韓姝然 盧磊

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040）

漆酶是一種多酚氧化酶，其底物范圍十分廣泛，可以氧化多種酚類和非酚類有機(jī)化合物，在有機(jī)污染物降解及廢水處理等方面均有廣闊的應(yīng)用前景［1-3］。然而，由于其生產(chǎn)成本高、穩(wěn)定性差，易在環(huán)境中失去活性，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。利用多種方法固定化漆酶，可以有效地提高漆酶的穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性，降低使用成本，并能夠通過測定其最終酶活回收率的高低來衡量其效果［4］。固定化漆酶與游離酶相比，適應(yīng)的溫度及pH值范圍更加廣泛，穩(wěn)定性更好。

酶的固定化一般通過載體的共價連接、吸附或包埋來實(shí)現(xiàn)。近年來逐漸發(fā)展出無載體固定化技術(shù)。2000年，荷蘭Delft大學(xué)的Sheldon研究組提出一種用鹽、有機(jī)溶劑或非離子聚合物等沉淀劑沉淀酶蛋白，得到酶聚集體，再用交聯(lián)劑交聯(lián)的無載體固定化方法——交聯(lián)酶聚集體（Cross-linked enzyme aggregates，CLEAs）技術(shù)［5］。CLEAs技術(shù)與傳統(tǒng)固定化技術(shù)相比，具有制備過程簡便、高酶活回收率和高有機(jī)溶劑耐受性等優(yōu)點(diǎn)，且這種方法不需要使用高純度的酶而受到廣泛關(guān)注［6］。目前已應(yīng)用于包括漆酶等多種工業(yè)酶的固定化，本文對CLEAs的制備、影響因素及在漆酶固定化中的應(yīng)用等方面做了介紹，為進(jìn)一步研究CLEAs開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 制備CLEAs的影響因素

1.1 沉淀劑的種類及濃度

通常形成CLEAs包括兩個步驟，首先利用沉淀劑使酶物理聚集，然后通過交聯(lián)劑進(jìn)一步建立酶之間的化學(xué)鍵。通常，在酶溶液中加入鹽、有機(jī)溶劑或非離子聚合物就可以通過改變分子狀態(tài)或改變?nèi)芤旱撵o電常數(shù)來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子的聚集［7］。由于交聯(lián)過程一般會導(dǎo)致酶活損失，因此選擇效果良好的沉淀劑有助于后續(xù)工業(yè)中保持較好的酶活回收率［8］。Perzone等［9］考察了不同沉淀劑（NH4）2SO4、聚乙二醇（PEG）和正丁醇對纖維素酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)PEG是最有效的沉淀劑，酶活回收率最高為29%，而使用正丁醇時會導(dǎo)致酶完全失活。Bilal等［10］采用丙酮、（NH4）2SO4、乙醇、2-丙醇和叔丁醇等多種沉淀劑沉淀Ganoderma lucidumIBL-05的錳過氧化物酶。其中丙酮是最有效的沉淀劑，其酶活回收率最高為31.26%。在沉淀過程中沉淀劑的濃度也會引發(fā)酶不同程度的聚集，如果濃度過高會造成酶的活性喪失，如果濃度過低，則會使酶沉淀不充分，導(dǎo)致酶活回收率較低。Aytar等［11］在制備CLEAs過程中用（NH4）2SO4沉淀酪氨酸酶時發(fā)現(xiàn)，隨著（NH4）2SO4飽和度的增加，CLEAs的酶活回收率也隨之提高，當(dāng)（NH4）2SO4飽和度為60%時，酶活回收率達(dá)到最高，而高于60%后又逐漸降低。對于酶活較低的CLEAs來說，可能是由于使用的沉淀劑濃度不適所致，因此對沉淀劑的濃度應(yīng)當(dāng)做出合適的選擇。

