金沁遠(yuǎn)

摘 要：CAR-T是目前非常熱門的治療腫瘤的一種免疫治療策略，并且在治療血液腫瘤方面取得了良好的效果，但其在實(shí)體腫瘤的治療方面的研究過程卻進(jìn)展十分緩慢。本文就CAR-T療法在肝細(xì)胞癌所分泌的GPC3、CD133的抗原蛋白，神經(jīng)母細(xì)胞瘤所分泌的CD2、GD2的抗原蛋白，非小細(xì)胞肺癌所分泌的EaphA2、MU-C1、PSCA的抗原蛋白以及惡性膠質(zhì)瘤所分泌的IL13Rα2，、EGFRIII的抗原蛋白的近期所進(jìn)行的最新的研究進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：CAR-T細(xì)胞療法;肝細(xì)胞癌 ;神經(jīng)母細(xì)胞瘤;膠質(zhì)瘤;小細(xì)胞肺癌;研究進(jìn)展綜述

惡性腫瘤是目前危害世界人民的健康安全的一大難題。惡性腫瘤擁有能自行產(chǎn)生生長信號分子進(jìn)行無限的自我復(fù)制，浸潤性生長等特性。因此，徹底地治療惡性腫瘤現(xiàn)如今已成為了醫(yī)學(xué)界的一大難題。正因?yàn)閻盒阅[瘤的種種特性導(dǎo)致市面上的能特效的針對腫瘤細(xì)胞的藥物數(shù)量極少，同時(shí)由于生產(chǎn)和研發(fā)成本較高，大多數(shù)藥物的治療費(fèi)用老百姓難以承擔(dān)，這也是目前惡性腫瘤在農(nóng)村和城鎮(zhèn)能有如此高的致死率的原因之一。根據(jù)近幾年的衛(wèi)生和計(jì)劃生育統(tǒng)計(jì)年鑒所調(diào)研的數(shù)據(jù)顯示，城鎮(zhèn)和鄉(xiāng)村人口因腫瘤而死亡的人口數(shù)目已達(dá)到總死亡人數(shù)的26.06%，僅次于循環(huán)系統(tǒng)疾病的死亡率，是影響我國人民的生命健康安全的第二大“敵人”。而在這其中，肝癌、肺癌和胃癌這幾種實(shí)體腫瘤的致死率在惡性腫瘤中排行最高，分別為22.70%、47.84%和18.78%[2]。

本文所介紹的CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherap）免疫療法是目前市面上最熱門的針對腫瘤的免疫治療法之一。目前，CAR-T細(xì)胞療法在針對血液腫瘤的治療中取得了良好的進(jìn)展，但其針對實(shí)體腫瘤的研究進(jìn)展十分得緩慢，導(dǎo)致這一現(xiàn)狀的最主要的原因在于，血液腫瘤分泌的特異性抗原在身體的其他部位很少表達(dá)，例如B細(xì)胞費(fèi)霍奇金淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma，HL）表達(dá)的CD20，多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）表達(dá)的CD138等等，但是類似于血液腫瘤這種特異性表達(dá)的抗原在實(shí)體腫瘤中卻十分的少見，這是CAR-T細(xì)胞療法應(yīng)用于血液腫瘤具有良好的成效的原因。

因此，本研究的主要目的便是對CAR-T細(xì)胞療法在不同實(shí)體腫瘤中的研究的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、CAR-T細(xì)胞療法的分子基礎(chǔ)和發(fā)展歷程

