCR>3 500 mg/g。

1.2 方法

分別采集觀察組與健康組治療前、治療6個月后的空腹靜脈血8-20 ml,抽血后在2 h內(nèi)進行血漿和細胞分離,采用全自動生化法檢測患者血清ALB、24 h尿蛋白,采用酶聯(lián)免疫法檢測IL-17、TNF-α、TGF-β1,采用流式分析法檢測血清Th17細胞百分比、Treg細胞百分比。

1.2.1 流式細胞術(shù) 提取外周血PBMCS,調(diào)整細胞濃度為2×106-2×108/ml后,加入培養(yǎng)基,放入37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)5 h后收集細胞,進行表面標(biāo)記和胞內(nèi)標(biāo)記的熒光染色。所有標(biāo)本均采用人anti-human CD4-FITC進行表面標(biāo)記,其中Treg細胞加入anti-human CD25-FITC進行表面標(biāo)記,待孵化完成,采用專用破膜劑破膜,最后加入anti-human Foxp3-PE 5 μl/test進行胞內(nèi)標(biāo)記染色,上機檢測;Th17細胞加入anti-human IL-17-PE進行胞內(nèi)標(biāo)記染色后上機。

1.2.2 外周血IL-17、TNF-α和TGF-β含量檢測 取外周血血清樣本,加入緩沖液配置為樣品液,與標(biāo)準液分別加入檢測孔中,BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測各組上清液的蛋白濃度。按ELISA檢測試劑盒說明書操作流程檢測外周血IL-17、TNF-α和TGF-β1的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 特發(fā)性膜性腎病患者的一般情況

經(jīng)入選的特發(fā)性膜性腎病患者和健康志愿者在性別、年齡方面經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1入組對象一般資料比較

Table1Baselinedataoftheenrolledstudysubjects

項目n性別(男/女)年齡(歲)病程(月)觀察組2415/948.21±8.6911.85±10.26健康組127/548.55±5.82-

2.2 觀察組與健康組細胞因子對比

觀察組Th17細胞百分比較健康組顯著升高(P<0.05),Treg細胞百分比較健康組明顯降低(P<0.05)。觀察組相關(guān)細胞因子濃度IL-17和TNF-α較健康組高(P<0.05)，而TGF-β1則低于健康組(P<0.05,見表2)。

表2觀察組與健康組外周血細胞因子對比

Table2ComparisonofperipheralbloodcytokinesbetweenIMNpatientsandhealthycontrols

組別nIL-17(pg/ml)TNF-α(pg/ml)TGF-β1(pg/ml)Th17百分比Treg百分比Th17/Treg觀察組2456.02±9.54149.80±13.09678.14±238.491.15±0.621.26±0.481.15±0.33健康組1243.6±8.8136.51±7.79947.51±298.420.77±0.221.67±0.520.41±0.18t-4.3213.719-5.155.253-5.5314.414P0.0000.0010.0000.0000.0000.000

2.3 特發(fā)性膜性腎病危險程度分層與外周血Th17和Treg細胞水平的關(guān)系

根據(jù)24 h尿蛋白水平將觀察組分為中危和高危組,將其分別與健康組比較。表3結(jié)果顯示,與健康組相比,中危組和高危組患者外周血Th17細胞百分比、IL-17、TNF-α及Th17/Treg均顯著升高(P<0.05),而外周血Treg細胞百分比顯著下降(P<0.05),且這種變化在高危組中尤為顯著;與中危組相比,高危組外周血Th17細胞百分比、IL-17、TNF-α及Th17/Treg均顯著升高(P<0.05),外周血Treg細胞百分比顯著下降(P<0.05)。

表3不同危險程度IMN患者外周血Th17和Treg細胞水平

Table3PeripheralTh17,TregcellandrelevantcytokineslevelsinIMNpatientsstratifiedbyrisklevel

組別nIL-17(pg/ml)TNF-α(pg/ml)TGF-β1(pg/ml)Th17百分比Treg百分比Th17/TregIMN中危組1552.78±7.54* 137.23±15.09*692.21±248.28*0.96±0.54*1.33±0.46*1.75±0.62*IMN高危組959.33±9.22*#155.69±17.29*#574.22±197.15*#1.82±0.60*#1.12±0.41*#0.77±0.54*#健康組 1243.6±8.81 36.51±7.79947.51±298.420.77±0.221.67±0.520.41±0.18

與健康組相比,*P<0.05;與中危組相比,#P<0.05

2.4 特發(fā)性膜性腎病患者24 h尿蛋白水平與外周血Th17和Treg細胞水平的線性相關(guān)分析

IMN患者24 h尿蛋白水平與外周血Th17百分比呈顯著正相關(guān)(r=0.741 6),與Th17/Treg比值呈顯著正相關(guān)(r=0.845 9),與外周血Treg百分比呈負相關(guān)(r=0.841 5,見圖1)。