1.2 交聯(lián)劑的種類、濃度及時間

交聯(lián)劑主要是通過其兩端的醛基和酶分子表面的賴氨酸發(fā)生共價結(jié)合以得到不溶的CLEAs。戊二醛（GA）是常見的交聯(lián)劑，適用于絕大多數(shù)酶［12］。然而，還有一些酶，如腈水解酶，當(dāng)使用戊二醛作為交聯(lián)劑時，可能由于戊二醛尺寸小而能夠進(jìn)入蛋白質(zhì)內(nèi)部，與催化相關(guān)的氨基酸發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致酶失活；而當(dāng)使用體積較大的多醛葡聚糖作為交聯(lián)劑時，酶活回收率可達(dá)到50%-60%［13］。CLEAs制備中的一個關(guān)鍵參數(shù)是交聯(lián)劑的濃度，因?yàn)樗鼤绊懡宦?lián)劑的活性、操作穩(wěn)定性和顆粒大?。ㄐ蚊玻erva等［14］在制備交聯(lián)阿魏酸酯酶聚集體的過程中，當(dāng)使用300 mmol/L戊二醛作為交聯(lián)劑時觀察到最大酶活回收率為68.8%，隨著濃度的增加，酶活回收率開始下降。因此戊二醛濃度應(yīng)該謹(jǐn)慎選擇，過低的濃度會導(dǎo)致酶交聯(lián)不充分，不溶性聚集體較少，導(dǎo)致操作不穩(wěn)定的CLEAs釋放游離酶進(jìn)入反應(yīng)介質(zhì)；但過高的濃度會導(dǎo)致酶分子的硬化，從而使酶的柔韌性喪失［15］。交聯(lián)過程中交聯(lián)時間對酶活影響也較大，交聯(lián)時間短，交聯(lián)不足，導(dǎo)致酶活回收率較低，操作穩(wěn)定性差；較高的交聯(lián)比有利于更快的交聯(lián)反應(yīng)，但交聯(lián)時間的延長限制了酶的柔韌性，從而造成酶活性的下降。因此，最佳交聯(lián)時間可能需要在有效交聯(lián)和酶穩(wěn)定性兩方面做出選擇［7］。在Zheng等［16］的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌酯酶的酶活回收率隨戊二醛濃度的增加而增加，并在采用濃度60 mmol/L戊二醛和3 h交聯(lián)時間時酶活回收率達(dá)到70%左右，隨著交聯(lián)時間的延長，酶活回收率下降。表明過度的交聯(lián)可能會影響活性位點(diǎn)的可用性，從而降低CLEAs的活性。Dalal等［17］在脂肪酶的交聯(lián)實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)交聯(lián)時間分別為4、6、8 h時，酶活回收率從100%降低到85%再到50%，脂肪酶CLEAs的熱穩(wěn)定性和重復(fù)使用性也隨著交聯(lián)時間的增加不斷降低?？梢?，交聯(lián)時間的長短極大地影響了CLEAs的制備。

1.3 pH值

pH在固定化酶的過程中起著重要作用，由于pH值的變化，酶會受到排斥力（靜電和分散）的影響，當(dāng)pH接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時，靜電作用力減小，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集沉淀［18］。在用戊二醛進(jìn)行蛋白質(zhì)分子交聯(lián)反應(yīng)中，主要涉及到高活性表面非質(zhì)子化的氨基與戊二醛醛基之間的相互作用［8］。Yang等［15］考察了戊二醛作為交聯(lián)劑、（NH4）2SO4和丙酮分別作為沉淀劑時不同pH值下對酶活回收率的影響。發(fā)現(xiàn)在pH值分別為8和5.5時酶活回收率最高，這是由于pH值分別影響著氨基的電荷、戊二醛的活性和聚合，從而影響交聯(lián)效率。在大多數(shù)研究中，CLEAs的制備都是在中性或微堿性pH范圍內(nèi)進(jìn)行的，這是因?yàn)槲於┰谥行詐H附近對蛋白質(zhì)具有較高的反應(yīng)活性，由于蛋白質(zhì)中存在多個反應(yīng)殘基和水溶液中戊二醛的分子形式，從而導(dǎo)致了許多不同的反應(yīng)機(jī)制［19］。因此，在考慮戊二醛的反應(yīng)活性時，還應(yīng)考慮pH值的選擇。