CAR分子的概念最早是于1989年由Gross提出的。其主要由T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）的胞內(nèi)信號區(qū)，跨膜區(qū)以和胞外抗原結(jié)合區(qū)組成，而這個(gè)胞外區(qū)具有抗體單鏈可變區(qū)片段功能。[2]這一技術(shù)的關(guān)鍵在于使轉(zhuǎn)載了CAR分子的T細(xì)胞能特異性的地識別并結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原，例如腎細(xì)胞癌分泌的CAIX，肺癌和卵巢癌分泌的Lewis Y以及在黑色素瘤、成細(xì)胞纖維瘤、骨肉瘤、小細(xì)胞肺癌、軟組織肉瘤等腫瘤中高度表達(dá)的神經(jīng)節(jié)苷脂2（diasialoganglioside，GD2）等等，以使T細(xì)胞能在監(jiān)測到帶有特異性靶點(diǎn)抗原的腫瘤細(xì)胞時(shí)活化產(chǎn)生具有殺傷力的細(xì)胞毒性因子，以此來實(shí)現(xiàn)靶向性地消滅目標(biāo)的腫瘤細(xì)胞并能實(shí)現(xiàn)含有CAR分子的T細(xì)胞的自我增殖，從而在人體內(nèi)能長時(shí)間的存在并殺死目的腫瘤細(xì)胞。

一代的CAR-T細(xì)胞由于缺少共刺激分子，無法有效地實(shí)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持續(xù)的增殖，而二代的CAR-T細(xì)胞增加了共刺激分子，例如CD28，4-1BB，OX40等等，使CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性得到了顯著的提高，在三代的CAR-T細(xì)胞里，研究人員又增加了一個(gè)共刺激分子的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞活性以及殺傷力均優(yōu)于二代，同時(shí)，最新的一代CAR-T細(xì)胞，也就是第四代CAR-T細(xì)胞，研究人員通過聯(lián)合細(xì)胞因子或共刺激分子的配體改善免疫微環(huán)境，從而進(jìn)一步增強(qiáng)其活性與殺傷力。[3]

目前醫(yī)學(xué)上對CAR-T細(xì)胞臨床應(yīng)用的主要操作方法為先將含有CAR分子的載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入T細(xì)胞中，再將改造后的T細(xì)胞進(jìn)行體外的增殖，最后將增殖后的含有CAR分子的T細(xì)胞在輸入已經(jīng)過預(yù)處理的患者體內(nèi)，此過程稱為重新引導(dǎo)T細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞。[4]目前在市面上經(jīng)過美國食品藥品監(jiān)督管理局審批通過并已上市的CAR-T細(xì)胞療法藥物主要有兩個(gè)，分別為Kymriah和Yescarta。

CAR-T細(xì)胞療法在針對血液腫瘤的治療中取得了良好的進(jìn)展，但其針對實(shí)體腫瘤的研究進(jìn)展十分的緩慢。目前，主要在肝細(xì)胞癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤、小細(xì)胞肺癌等方面取得相關(guān)進(jìn)展。

二、CAR-T細(xì)胞療法在肝細(xì)胞癌中的研究進(jìn)展

根據(jù)2016年的中國衛(wèi)生和計(jì)劃生育統(tǒng)計(jì)年鑒統(tǒng)計(jì)，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是首要的導(dǎo)致城鎮(zhèn)居民死亡的癌癥，其發(fā)病和致死的人群主要集中在25歲以上的成年人群。引起肝癌的主要外部因素為感染肝炎病毒，而其中乙型肝炎又是其中最為常見的一種肝炎病毒（HBV）。根據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在我國患有乙型肝炎的人數(shù)約有1.2億人之多。而在內(nèi)部因素中，嗜酒與長期進(jìn)食霉變食物是引起肝癌的重要因素。在此前，治療肝癌的主要途徑通過化療，手術(shù)切除，以及肝移植等綜合性治療。同時(shí)，目前市面上主流的口服的多靶向性腫瘤治療藥物索拉非尼（Sorafenib）只能將患者的生存時(shí)間延長2～3個(gè)月。而本文所介紹的CAR-T免疫療法則是通過誘導(dǎo)自身的免疫細(xì)胞來特異性殺死癌變的細(xì)胞來進(jìn)行肝癌的治療，并能夠有效的規(guī)避之前的綜合性療法以及藥物治療所帶來的部分副反應(yīng)。目前CAR-T免疫療法針對HCC所適用的特異性抗原主要有：磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3），CD133。