圖1 特發(fā)性膜性腎病患者24 h尿蛋白水平與外周血Th17和Treg細胞水平的線性相關(guān)分析 Figure 1 Correlation analysis between 24 h urinary protein level and percentages of Th17, Treg and Th17/Treg ratio in IMN patients

2.5 IMN患者在CSA治療前后臨床指標(biāo)及外周血Th17、Treg細胞百分比、Th17/Treg的變化

使用環(huán)孢素A治療6個月后,根據(jù)血清Alb及24 h尿蛋白定量水平分為有效組和無效組,有效組治療后不僅24 h尿蛋白水平明顯下降(P<0.05),血清Alb水平上升,而且外周血Th17百分比和IL-17、TNF-α水平降低(P<0.05),外周血Treg百分比及TGF-β1升高(P<0.05);無效組治療前后不僅24 h尿蛋白定量及血清Alb水平無明顯變化(P>0.05),而且外周血Th17百分比和IL-17、TNF-α水平、外周血Treg百分比及TGF-β1上述改變也不明顯(P>0.05,見表4)。

表4CSA治療IMN前后臨床指標(biāo)和外周血Th17、Treg及其相關(guān)細胞因子的變化

Table4ChangesinclinicalparametersandperipheralTh17,TregandrelevantcytokinesinIMNpatientsbeforeandafterCsAtreatment

組別時間24 h尿蛋白(g/24 h)Alb(g/L)IL-17(pg/ml) TNF-α(pg/ml) TGF-β1(pg/ml) Th17百分比 Treg百分比 Th17/Treg 有效組治療前 6.82±3.29 29.44±4.91 52.9±10.4 123.8±7.91654.21±158.23 1.05±0.46 1.11±0.60 0.99±0.48(n=18)治療后 4.64±2.13* 32.21±6.50* 43.15±7.34* 81.0±6.50*869.15±369.21* 0.81±0.60* 1.64±0.39* 0.45±0.22*無效組治療前 9.06±2.35 23.44±3.24 63.43±8.65 179.5±12.60592.54±394.21 1.38±0.60 0.88±0.39 1.57±0.44(n=6)治療后 8.75±3.35 24.48±4.09 61.63±12.08 175.0±5.14664.28±360.15 1.36±0.51 0.91±0.41 1.47±0.37

與治療前相比,*P<0.05

3 討論

特發(fā)性膜性腎病(IMN)的發(fā)病機制是循環(huán)中的自身抗體識別腎小球足細胞的靶抗原,抗原與抗體結(jié)合后在上皮下形成免疫復(fù)合物,激活補體形成膜攻擊復(fù)合物,引起基底膜和腎小球濾過屏障受損[9],但迄今為止尚未找到可用于臨床監(jiān)測IMN患者體內(nèi)免疫活動的生物學(xué)標(biāo)記。近年來研究發(fā)現(xiàn)IMN患者體內(nèi)存在多種免疫活性細胞數(shù)量的變化,表現(xiàn)為Treg的減少,B細胞的增加和CD4/CD8比值升高[10],同時發(fā)現(xiàn)特發(fā)性膜性腎病患者體內(nèi)外周血ICOS(+)和PD-1(+) Tfh細胞水平顯著升高,外周血ICOS(+)/PD-1(+) Tfh cells比值和IL-21(+) Tfh水平與膜性腎病的病情進展密切相關(guān),提示細胞免疫紊亂可能在特發(fā)性膜性腎病發(fā)病機制中起了重要作用,T/B淋巴細胞免疫失調(diào)可作為預(yù)測IMN病情進展的指標(biāo)。Masutani等[11]通過流式細胞術(shù)定量分析各細胞亞群的比值,發(fā)現(xiàn)IMN患者IL-4+T細胞較對照組顯著升高,Th1/Th2的比值較對照組顯著降低,且血清IL-4水平與尿蛋白量顯著相關(guān),證實以Th1下調(diào)和Th2極化占優(yōu)勢的T淋巴細胞免疫反應(yīng)改變了機體的免疫平衡穩(wěn)態(tài),可能促進了IMN的發(fā)生。Treg和Th17細胞是有別于Th1和Th2的兩類CD4+T細胞亞群,Th17/Treg的平衡對維持免疫穩(wěn)態(tài)、預(yù)防自身免疫性疾病有著重要作用。因而,我們探索性研究調(diào)節(jié)性T細胞和Th17細胞失衡在IMN發(fā)病中的作用及其在CSA治療后的變化,以期從免疫炎癥調(diào)節(jié)失衡的角度指導(dǎo)IMN病情評估及臨床療效判斷。