1.4 添加劑

在制備CLEAs時，如果酶濃度較低或酶活回收率較低時，補(bǔ)充合適的添加劑可促進(jìn)CLEAs的制備，還可以抵抗高濃度交聯(lián)劑對酶活的影響，這主要是通過提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度對酶起保護(hù)作用，防止酶的分解和非特異性吸附，減輕一些不利環(huán)境因素如加熱、表面張力及化學(xué)因素引起的變性［20］。最常用的添加劑是牛血清蛋白（BSA），Cui等［21］以牛胰脂肪酶為原料，將脂肪酶與BSA共聚合，制備了牛胰脂肪酶CLEAs。添加了BSA的脂肪酶CLEAs在重復(fù)使用8次后，保留了75%以上的初始活性，而未添加BSA的脂肪酶CLEAs僅保留了其初始活性的20%。此外，添加BSA的脂肪酶CLEAs具有更高的貯存穩(wěn)定性和可回收性，可用于不同的工業(yè)應(yīng)用。Torabizadeh等［22］用陽離子輔助法制備耐熱淀粉酶CLEAs，α-淀粉酶的聚集和交聯(lián)是在陽離子富集的非水環(huán)境中進(jìn)行的，在最佳配比下，Ca2+和Na+的加入提高了淀粉酶的活性和操作穩(wěn)定性。添加表面活性劑或胺等可以顯著提高酶活回收率，十二烷基硫酸鈉（SDS）作為表面活性劑被添加在脂肪酶CLEAs中，其催化活性提高了兩倍以上［23］。綜上，補(bǔ)充適當(dāng)?shù)奶砑觿┦且环N生產(chǎn)高活性、高穩(wěn)定性的CLEAs的有效途徑。

2 CLEAs改進(jìn)策略

近年來，CLEAs的制備方法已經(jīng)取得了非常大的進(jìn)展，然而，一些不理想的因素也限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用。如交聯(lián)效率低導(dǎo)致酶活的損失；抗壓強(qiáng)度差導(dǎo)致其在溶液中再次分解；應(yīng)用過程中回收率差等情況［7］。因此，后續(xù)發(fā)展出多種策略對CLEAs技術(shù)進(jìn)行改造。

2.1 載體共固定CLEAs

通常情況下，CLEAs粒子尺寸較小通常在10 μm以下，將其從反應(yīng)物中重新回收出來比較困難，而且對于一些工業(yè)應(yīng)用來說，CLEAs機(jī)械穩(wěn)定性不高，容易被外界壓力破壞［24］。近年來研究出一種新型載體共固定CLEAs的技術(shù)，將CLEAs與載體材料結(jié)合起來不僅可以使機(jī)械強(qiáng)度提高，還表現(xiàn)出了高存儲穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。Reshmi等［25］嘗試將β-葡萄糖苷酶吸附在中孔二氧化硅泡沫（MCF）上，然后用戊二醛對酶進(jìn)行交聯(lián)。MCFs中的CLEAs具有較高的酶活回收率和穩(wěn)定性。且易回收，重復(fù)使用10次后仍有85%活性。Park等［26］采用靜電紡絲法制得穩(wěn)定的殼聚糖納米粒子，然后將蛋清溶菌酶固定在電紡殼聚糖上制備CLEAs，室溫下保存80 d后仍有75.4%的活性，連續(xù)使用100次后仍有76%的活性，該CLEAs對四種典型致病菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、志賀氏菌、銅綠假單胞菌的抑制率都接近80%，說明固定化電紡殼聚糖溶菌酶CLEAs在抗菌性能方面有很好地應(yīng)用。由此看來，采用載體和CLEAs結(jié)合的方法為固定化酶提供了一種簡便低成本的方法，并且具有很高的穩(wěn)定性和酶活回收率，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。

2.2 多酶CLEAs

將多種酶固定在同一個基質(zhì)中，不僅降低了循環(huán)過程的成本，而且與單獨(dú)固定化酶的混合物相比，使不同種類的酶彼此接近，從而使反應(yīng)系統(tǒng)中不同酶之間的中間產(chǎn)物易于擴(kuò)散［27］。楊猛等［28］以Corynebacterium酮還原酶KRED30和Bacillus subtilisD-葡萄糖脫氫酶（GHD1）為模式酶，制備了高活力復(fù)合CLEAs。在水相體系中復(fù)合CLEAs可有效催化4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）和間氯苯乙酮（CPO）還原合成手性醇，連續(xù)催化10次，殘余活性仍保留70%以上，表明復(fù)合CLEAs一種可行的輔酶再生方法，顯示了優(yōu)良的催化性能和工業(yè)應(yīng)用潛力。Periyasamy等［29］采用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)來生產(chǎn)生物乙醇，制備了木聚糖酶、纖維素酶和β-1，3-葡聚糖酶的復(fù)合酶，其熱穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶，復(fù)合酶在48 h內(nèi)水解了84%左右的甘蔗渣（SCB），而游離酶的最大水解率為73%，回收的復(fù)合酶在6次循環(huán)使用后仍有90%的活性。通過循環(huán)使用不僅降低了使用成本，而且相比較于單獨(dú)固定的酶混合在一起，效果更好。

