多時間點觀察電針“委中”對大鼠腰多裂肌損傷后IGF1R和IGFBP3的表達

盧宗孝 晏珺 于雪 陳冬荔 鄒德輝 陳玉佩 許玥 張佳怡 白玉琢 張莉 霍則軍

摘要 目的：研究多時間點電針“委中”穴對大鼠腰多裂肌損傷后1型胰島素樣生長因子受體（IGF1R）和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3（IGFBP3）的表達。方法：選取90只雄性SD大鼠并將其隨機分成空白組、模型組、電針委中組，每組30只，模型組和電針委中組腹腔麻醉后往雙側(cè)L4-5多裂肌注射0.5%布比卡因溶液制造多裂肌損傷模型，空白組不做處理，造模后電針委中組行1次/d電針委中穴治療，3組分別于治療后1 d、2 d、3 d、7 d、14 d后同步取材，通過Western Blotting法觀察多裂肌中IGF1R、IGFBP3的表達動態(tài)變化。結(jié)果：治療后2 d、3 d、7 d、14 d模型組IGF1R的表達高于空白組（P<0.05）；治療后1 d、2 d電針委中組IGF1R的表達高于模型組（P<0.05）。治療后7 d、14 d模型組IGFBP3表達高于空白組；治療后2 d、14 d電針委中組IGFBP3表達低于模型組。結(jié)論：電針委中穴可在早期增加IGF1R的表達，并下調(diào)IGFBP3的表達，促進多裂肌損傷后的修復。

關(guān)鍵詞 多裂??；電針；委中；1型胰島素樣生長因子受體；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3

Abstract Objective：To observe the effects of electro-acupuncture at BL 40 on the expression of the type 1 IGF receptor （IGF1R） and IGF binding protein 3 （IGFBP3） in rats with multifidus muscle injury.Methods：A total of 90 male Sprague Dawley rats were randomly divided into blank group （BG），model group （MG） and BL 40 electro acupuncture group （WG），with 30 rats in each group.Then the rats in MG and WG were injected with 0.5% bupivacaine into both sides of L4-5 multifidus muscle.After model establishment，the rats in WG accepted electro-acupuncture once a day.The changes of IGF1R and IGFBP3 in 3 groups′ multifidus muscle were observed and analyzed at 1st，2nd，3rd，7th and 14th day.Results：The expression of IGF1R at day 2，3，7，14 was higher than BG （P<0.05），while WG was higher than MG at day 1 and day 2.The MG′s expression of IGFBP3 was higher than BG′s at day 7 and day 14.Compared with MG，the expression of IGFBP3 in WG decreased at day 2 and day 14.Conclusion：Electro-acupuncture at BL 40 could increase the expression of IGF1R and decrease the expression of IGFBP3，so as to promote the regeneration of tissue after multifidus muscle injury.

Key Words Electro-acupuncture； Multifidus muscle； BL 40； Type 1 IGF receptor； IGF binding protein 3

中圖分類號：R245；R287.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.040

2017年美國醫(yī)師學會（ACP）發(fā)表的《急性、亞急性及慢性腰痛的無創(chuàng)治療臨床實踐指南》中，針灸等多種非藥物治療被推薦為一線療法，其中針灸是唯一被推薦的急性與慢性腰痛治療均可選用的一線療法[1]。在療效認可的同時，非常有必要進一步挖掘針灸治療腰痛的作用機制。

多裂肌位于脊柱最內(nèi)側(cè)，能參與脊柱的背伸運動，保證椎體的緊密連接，分配所受壓力，其在腰部比較發(fā)達，對維持腰椎的穩(wěn)定性尤為重要，而腰部多裂肌損傷或功能紊亂可導致各種急慢性腰痛[2-3]，因此，促進腰多裂肌的修復和功能重建對治療腰痛有重要的作用[4]。胰島素樣生長因子1（IGF1）是能有效促進骨骼肌的損傷修復。前期實驗證明，電針委中穴可以促進布比卡因引起的腰多裂肌損傷后的再生修復，同時伴隨IGF1的高表達，因此考慮針刺促進骨骼肌再生修復與IGF1的高表達相關(guān)。IGF1是通過與其受體IGF1R發(fā)揮其生物學作用的，而胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3（IGFBP3）則是可以調(diào)節(jié)IGF1生物活性的重要蛋白。因此，本實驗擬以布比卡因致大鼠腰部多裂肌損傷為模型，設(shè)置多個時間點動態(tài)觀察電針委中穴對模型大鼠腰多裂肌IGF1R及IGFBP3表達的時間規(guī)律，探討針刺促進骨骼肌再生修復的作用靶點和部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康成年雄性SD大鼠90只，體重290～320 g。由北京維通利華實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（京）2012-0001。隨機分籠飼養(yǎng)，明暗周期12 h，自由飲食和飲水，環(huán)境溫度24 ℃，濕度40%～50%，適應性飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 試劑與儀器

