卓麗丹，李 紅，郭紅延

干細(xì)胞具有多向分化的能力，其骨向分化能力的增強(qiáng)可促進(jìn)骨組織的增加[1,2]，這個(gè)分化過(guò)程主要受一些調(diào)控因子和復(fù)雜的信號(hào)通路調(diào)節(jié)，包括核心蛋白基因RUNX2、BMP、P13K/AKT等[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，一種長(zhǎng)度為21～25 bp內(nèi)源性小分子核糖核酸（micro ribonucleic acid，MiRNA）可以通過(guò)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的方式靶向關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子或者信號(hào)通路，參與干細(xì)胞骨向分化[4-6]。MiRNA-22阻遏組蛋白去乙?；?的翻譯，使RUNX2的抑制作用減弱，促進(jìn)干細(xì)胞骨向分化[4]；MiRNA-21通過(guò)靶向人第10號(hào)染色體上的磷酸酶和張力蛋白調(diào)節(jié)P13K/AKT通路，促進(jìn)干細(xì)胞骨向分化[5]；MiRNA-30e通過(guò)靶向人低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6抑制 Wnt/β catenin信號(hào)通路，下調(diào)β catenin，RUNX2表達(dá)量減少，對(duì)于骨分化具有抑制作用等[6]。近期一項(xiàng)研究表明，在牽張成骨的動(dòng)物模型中MiRNA-503表達(dá)有所提高，但其作用機(jī)制尚不清楚[7]。本實(shí)驗(yàn)在體外將MiRNA-503轉(zhuǎn)染入脂肪干細(xì)胞（adipose stem cells，ADSC）中探討MiRNA-503是否促進(jìn)干細(xì)胞的骨向分化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠3～4周，雄性，體重35～45 g，由軍事醫(yī)學(xué)研究院動(dòng)物房提供[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCKK（京）2016-0006 ]，標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)1周。動(dòng)物一般情況檢查狀態(tài)良好，體溫、呼吸、精神狀態(tài)好。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 α-MEM、 H-DMEM、Opti-MEM（Gibco，美國(guó)）；血清（天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?，中?guó)）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒、胰蛋白酶、RNA提取試劑盒、Ⅳ型膠原酶、dispase酶、地塞米松、左旋抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、氫化可的松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-Isobutyl-1-Methylxanthine，IBMX）（Sigma，美國(guó)）；大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志抗體CD29、CD90、造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志抗體CD34、白細(xì)胞表面標(biāo)志抗體CD45、胰島素（達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 反應(yīng)試劑盒（Toyobo公司，中國(guó)）；Trizol、lipofectamine 3 000 （lipo-3 000，Invitrogen，美國(guó)）；MiRNA-503、陰性對(duì)照核苷酸（Negative control CY3）（蘇州吉瑪基因有限公司，中國(guó)）；β catenin、RUNX2、骨涎蛋白（BSP）、骨鈣素（OCN）引物序列（梓熙生物科技有限公司合成，中國(guó)）；青霉素、鏈霉素、異丙醇、丙酮、4%多聚甲醛（國(guó)藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)）；油紅O粉（上海試劑三廠，中國(guó)）；eppendorf管（EP管，Axygen公司，中國(guó)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱（Thermo，美國(guó)）；倒置顯微、流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)）；離心機(jī)（Heraens Cryofuge 8 000，德國(guó)）；Ⅰ型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)儀（Axygen公司，中國(guó)）。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取5只健康SD大鼠，在腹部剪梭形切口，暴露腹股溝脂肪墊，取腹股溝處白色脂肪，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，去除脂肪外面粘連的包膜、肉眼可見(jiàn)的小血管及較明顯結(jié)締組織。將脂肪組織剪碎約1 mm3，加入1 ml Ⅳ型膠原酶、1 ml dispase酶、4 ml 0.25%胰酶、4 ml H-DMEM，放置37 ℃、5%CO2孵箱中消化15 min，隨后使用100目、200目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，1 000 g 離心5 min，完全培養(yǎng)基（10%國(guó)產(chǎn)血清，1‰青霉素，1‰氯霉素，90%α-MEM）重懸計(jì)數(shù)，按照1×105/cm2接種于培養(yǎng)皿中，第2天首次進(jìn)行換液去除未貼細(xì)胞，隨后觀察，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)一部分細(xì)胞進(jìn)行凍存，剩余細(xì)胞按照1∶3傳代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 ADSC進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo) P2代細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%消化計(jì)數(shù)，以1×105/孔接種至6孔板培養(yǎng)板中作為誘導(dǎo)組，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)。成骨誘導(dǎo)液（10%國(guó)產(chǎn)血清、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、1 mol/107L 地塞米松、50 mg/L左旋抗壞血酸）；成脂誘導(dǎo)液（α-MEM，15%國(guó)產(chǎn)血清，終濃度1 μmol/L地塞米松，0.5 μmol/L IBMX，10 ng/ml胰島素，1 μmol/L氫化可的松），每間隔1 d更換誘導(dǎo)液。另外5×104/孔接種至12孔板為對(duì)照組只添加完全培養(yǎng)基。

