郭 建，黃思瑤，鄭 鵬，陳葉福，郭學武，肖冬光

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

普魯蘭多糖是由出芽短梗霉合成的一種胞外多糖，它由麥芽三糖以α-(1→6)糖苷鍵反復連接而成[1]．特殊的化學結構賦予普魯蘭多糖優(yōu)良的性質，它黏度大、水溶性極強，在化工、食品、醫(yī)藥等行業(yè)應用廣泛．普魯蘭多糖可作為增稠劑，也能用于生產可被微生物降解的薄膜，還可作為低卡路里食品直接食用[2]．

普魯蘭多糖的合成是一個復雜過程．磷酸葡萄糖變位酶、葡萄糖焦磷酸化酶、葡萄糖基轉移酶可能是普魯蘭多糖合成過程中的關鍵酶[1]．Li等[3]過表達葡萄糖焦磷酸化酶基因后發(fā)現(xiàn)，普魯蘭多糖產量提升了1.3倍．Chen等[4]驗證了幾個葡萄糖基轉移酶基因的功能，發(fā)現(xiàn)其中1個葡萄糖基轉移酶基因對普魯蘭多糖產量有促進作用．以上實驗結果同推測的普魯蘭多糖合成途徑相互印證．除了上述關鍵酶外，糖脂中間體 lipid-G對多糖的合成也至關重要[5]．糖脂中間體 lipid-G是由脂類物質與尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)結合而成的[5]．已有的文獻[3-4]報道都是從增加 UDPG含量的角度來增強普魯蘭多糖的合成，并未考慮脂類物質對糖脂中間體lipid-G的影響．

載脂蛋白(apolipoprotein)對脂類物質的合成和運輸均有較大影響[5-6]，脂類物質對于糖脂中間體的形成至關重要．脂類物質含量的增加能夠促進糖脂中間體的形成，作為普魯蘭多糖合成的基本單元，足量的糖脂中間體無疑會促進普魯蘭多糖的合成．出芽短梗霉所產脂類物質的主要成分為重油[1]，但是重油在普魯蘭多糖合成中的作用還未見報道，由此可以推測其可能參與糖脂中間體 lipid-G的合成．基于以上認識，本研究以出芽短梗霉(A.pullulans)CBS110374菌株為研究對象，通過敲除和整合過表達，考察了出芽短梗霉載脂蛋白基因 apo和 gltP對普魯蘭多糖及重油合成的影響，這有助于深入認識普魯蘭多糖合成過程．

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

出芽短梗霉(A.pullulans)CBS110374購自荷蘭CBS菌種保藏中心，所用工程菌株 OA21、OG5、Δapo和ΔgltP為本實驗構建．

DNA 聚合酶、dNTP，Takara公司；D9515崩潰酶、L4025消解酶、Trizma堿，Sigma公司；潮霉素B，上海索寶生物科技有限公司；山梨醇，上海邁瑞爾化學技術有限公司；甲醇，天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；無水乙醇，天津市申泰化學試劑有限公司．

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

YEPD培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖 20，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉 15，121℃滅菌20min．

HCS培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 10，酵母浸粉 3，牛肉粉 1，蛋白胨 10，麥芽粉 3，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉 15，pH 5.7，115℃滅菌 20min．HCS培養(yǎng)基雙層培養(yǎng)基的下層 HCS培養(yǎng)基添加終質量濃度為50mg/L的潮霉素，上層HCS培養(yǎng)基不添加潮霉素．

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20，硫酸鎂 0.4，酵母粉 1.2，硫酸銨 1.0，NaCl 4，K2HPO44，pH 6.0，115℃滅菌20min．

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 50，硫酸鎂 0.2，酵母粉 0.8，硫酸銨 0.8，NaCl 2，K2HPO46，pH 6.5，115℃滅菌20min．

種子培養(yǎng)條件為 28℃、200r/min培養(yǎng) 24h，發(fā)酵培養(yǎng)條件為28℃、220r/min培養(yǎng)7d．

1.3 重組菌株構建

重組菌株的構建采用同源重組依賴型 DNA裝配方法[7]，過表達gltP基因的菌株的構建過程參考文獻[7]．所用引物(表1)由金維智生物技術有限公司合成，下劃線表示片段間重疊的堿基．

表1 引物Tab. 1 Primers

續(xù) 表

同源重組依賴型 DNA裝配方法為相鄰片段引物設計方法，在 rDNA 基因(Genbank NO.AY139394.1)位點整合過表達apo或gltP基因，如圖1所示．前期研究[7]發(fā)現(xiàn)出芽短梗霉擁有高效的同源重組修復機制，基于這種機制在設計引物時于引物末端加入同源序列，然后將待整合片段導入細胞內，即可在細胞內完成片段連接并整合到設計好的位點．