主要儀器：半自動化石蠟切片機（RM2245，德國萊卡儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）；正置智能型顯微鏡及采集系統(tǒng)（BX53，奧林巴斯中國有限公司）；韓式電針儀（HANS200A，北京思盛達醫(yī)療器械中心）；蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；FluorChem FC2凝膠成像系統(tǒng)（美國Alpha Innotech公司）。

主要試劑：布比卡因鹽酸鹽（美國sigma公司）；10%水合氯醛（北京歐北生物科技有限公司）；40%多聚甲醛溶液（北京蘭博利德）；蛋白Marker（美國Thermo公司）；Glycine甘氨酸（美國VWR公司）；一抗稀釋液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；IGF1R兔抗體（Abcam公司）；IGFBP3（美國Proteintech公司）；GAPDH鼠抗體（美國Proteintech公司）；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；ECL發(fā)光液（英國GE Healthcare公司）；PVDF膜（美國MLIPLE公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

分組采用完全隨機方法將大鼠分成空白組、模型組和電針委中組，每組30只，各組再隨機分成5個時間點（治療1 d、2 d、3 d、7 d、14 d），每個時間點6只。

造模采用一次性局部肌內(nèi)注射布比卡因建立大鼠多裂肌的損傷模型。造模前，10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔麻醉，背部備皮，操作過程保持無菌。選擇雙側(cè)脊柱L4、L5水平兩旁的4個點，使用一次性4號針頭注射器抽取0.5%布比卡因溶液，針頭緊貼棘突旁進入肌肉，直到接觸關(guān)節(jié)突和乳突所在的骨面回抽套管1 mm無血，表明針頭已到達多裂肌，后注射布比卡因溶液400 μL（100 μL×4），時間不得<3 s，以利于藥物的吸收[5]。

1.2.2 干預方法 電針委中組從造模后第1 d開始電針“委中”穴干預，將大鼠固定在操作臺上，暴露雙后肢。采用華佗牌0.30 mm×13 mm一次性針灸針，直刺3 mm，針刺后連接韓式電針儀HANS-100B，電針儀負極接大鼠左側(cè)委中穴，正極接大鼠右側(cè)委中穴，2/100 Hz的疏密波，電流1 mA，持續(xù)20 min，1次/d，治療持續(xù)至取材前1 d。參照《實驗針灸學》[6]常用實驗動物穴位圖譜，選取雙側(cè)“委中穴”（膝關(guān)節(jié)背面正中）。模型組與電針委中組同步抓取、固定，不做其他處理?？瞻捉M不做任何治療。3組在治療后1 d、2 d、3 d、7 d、14 d同步取材（每組各6只）。

1.2.3 檢測指標與方法

HE染色觀察腰多裂肌橫斷面形態(tài)學變化：使用4%多聚甲醛溶液固定腰多裂肌48 h以上，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，再對切片進行二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木精伊紅（HE）染色，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，伊紅液染色，透明，封固。最后在光鏡下觀察腰多裂肌橫斷面形態(tài)學變化。

Western Blotting法測定IGF1R、IGFBP3含量：取-80 ℃冰箱的多裂肌組織，加入RIPA裂解液低溫勻漿后取上清液，后加入5×上樣緩沖液，沸水煮樣后冰中迅速降溫。將提前制好的10%丙烯酰胺凝膠置于電泳槽中，100 V電泳（Marker上樣5 μL，其余10 μL上樣），再75 V電轉(zhuǎn)75 min。搖床封閉90 min，TBST洗膜10 min，按Marker剪膜，加入一抗（IGF1R按1∶1 000稀釋；IGFBP3按1∶500稀釋；GAPDH按1∶10 000稀釋）室溫孵育60 min，TBST洗5次各5 min，加入二抗（1∶5 000稀釋），TBST洗5次各5 min，ECL顯色并曝光，最后得到的X線片采用FC2（Alpha Innotech Fluor Chem）凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并定量分析IGF1R、IGFBP3的吸光度（A），取各指標與GAPDH的吸光度比值進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，每組樣本數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，用單因素方差分析，2組間比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腰多裂肌橫斷面組織形態(tài)學變化 空白組肌細胞大小均勻，肌間隙均勻，排列整齊，細胞核均勻排布于肌細胞邊緣；治療1 d，模型組與電針委中組均出現(xiàn)肌間隙增大，并有大量炎性細胞浸潤，但模型組肌細胞大小不均，部分甚至破裂，而電針委中組肌細胞大小尚均勻，少有破裂；治療3 d，模型組與電針委中組均可見較多新生的中央核纖維生成，但模型組仍可見較多炎性細胞浸潤，而電針委中組的炎性細胞較少；治療7 d，模型組可見炎性細胞與大量新生的中央核纖維，而電針委中組較多的新生肌纖維的細胞核已經(jīng)遷移到細胞邊緣并恢復大小，呈現(xiàn)規(guī)則的多邊形。見圖1。