1.4.3 ALP染色 成骨誘導(dǎo)分為成骨誘導(dǎo)組和對(duì)照組，誘導(dǎo)7 d按照ALP試劑盒說(shuō)明進(jìn)行ALP染色，兩組細(xì)胞棄上清，PBS清洗2次 ；加入固定液（1.96 ml去離子水、0.04 ml檸檬酸、7.5 ml丙酮）30 s，去離子水清洗2次；加入染色液（0.05 ml固藍(lán)BB鹽、2.35 ml去離子水、0.1 ml萘酚AS-MX磷酸鹽），6孔板1 ml/每孔、12孔板500 μl/每孔，室溫靜置30 min后，去離子水洗滌2次，留少量的液體拍照。

1.4.4 油紅O染色 成脂誘導(dǎo)分為成脂誘導(dǎo)組和對(duì)照組，誘導(dǎo)12 d進(jìn)行油紅O染色：（1）配置油紅O，油紅O粉0.5 g，加異丙醇100 ml，60 ℃水浴，玻璃攪棒攪至完全溶解；（2）用PBS將兩組洗滌2遍后，使用4%多聚甲醛固定30 min。（3）去離子水洗滌2遍后，加入油紅O（6孔板1 ml/每孔，12孔板500 μl/每孔）染色10 min。去離子水洗滌2遍后即刻在顯微鏡下拍照。1.4.5 胞內(nèi)轉(zhuǎn)染 將已證明具有成骨、成脂能力的ADSC P0代細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)至P2代，ADSC以2×105/孔接種至6孔板培養(yǎng)板中，加入2 ml完全培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 以使細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%，實(shí)驗(yàn)前2 h將完全培養(yǎng)基更換為α-MEM。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組（N組）轉(zhuǎn)染MiRNA-503和對(duì)照組（NC組）轉(zhuǎn)染 Negative control CY3，相關(guān)序列見(jiàn)表1。準(zhǔn)備2支EP管（A和B管），A 管中加入 400 μl Opti-MEM+4 μl lipo3 000+4 μl MiRNA-503，B 管中加入 400 μl Opti-MEM+4 μl lipo3 000+4 μl Negative control CY3，輕吹3～5次混勻，室溫下靜置5 min。將混合液分別加入兩組細(xì)胞培養(yǎng)液中，放置孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h以充分轉(zhuǎn)染。

表1 MiRNA-503和Negative control CY3相關(guān)基因序列

1.4.6 細(xì)胞流式檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染完成后，細(xì)胞消化重懸，制備1 ml PBS懸液，其中細(xì)胞數(shù)為1×106，N組準(zhǔn)備五支EP管標(biāo)記為11、12、13、14、15，每管1 ml PBS懸液；NC組同樣準(zhǔn)備五支標(biāo)記為21、22、23、24、25。兩組分別加入相應(yīng)抗體 1 μl ，CD45（11、21），CD29（12、22），CD90（13、23），CD34（14、24），空白對(duì)照（15、25）放置搖床30 min，溫度4℃。測(cè)試前清洗后加PBS至總體積為400 μl，然后使用流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記情況。

1.4.7 成骨誘導(dǎo)鑒定 轉(zhuǎn)染完成后，兩組樣品均換成成骨誘導(dǎo)液，成骨誘導(dǎo)7 d進(jìn)行ALP染色和RT-PCR檢測(cè)。成骨誘導(dǎo)7 d，檢測(cè)兩樣本成骨相關(guān)基因水平，使用Trizol提取總RNA，測(cè)量RNA濃度，定量反轉(zhuǎn)錄形成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），然后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。成骨相關(guān)基因引物為RUNX2、BSP、OCN相關(guān)引物序列見(jiàn)表2。RT-PCR的反應(yīng)體系為：2×T5 Fast Qpcr Mix 10 μl，上下引物分別為 0.5 μl，cDNA 1 μl，DEPC 水 8 μl，反應(yīng)體系為 20 μl體系，擴(kuò)增條件為 95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。

表2 成骨相關(guān)基因引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Image J 軟件分析圖片結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 ADSC形態(tài)學(xué)觀察 ADSC P0代細(xì)胞成細(xì)梭狀，其中部分細(xì)胞呈三角形等不規(guī)則形態(tài)（圖1A）。經(jīng)傳代純化細(xì)胞，P3代ADSC純度較高，ADSC長(zhǎng)梭狀，呈渦旋式分布，類(lèi)似成纖維細(xì)胞（圖1B）。

圖1 ADSC細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征（光鏡，×100）

2.2 ADSC成骨、成脂染色 成骨誘導(dǎo)組ALP染色（42.712±4.055），細(xì)胞胞漿內(nèi)含較多的ALP藍(lán)色顆粒（圖2A）；成脂誘導(dǎo)組油紅O染色（47.607±6.604），細(xì)胞胞漿內(nèi)含橘紅色的類(lèi)似串珠狀的脂滴（圖2C），均高于對(duì)照組（7.383±1.840，2.780±0.278，圖2B、圖2D）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.742，P＜0.001；t=11.747，P=0.007）。