吳斯瑋等[5]運(yùn)用了GPC3作為特異性抗原所構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明在GPC3-CAR-T細(xì)胞與陽性Huh-7細(xì)胞進(jìn)行接觸時(shí)會有大量的LDH釋放，表明GPC3-CAR-T對其有殺傷作用，且其效靶比為4：1，能很好的針對HCC進(jìn)行治療。

Yao Wang等利用二代CAR分子，并以CD133為特異性抗原，構(gòu)建了CD133-CAR-T細(xì)胞。在之后的研究中顯示，CD133-CAR-T細(xì)胞能在擁有CD133的血液環(huán)境中分裂，同時(shí)，能顯著的觀察到試管內(nèi)的CD133的數(shù)量在減少，由此證明，CD133可以作為CAR-T免疫療法用于治療HCC的一個(gè)潛在的靶向性抗原。

三、CAR-T細(xì)胞療法在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的研究進(jìn)展

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma，NB）是一種常見的兒童顱外腫瘤。NB的發(fā)病和致死率在每10萬人中的4人，且發(fā)病人群主要為1至5歲的幼兒為主。同時(shí)NB的預(yù)后差，嚴(yán)重的危害了幼兒的成長。NB的主要的治療方法為通過將血管進(jìn)行骨骼化，再通過手術(shù)切除的方法進(jìn)行治療。而CAR-T免疫療法則能很好地避免手術(shù)切除帶來的風(fēng)險(xiǎn)，保護(hù)患兒的生命安全。目前CAR-T細(xì)胞療法最有效的針對神經(jīng)母細(xì)胞瘤所選用的特異性抗原主要有CD2，GD2。Pule等運(yùn)用一代的CAR分子，并以GD2作為特異性的抗原靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)出了GD2-CAR-T細(xì)胞用于治療NB，并成功地使11例難治療的患者的癥狀得到了緩解，并且其中的4例患者的腫瘤細(xì)胞可以明顯的觀察到消退，由此證明GD2-CAR-T是一個(gè)有效的針對NB的特異性抗原。Louis等則設(shè)計(jì)出了以CD2為特異性靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞并用于治療19例NB患者，成功的使其中的8例的癥狀得到了有效的緩解。Paola Bocca等通過利用OTK3和CD28抗體和白細(xì)胞介素-7（IL7）（10ng/ml）和白細(xì)胞介素-15（5ng/ml）在完全培養(yǎng)基中活化，并在第三天時(shí)，用逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液活化的T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)到涂有重組bronectin片段的培養(yǎng)皿上，最后通過使用IL7-IL15擴(kuò)增T細(xì)胞，以此獲取實(shí)驗(yàn)用的T細(xì)胞。選擇GD2作為特異性抗原，以此來構(gòu)建了GD2-CAR-T細(xì)胞。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，將GD2-CAR-T細(xì)胞與BEV聯(lián)合使用，并且觀察到只有當(dāng)GD2-CAR-T細(xì)胞與BEV聯(lián)合使用時(shí)，才具有抗NB活性，同時(shí)能大量的侵襲腫瘤組織，并且能檢測到干擾素-g（IFN-g）的產(chǎn)生。這次試驗(yàn)可以為后續(xù)的GD2-CAR-T細(xì)胞與BEV聯(lián)合使用于NB的臨床治療中提供了強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)。

四、CAR-T細(xì)胞療法在惡性膠質(zhì)瘤中的研究進(jìn)展

惡性膠質(zhì)瘤（Glioblastoma，GBM）是一種常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，年發(fā)病率為每十萬人中3至8人。（1）雖然通過手術(shù)可以將比較低級別的膠質(zhì)瘤完全的切除，但由于GBM預(yù)后很差，以及其浸潤行為，導(dǎo)致手術(shù)很難徹底地切除GBM。而目前市面上主流的GBM的化療藥物替莫唑胺（Temozolomide）又只能將患者的生存時(shí)間延長2個(gè)月左右，并不能完全的治愈GBM患者。在CAR-T免疫療法的研究中，由于GBM所分泌的特異性抗原在身體的其他部位幾乎不表達(dá)，因此，有希望通過CAR-T免疫療法來抑制或徹底殺死GBM，以此來規(guī)避手術(shù)切除可能會留下的創(chuàng)傷。