2.2 Western blotting測量IGF1R、IGFBP3的表達

2.2.1 3組大鼠腰多裂肌IGF1R表達比較 治療1 d后，模型組與空白組大鼠腰多裂肌IGF1R表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），電針委中組的表達高于空白組和模型組（P<0.05）；治療2 d后，模型組高于空白組（P<0.05），電針委中組的表達高于空白組和模型組（P<0.05）；治療后第3 d、7 d、14 d，模型組與電針委中組的IGF1R的表達均高于空白組（P<0.05），電針委中組IGF1R表達與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2.2 3組大鼠腰多裂肌IGFBP3表達比較 治療1 d后，3組大鼠腰多裂肌IGFBP3表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但電針委中組的表達量已有下降趨勢；治療2 d后，模型組與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），電針委中組的表達量低于空白組與模型組（P<0.05）；治療7 d后，模型組的表達量高于空白組（P<0.05）；治療14 d后，模型組的表達量高于空白組（P<0.05），而電針委中組的表達量低于模型組（P<0.05）。見表2和圖2～4。

3 討論

我國每年有約22%的人承受腰痛的折磨[7]，而腰痛患者常常伴隨多裂肌的萎縮及脂肪浸潤[8]，故促進多裂肌的損傷修復對治療腰痛有重要作用?！端目傃ǜ琛酚洝把澄星蟆保醒樽闾柊螂捉?jīng)合穴與下合穴，體現(xiàn)了“經(jīng)脈所過，主治所及”的治療思路，是治療腰痛的寶貴臨床經(jīng)驗總結(jié)。故本實驗從委中穴與多裂肌的損傷修復為著眼點探求其作用機制。

IGFs系統(tǒng)包括生長因子，受體與結(jié)合蛋白，為探索不同時期IGF1R與IGFBP3的表達規(guī)律，本實驗設(shè)置了多個時間點。其中IGF1是骨骼肌損傷修復過程中重要的生長因子。骨骼肌損傷后，炎性細胞除釋放炎性因子外[9]，亦可表達IGF1，另外損傷的骨骼肌自身亦可以表達IGF1。IGF1能促進細胞增殖分化，并抑制凋亡[10-11]，從而促進骨骼肌再生。肖衛(wèi)華等[12]觀察了小鼠腓腸肌鈍挫傷后1 d、3 d、7 d、14 d 4個時間點IGF1mRNA的變化，發(fā)現(xiàn)IGF1 mRNA在損傷后第1天開始已經(jīng)顯著增加，并于第3天達到峰值，說明在骨骼肌損傷的較早期，IGF1已經(jīng)大量分泌。方憶生等[11]用電針委中穴治療大鼠腰頓挫傷14 d，委中組的IGF1的表達顯著高于模型組。以上都說明了電針委中穴可以提高IGF1在多裂肌損傷修復過程中的表達。

IGF1R是IGF1發(fā)揮作用的關(guān)鍵蛋白，IGF1只有與IGF1R結(jié)合后，激活MEK/ERK1/2等信號通路才可促進肌纖維的再生和修復[13-14]。誘導基因敲除IGF1R的小鼠其肌肉的再生會受到嚴重影響[15]。本實驗在治療1 d與2 d后，電針委中組的IGF1R表達顯著高于模型組，這明確了IGF1在多裂肌損傷修復過程中的重要作用。但隨著時間增加（治療3 d后），電針委中組IGF1R的表達維持在同一高水平，模型組的IGF1R的表達逐步上升，電針委中組IGF1R雖高于模型組，但無明顯差異。這說明電針委中治療能在多裂肌損傷早期提升IGF1R的表達，或者說是電針委中穴能在時間上加速IGF1R的表達，使IGF1更快地發(fā)揮作用，加速了多裂肌的損傷修復的進程。

IGF1在細胞外液中能與特異性的結(jié)合蛋白結(jié)合。結(jié)合蛋白以IGFBP3為主，IGFBP3與IGF1的親和力高于IGF1與其受體的親和力，因此IGFBP3可以通過與IGF1R競爭結(jié)合IGF1，從而阻滯了IGF1與受體結(jié)合，進而抑制IGF1的活性發(fā)揮[16]。在本實驗中，治療2 d與14 d后，電針委中組的IGFBP3表達低于模型組，說明電針委中穴能下調(diào)IGFBP3的表達，從而增加IGF1的活性，有利于多裂肌的再生修復。

另外，在本實驗中隨著時間增加，模型組與電針委中組IGFBP3均呈現(xiàn)出了逐漸上升趨勢。其中原因考慮與多裂肌損傷修復過程中IGF1的高表達相關(guān)。有研究表明，人血清中IGFBP3與IGF1的表達呈正相關(guān)，IGFBP3能夠有效反映體內(nèi)IGF1的總體水平[17]。張小輝等[18]研究發(fā)現(xiàn)，牛肌肉組織中IGFBP3與IGF1的表達均隨著月齡的增加而降低，兩者的表達趨勢基本相同。

目前有研究表明，IGFBP3還存在非IGF1依賴途徑，可以通過細胞膜上IGFBP3特異性受體獨立發(fā)揮作用，阻斷細胞增殖、促進細胞凋亡[19]。在本實驗中，穴雖然能下調(diào)腰多裂肌中IGFBP3的表達，但是電針委中是否影響了IGFBP3的非IGF1依賴途徑，尚有待研究。

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