圖2 ADSC成骨、成脂誘導(dǎo)染色

2.3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞檢測(cè)

2.3.1 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 CD29和CD90陽(yáng)性表面抗原高表達(dá)，N組CD29表達(dá)量99.8%，CD90表達(dá)量99.9%；NC組CD29表達(dá)量99.6%，CD90表達(dá)量99.2%；CD34、CD45等陰性表面抗原低表達(dá)，N組CD34表達(dá)量0.6%，CD45表達(dá)量0.4%；NC組CD34表達(dá)量0.3%，CD45表達(dá)量0.0%，見(jiàn)圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染后兩組ADSC 細(xì)胞表面標(biāo)志抗原的表達(dá)

2.3.2 ALP染色 N組陽(yáng)性細(xì)胞（104.014±13.773，圖4A）高于NC組（44.111±1.925，圖4B），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.952，P=0.009）。

圖4 轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞ALP染色結(jié)果

2.3.3 成骨相關(guān)基因檢測(cè) N組表達(dá)成骨相關(guān)基因RUNX2、BSP、OCN均強(qiáng)于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖 5）。

圖5 轉(zhuǎn)染后成骨誘導(dǎo)7 d 兩組成骨相關(guān)基因的表達(dá)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)貼壁培養(yǎng)提取原代ADSC，生長(zhǎng)速度較快，細(xì)胞純度較高具有多向分化干性，與2001年Zuk等[8]首次從脂肪組織中分離出一種成纖維樣細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的能力的ADSC 描述相符。由于其來(lái)源廣、易培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為骨組織工程的種子細(xì)胞。盡管基因工程在修復(fù)骨組織缺損和再生治療領(lǐng)域中表現(xiàn)出巨大的潛力，但仍存在一些不足，如轉(zhuǎn)染質(zhì)量控制、轉(zhuǎn)染效率以及安全性等[9-11]。實(shí)驗(yàn)中采用非病毒lipo-3 000作為載體，流式結(jié)果顯示N組和NC組特異性表面抗原沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明轉(zhuǎn)染后ADSC仍保持著多向分化的潛能，也提示這種轉(zhuǎn)染方式是安全的，為基因轉(zhuǎn)染干細(xì)胞提供一種安全、有效的新思路。

ALP染色陽(yáng)性是成骨細(xì)胞的特異現(xiàn)象，ADSC轉(zhuǎn)染完成后成骨誘導(dǎo)7 d， ALP染色結(jié)果顯示N組ALP的表達(dá)高于NC組。ALP是成骨分化過(guò)程中早期表達(dá)的蛋白之一，ALP活性越高，說(shuō)明成骨分化能力越強(qiáng)。ALP具有轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸鹽、Ca2+、ATP酶或作為鈣結(jié)合蛋白的作用，并且具有啟動(dòng)鈣化程序的作用，以促進(jìn)骨向分化。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR的方法檢測(cè)RUNX2、BSP、OCN的基因表達(dá)量。RUNX2、BSP、OCN是骨分化過(guò)程中重要的調(diào)控因子，其表達(dá)量可反映干細(xì)胞的成骨能力，RUNX2 是成骨分化過(guò)程中關(guān)鍵的調(diào)控因子，能夠調(diào)控眾多基因的轉(zhuǎn)錄，RUNX2缺失鼠中成骨細(xì)胞的分化完全被抑制，均不發(fā)生骨膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨[12]。BSP是骨標(biāo)志性蛋白基因，它是一種硫酸化的磷蛋白和高度糖基化，能激活成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨礦化[13]。OCN是一種一般僅由成骨細(xì)胞表達(dá)的基質(zhì)蛋白基因，具有調(diào)節(jié)基質(zhì)鈣化的作用，其濃度可以作為成骨細(xì)胞活動(dòng)的標(biāo)志[14]。RT-PCR結(jié)果顯示N組成骨相關(guān)基因表達(dá)明顯強(qiáng)于NC組，說(shuō)明MiRNA-503促進(jìn)ADSC骨向分化，但作用機(jī)制尚不清楚。筆者運(yùn)用生物學(xué)信息的方法，搜索Target Scan網(wǎng)站，獲得300多個(gè)MiRNA-503可能的靶基因，其中與成骨基因密切的相關(guān)因子如：Wnt3α、Smad7、Wnt2b等，MiRNA-503在ADSC可能靶基因?qū)⒃诤罄m(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證和篩選。

綜上所述，MiRNA-503在ADSC骨向分化的過(guò)程中起促進(jìn)作用。目前仍待解決明確MiRNA-503促進(jìn)干細(xì)胞骨向分化的作用機(jī)制；轉(zhuǎn)染MiRNA的量和質(zhì)的控制問(wèn)題[15-17]。隨著研究的逐漸深入，基因化的骨組織工程或許是將來(lái)臨床治療骨組織缺損和骨缺失的一種簡(jiǎn)單、高效、方便的創(chuàng)新性的治療方法。