目前CAR-T免疫療法針對于膠質(zhì)瘤所用的特異性抗原主要有：EGFRIII，白細(xì)胞介素13受體α2（interleukin-13 receptor alpha 2， IL13Rα2）等。

鄭巖等利用了EGFRIII所構(gòu)建的CAR分子所進(jìn)行的針對膠質(zhì)瘤的殺傷作用的實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)EGFRIII-CAR-T細(xì)胞的效靶比為4：1，8：1，16：1，32：1時(shí)，其對于膠質(zhì)瘤的殺傷活性超過了50%，由此可以看出，EGFRIII是一個(gè)有效的針對膠質(zhì)瘤的特異性抗原。

Christine等利用IL13Rα2作為特異性抗原構(gòu)建CARs，并在三例惡性膠質(zhì)瘤患者的免疫治療中取得了良好的效果，在后續(xù)的腫瘤治療過程中，也能持續(xù)觀察到患者體內(nèi)IL13Rα2的表達(dá)收到了抑制。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)IL13Rα2-CAR-T的累積使用劑量達(dá)到10.6×10個(gè)T細(xì)胞時(shí)，能有效的緩解病癥。

五、CAR-T細(xì)胞療法在非小細(xì)胞肺癌中的研究進(jìn)展

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是一種肺部的惡性癌癥，其致病原因與吸煙有著密切的關(guān)系，目前，我國的吸煙者達(dá)到了3.01億人，同時(shí)，我國的肺癌的發(fā)病率達(dá)到了每年26.9%。肺癌的致死率也極高，為每10萬人中的23人。肺癌的主要的發(fā)病癥狀為咳嗽，咯血，胸悶氣急以及聲帶嘶啞。在此之前，NSCLC的治療方式為放療，但由于放療在殺死癌變細(xì)胞的同時(shí)，也對身體內(nèi)的其他的正常的組織和細(xì)胞產(chǎn)生了巨大的危害。但是CAR-T免疫療法能很好地規(guī)避其部分的副作用。

Ning Li等的研究顯示Erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma A2（EphA2）在SCLC中過度表達(dá)超過90%，因此，他們選用EphA2作為特異性靶點(diǎn)，使用擁有一個(gè)共刺激分子41-BB的二代CAR分子來構(gòu)建了CAR分子，并觀察到EphA2-CAR-T細(xì)胞在患有NSCLC的小鼠模型體內(nèi)表達(dá)出了IFN-y，但在48h后，可以明顯得檢測到EphA2-CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量的減少。

Xinru Wei等運(yùn)用二代擁有兩個(gè)共刺激分子CD28和CD3z的CAR分子并選用MU-C1和PSCA作為特異性抗原構(gòu)建了CAR-T細(xì)胞。同時(shí)利用6～8周年齡并移植了原發(fā)性腫瘤塊的小鼠的NOD-SCID-IL2Rg/株（NSI），以此來產(chǎn)生人造的NSCLC PDX小鼠并進(jìn)行試驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)在8例小鼠模型僅有兩例表達(dá)了MU-C1，然而有七例包括表達(dá)出MU-C1的兩例小鼠大量表達(dá)PSCA。在之后對這8例小鼠所進(jìn)行的試驗(yàn)結(jié)果顯示PSCA-CAR-T細(xì)胞以及MU-C1-CAR-T細(xì)胞均能有效的抑制小鼠模型中的NSCLC細(xì)胞的生長。

六、結(jié)語

CAR-T細(xì)胞療法是目前最有希望能根治腫瘤的免疫療法，其副反應(yīng)小，治療徹底等優(yōu)勢為癌癥病人帶來了福音。但只有在克服細(xì)胞因子風(fēng)暴、脫靶效應(yīng)以及特異性抗原的選擇等難題后，才能真正的使癌癥的治療邁上一個(gè)新的臺階。因此，雖然CAR-T細(xì)胞療法的前景十分的明朗，但其仍需要進(jìn)行大量的研究。

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