圖1 同源重組依賴型 DNA裝配方法引物設計原則及整合過表達apo或gltP示意圖Fig. 1 Principles of homologous recombination dependent DNA assembly method and the schema of integrating overexpression of apo or gltP

1.3.1 轉化片段準備

在rDNA位點過表達apo基因(JGI protein ID：84794)需要 6個片段，即 HPT片段、rDNAU片段和rDNAD片段，PGKP5(磷酸甘油酸激酶基因啟動子)用引物 PGKPF/PGKP5R擴增，apo片段(apo基因)用引物 apoU/apoD 擴增，PGKt5(磷酸甘油酸激酶基因終止子)用引物PGK5tF/PGKtR擴增．敲除apo基因需要 3個片段，apo基因上同源臂用引物ApoUs/ApoUa擴增，apo基因下同源臂用引物ApoDs/ApoDa擴增，潮霉素抗性基因用引物HPT3s/HPT3a擴增．

敲除 gltP基因需要 3個片段，gltP基因上同源臂用引物 gltPU1s/gltPU1a擴增，gltP基因下同源臂用引物 gltPD1s/gltPD1a擴增，潮霉素抗性基因用引物HPT4s/HPT4a擴增．

1.3.2 出芽短梗霉轉化

出芽短梗霉采用電轉化方法：取1環(huán)出芽短梗霉接種于5mL的YEPD試管中，28℃、200r/min培養(yǎng)24h；取 2mL菌液接種于裝液量為 50mL YEPD的250mL 三角瓶中，28℃、200r/min培養(yǎng) 24h；2mL菌液移至 2mL滅菌離心管，4℃、12000r/min離心2min，收集菌體，可重復多次以獲得足量菌體；用1mol/L山梨醇溶液將菌體重懸，4℃、12000r/min離心2min，收集菌體；加入1mL 溶液Ⅰ(1mol/L山梨醇和 50mmol/L檸檬酸鈉混合液，pH 5.8)將菌體重懸，并加入適量的 D9515崩潰酶和 L4025消解酶(703U/mg)處理細胞，28℃、100r/min酶解 10min后迅速拿出，4℃、2500r/min離心 10min，收集菌體；菌體用 2mL溶液Ⅰ重懸，4℃、2500r/min離心10min，棄上清液，重復1次；菌體用2mL 1mol/L山梨醇溶液重懸，4℃、2500r/min離心 10min，棄上清液，重復 1次；菌體用100μL 1mol/L山梨醇溶液混勻，并加入預冷的待轉片段，冰浴放置 10min；將混合液加入已經預冷好的電轉杯中，冰浴放置 10min；1500V、200? 條件下進行電轉，電轉完畢后將菌體用1mol/L山梨醇溶液洗出，30℃培養(yǎng)箱中修復培養(yǎng)2～4h；修復培養(yǎng)后將全部菌體涂布于 HCS雙層平板(初篩平板)中，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2～3d即可見轉化子；將初篩平板長出的單菌落點板到 YEPD潮霉素抗性平板(復篩平板)上，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2d即可見轉化子．

1.4 出芽短梗霉生物量和葡萄糖含量的測定

取 10mL菌液，12000r/min離心 2min，棄上清液；菌體用純凈水洗滌2次，12000r/min離心2min，棄上清液；所得菌體用純凈水懸浮后，轉入干凈的平皿中，70℃烘干至質量恒定，計算出芽短梗霉的生物量．

采用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中葡萄糖含量：色譜柱為 Aglient HPX-87H(300×7.8mm)，檢測器為示差檢測器(RID)，檢測器溫度55℃，柱溫65℃，流動相為5mmol/L硫酸溶液，流量0.6mL/min，進樣量10μL．

1.5 普魯蘭多糖產量的測定

取 10mL菌液，12000r/min離心 2min取上清液 5mL，加入 2倍體積的無水乙醇，4℃放置 12h，5000r/min離心 8min去上清液；沉淀出來的多糖再用無水乙醇清洗2次；70℃烘箱烘干至質量恒定，計算多糖產量．

1.6 酶活力測定

依據 McCleary等[8]的方法測定葡萄糖基轉移酶活力．將適當稀釋的待測樣本(0.2mL)與預均衡的對硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷(0.2mL，10mmol/L)置于 0.1mol/L乙酸鈉緩沖液(pH 4.0)中，40℃處理5min．通過加入 Trizma堿(3.0mL，2.0%)的水溶液終止反應，測量 410nm 處的吸光度．酶活力用對硝基苯酚釋放量(μmol/L)表示，并通過參考標準曲線計算(通過用不同濃度的對硝基苯酚測量溶液的A410值來測定標準曲線)．使用在 100℃加熱 5min的樣本和反應液的混合物作為對照．