本研究發(fā)現(xiàn)膜性腎病患者體內(nèi)血清IL-17、TNF-α及Th17百分比明顯高于正常對照組,而外周血Treg百分比及TGF-β1水平明顯下降,這可能提示嚴重的T淋巴系統(tǒng)依賴性免疫缺陷可能存在于IMN患者中,外周血Treg細胞的減少和Th17細胞增多導(dǎo)致的Th17/Treg免疫失衡可能與IMN的疾病進展密切相關(guān)[12]。Treg在T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中起負性調(diào)節(jié)作用,抑制CD4+T淋巴細胞的增殖以及細胞因子(主要是IL-2)的分泌,此外Treg可以抑制抗原呈遞細胞對Th細胞的活化,抑制Th活化B細胞的作用,抑制B細胞產(chǎn)生自身抗體,從而減輕組織中免疫復(fù)合物介導(dǎo)的損傷[13]。因此,Treg細胞的下調(diào)可能激活免疫系統(tǒng),誘發(fā)IMN患者病理反應(yīng)。Th17為近年新發(fā)現(xiàn)的重要的CD4+輔助T細胞亞群,Th17細胞可特異性表達核轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒受體γT(RORγT),分泌IL-17,TNF-α,IL-6及IL-23,參與了炎癥反應(yīng)和組織損傷過程[14]。Th17細胞分泌的細胞因子可以共同動員,收集和激活嗜中性粒細胞并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)可以防止組織壞死和貧血,但如果反應(yīng)過強,可能會導(dǎo)致組織破壞和免疫功能障礙。因此,Treg與Th17的相對平衡對于維持免疫耐受和預(yù)防炎性損傷至關(guān)重要[15,16].本研究結(jié)果顯示IMN患者體內(nèi)外周血Th17細胞和血清IL-17、TNF-α及IL-6水平升高,提示IMN啟動了Th17型免疫應(yīng)答的發(fā)生,可能通過IL-17、TNF-α等促炎因子的釋放引起腎臟局部組織炎癥,故本研究認為Th17細胞上調(diào)和Treg細胞下調(diào)可能通過免疫介導(dǎo)的損傷導(dǎo)致IMN的進展。

24 h尿蛋白是臨床上判定特發(fā)性膜性腎病預(yù)后的指標(biāo),高24 h尿蛋白通常提示特發(fā)性膜性腎病患者預(yù)后不良。進一步的亞組分析,本研究發(fā)現(xiàn)Treg/Th17細胞失衡與24 h尿蛋白量呈線性相關(guān),且Th17/Treg失衡程度與患者24 h尿蛋白量呈正相關(guān),從而提示Th17/Treg失衡程度可能與疾病預(yù)后相關(guān)聯(lián)。因此,以減少Th17/Treg引起的免疫失衡為目的免疫治療可能對IMN患者有保護作用。

環(huán)孢素A是治療膜性腎病的常用藥物之一,可作為特發(fā)性膜性腎病的初始治療,也在其他藥物治療無效時使用。其減少蛋白尿的主要機制是抑制免疫反應(yīng),選擇性抑制T細胞活化,抑制IL-2的產(chǎn)生,同時抑制鈣調(diào)磷酸酶,阻斷其誘導(dǎo)的突觸足蛋白脫磷酸作用,對腎臟足細胞的細胞骨架起到穩(wěn)定作用,從而使蛋白降低[17]。目前報道[18]指出在自身免疫學(xué)疾病及器官移植術(shù)后CsA的使用對Th17/Treg存在重要影響,且可能與療效有關(guān)。本研究通過檢測特發(fā)性膜性腎病患者治療前后體內(nèi)Th17/Treg變化,發(fā)現(xiàn)有效組使用環(huán)孢素A治療IMN患者后,患者體內(nèi)Th17明顯下降,Treg較治療前明顯升高,提示環(huán)孢素A可能通過調(diào)節(jié)機體Th17/Treg免疫失衡影響患者的療效與預(yù)后。同時本研究還發(fā)現(xiàn),環(huán)孢素A治療無效組患者Th17/Treg變化不明顯,提示Th17/Treg可作為判斷病情緩解和預(yù)后的重要指標(biāo)。但是,由于本研究樣本量偏少,仍待進一步的大樣本試驗深入研究。

綜上所述,特發(fā)性膜性腎病患者存在外周血Th17/Treg失衡,并且與病情嚴重程度相關(guān);環(huán)孢素A治療特發(fā)性膜性腎病可有效改善外周血Th17/Treg免疫失衡,其失衡改善程度與Th17/Treg失衡程度相關(guān);監(jiān)測特發(fā)性膜性腎病患者外周血Treg、Th17含量變化對指導(dǎo)病情評估及臨床治療療效有重要意義。

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