2.3 磁性CLEAs

磁性交聯(lián)酶聚集體（Magnetic cross-linked enzyme aggregates，M-CLEAs）技術(shù)是一種相對較新的酶固定化方法，主要是將CLEAs附著在氨基功能化磁性納米粒子（magnetic nanoparticles，MNP）上［30］，不僅可以改善酶的力學(xué)性能，還能夠使磁性反應(yīng)混合物中的固定化酶易于分離和循環(huán)利用［8］。Su等［31］制備了MNP酮還原酶和D-葡萄糖脫氫酶共固定CLEAs，發(fā)現(xiàn)添加了MNP后的聚集體其長期儲存的穩(wěn)定性明顯提高，多批次反應(yīng)后，M-CLEAs的酶活回收率均高于不添加MNP的酶活回收率，達(dá)到60%左右。由于磁性Fe3O4納米粒子的存在，固定化酶在磁場的作用下，可以方便快速地回收。Sóti等［32］研究了磁性木質(zhì)纖維素固定化酶同時在糖化、解毒和發(fā)酵過程的影響。通過接種液回流和縮短發(fā)酵時間，使酶的最終產(chǎn)品價格降低了15%，并且從液體培養(yǎng)基中一步回收了99.5% M-CLEAs，而88%M-CLEAs仍可從高固體含量的發(fā)酵液中回收，而且使用固定化酶的成本比游離酶降低了60%左右。綜上，與游離酶相比，M-CLEAs對抑制劑、酸性pH和廢水不但具有更高的穩(wěn)定性，而且經(jīng)磁鐵回收后可重復(fù)使用，將成為CLEAs一個很有潛力的研究方向。

3 CLEAs在固定化漆酶中的應(yīng)用

目前合成類染料在紡織印染等工業(yè)應(yīng)用廣泛，染料種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜且難降解，大部分具有較大毒性會給水體環(huán)境及人類健康造成嚴(yán)重危害［33］。漆酶由于催化底物廣泛在染料降解應(yīng)用中具有很好的前景，漆酶CLEAs可以降解多種不同結(jié)構(gòu)的染料，如蒽醌（RB亮藍(lán)）、三苯甲烷（孔雀綠）、偶氮（活性黑5）等［34］。此外，漆酶CLEAs具有較好的環(huán)境耐受性及重復(fù)利用率，大大節(jié)約了使用成本。Cerrenasp. HYB07的漆酶CLEAs與游離漆酶相比，在80 mmol/L NaCl存在情況下對RB亮藍(lán)和孔雀綠有更好的降解效果，2 h內(nèi)降解率達(dá)到90%［15］。Fomes fomentarius和Trametes versicolor的漆酶CLEAs，在4℃儲存70 d后，分別保留了初始活性的74%和80%，在重復(fù)使用6次和8次以后，仍有50%酶活回收率，對孔雀綠、溴麝香草酚藍(lán)和甲基紅的降解率在10 h后達(dá)到90%以上［35］。為了得到穩(wěn)定且易回收的生物催化劑，Kumar和Cabana等［36-37］首次將MNP與CLEAs結(jié)合并應(yīng)用于漆酶固定化，可降解61%-90%的RB亮藍(lán)、活性黑5、孔雀綠，在反復(fù)使用10次后仍有70%左右酶活回收率，添加MNP不但提高了酶活回收率，還提高了CLEAs的穩(wěn)定性，并且更方便回收反復(fù)使用。與真菌漆酶相比，細(xì)菌漆酶一般在高溫和堿性條件下具有更好的耐受性而受到廣泛關(guān)注。Sinirlioglu等［38］利用Shewanella putrefaciens重組漆酶制備了CLEAs，24 h降解90%以上的孔雀綠，在70℃仍具有活性，在5次循環(huán)利用后保留60%的酶活回收率。本課題組近期也利用Bacillus amyloliquefaciens的重組漆酶制備了CLEAs，該固定化酶在60℃下放置6 h仍保留70%的活性，對靛紅的降解率達(dá)到90%，反復(fù)使用6次后仍有50%的酶活回收率。

漆酶CLEAs還被廣泛應(yīng)用于降解內(nèi)分泌干擾化學(xué)物質(zhì)（EDCs），Cabana等［37］研制了基于漆酶CLEAs的催化裝置，可以在較大的濃度范圍內(nèi)降解多種EDCs，對壬基酚、雙酚A和三氯生去除率可達(dá)到85%以上，該固定化酶反應(yīng)器具有低成本、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。抗生素作為新興污染物引起了越來越多的關(guān)注，四環(huán)素類抗生素如四環(huán)素（TC）和土霉素（OTC），是一種廣泛存在于廢水和天然水體中的廣譜抗菌藥物［39］。漆酶CLEAs在無氧化還原介質(zhì)參與的情況下，在12 h內(nèi)降解超過80%以上的四環(huán)素類抗生素，48 h內(nèi)可完全消除100 μg/mL TC［40］。漆酶由于氧化還原電位的限制，不能直接催化具有高氧化還原電位的底物，為了增加漆酶的氧化能力，可以添加低濃度氧化還原介體，加快反應(yīng)進(jìn)程。如添加常見介體2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）后，漆酶CLEAs可完全去除廢水中的乙酰氨基酚，對非諾貝特、安定、甲氧芐啶和酮洛芬的去除率達(dá)到50%左右［41］。在制備漆酶CLEAs時，通過添加輔助蛋白可較大程度提高酶活回收率。Jiang等［42］發(fā)現(xiàn)添加了天然蛋清后的漆酶CLEAs穩(wěn)定性明顯提高，與游離和不添加蛋清相比，在60℃下熱穩(wěn)定性可提高1.8倍，反復(fù)使用7次后仍有76%的酶活回收率，30 h后對4-氯苯酚和2，4-二氯苯酚的降解率分別達(dá)到83.6%和91.5%。漆酶CLEAs還可以參與脂肪醇氧化反應(yīng)的循環(huán)利用，使1-庚醇在20 h內(nèi)僅用1 U/mL漆酶CLEAs就達(dá)到了55%的轉(zhuǎn)化率，而同一轉(zhuǎn)化率下所需的游離漆酶為10 U/mL［43］。

4 結(jié)論和展望

漆酶是一種環(huán)境友好型生物催化劑，通過固定化漆酶可有效提高其穩(wěn)定性和重復(fù)利用率。CLEAs是一種較新型的固定化酶技術(shù)，具有操作工藝簡單、穩(wěn)定性好、可重復(fù)使用、酶不需要完全純化、制備成本低等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)在固定化漆酶應(yīng)用上具有廣闊的前景，如在合成染料降解、內(nèi)分泌干擾物質(zhì)去除、抗生素轉(zhuǎn)化等方面都有很好的應(yīng)用效果。目前制備CLEAs一般都是使用真菌漆酶，應(yīng)用最多的是Trametes versicolor，其具有較高的氧化還原電位，分布廣泛和活性較高等特點(diǎn)［44］，但真菌漆酶一般只能在較低溫度和酸性條件下發(fā)揮作用，而紡織和造紙等工業(yè)領(lǐng)域往往存在高溫和堿性等環(huán)境，限制了真菌漆酶的使用。而細(xì)菌漆酶則在高溫、堿性、高鹽等條件下具有更好的穩(wěn)定性，今后應(yīng)加大對細(xì)菌漆酶CLEAs的開發(fā)和應(yīng)用［45］。通過一些改進(jìn)策略如載體共固定CLEAs，使其機(jī)械穩(wěn)定性提高，表現(xiàn)出高穩(wěn)定儲存性及熱穩(wěn)定性；通過多酶CLEAs技術(shù)，可以改善反應(yīng)物的局部濃度，提高回收率；通過M-CLEAs技術(shù)，使反應(yīng)混合物中的酶可以更好地分離和循環(huán)利用。然而仍有許多方面需要進(jìn)一步研究，如CLEAs制備工藝的通用性不強(qiáng)，通常對一種漆酶優(yōu)化的制備條件可能對另一種酶甚至不同來源的同一類漆酶均不適用，因此一般需要對固定化過程進(jìn)行優(yōu)化以得到更好的使用效果。此外，對于交聯(lián)酶粒徑方面的控制，以及對于CLEAs導(dǎo)致漆酶活損失的原因還應(yīng)進(jìn)一步的深入探索。由此可見，今后應(yīng)更多關(guān)注制備機(jī)理的分析、微觀結(jié)構(gòu)的表征調(diào)控以使CLEAs技術(shù)在生物催化和轉(zhuǎn)化中發(fā)揮更大的優(yōu)勢。