根據 Dutra等[9]的方法測定 UDPG焦磷酸化酶活力．酶活力單位定義為在測定條件下在1min內催化 1.0μmol/L底物轉化的酶量．使用在 100℃加熱5min的樣本和反應液的混合物作為對照．

根據Qian等[10]的方法測定磷酸葡萄糖變位酶活力．酶活力單位定義為在測定條件下在1min內催化1.0μmol/L底物轉化的酶量．使用在 100℃加熱5min的無細胞提取物的混合物作為對照．

1.7 重油含量的測定

取 20mL發(fā)酵液，加入等體積的氯仿-甲醇混合液(1∶1)，在 50mL離心管中來回顛倒混勻；然后將混合液在4℃、12000r/min離心10min，將上清液倒入分液漏斗，待分層后將下層含有重油的液體分出；將含有重油的液體經氮吹儀氮吹，去除有機溶劑；得到的重油用氯仿-甲醇溶液再反復處理 2次，用以純化重油；重油烘干至質量恒定，計算重油含量．

1.8 普魯蘭多糖結構的測定

普魯蘭多糖的結構采用傅里葉紅外光譜儀進行分析．將 10mg樣品與 250mg溴化鉀混合均勻，用制片機在高壓條件下制成薄片，儀器掃描波長范圍為400～4000cm-1．

1.9 mRNA水平的測定

mRNA水平的測定方法參見文獻[7]．測定 apo基因用引物 APOs/APOa，測定 gltP基因用引物gltPa/gltPs．

2 結果與分析

2.1 apo和gltP對出芽短梗霉菌株生長性能的影響

通過 NCBI查詢到出芽短梗霉包含兩個載脂蛋白基因 apo和 gltP，分別構建了整合過表達 apo或gltP基因的菌株 OA21和 OG5，以及單敲 apo或者gltP基因的菌株 Δapo和 ΔgltP．重組菌株的生長情況和葡萄糖利用能力如圖 2所示．敲除 apo或 gltP后，菌株生長受到抑制，生物量分別較親本株減少了10.85%和16.84%，而整合過表達apo或gltP對生物量沒有顯著影響．敲除 apo或 gltP降低了菌株對葡萄糖的利用能力，發(fā)酵 7d消耗的葡萄糖分別較親本株減少了 4.5%和 13.3%，而整合過表達 apo或 gltP增強了菌株的葡萄糖利用能力，發(fā)酵 6d后整合過表達apo或gltP基因的菌株已經將葡萄糖消耗殆盡．

圖2 重組菌株生物量和葡萄糖利用能力同親本株的比較Fig. 2 Comparison of the cell growth and glucose utilization ability

2.2 apo和gltP對普魯蘭多糖合成的影響

為了考察載脂蛋白基因apo和gltP與普魯蘭多糖合成的關系，對所得重組菌株的普魯蘭多糖合成能力進行了測定，如圖3所示．整合過表達apo或gltP后，普魯蘭多糖產量分別較親本株增加了 7.78%和15.23%．敲除apo或gltP抑制了普魯蘭多糖的合成，普魯蘭多糖產量分別較親本株降低了 21.35%和35.07%．由此可知，相較于 apo基因，gltP基因對于普魯蘭多糖的合成更為重要．

2.3 普魯蘭多糖合成途徑關鍵酶活力

為了深入探究apo和gltP與普魯蘭多糖合成的關系，對普魯蘭多糖合成途徑中的3個關鍵酶的酶活力進行了測定，結果見表 2．由表 2可知：整合過表達 apo后，磷酸葡萄糖變位酶活力、UDPG焦磷酸化酶活力和葡萄糖基轉移酶活力分別較親本株增加了18.52%、16.60%和 15.79%．整合過表達 gltP后，磷酸葡萄糖變位酶活力、UDPG焦磷酸化酶活力和葡萄糖基轉移酶活力分別較親本株增加了 25.93%、30.23%和 36.84%．敲除apo或gltP后，磷酸葡萄糖變位酶活力、UDPG焦磷酸化酶活力和葡萄糖基轉移酶活力均出現(xiàn)不同程度的降低．

圖3 apo和gltP對普魯蘭多糖合成的影響Fig. 3 Effect of apo and gltP genes on the synthesis of pullulan

表2 重組菌株普魯蘭多糖合成途徑關鍵酶活力Tab. 2 Enzyme activity of the key enzymes in the pullulan synthesis pathway

2.4 apo和gltP對以重油為代表的脂類物質合成的影響

載脂蛋白與脂類物質的合成密切相關．出芽短梗霉所產脂類的主要成分為重油[1]．為了考察載脂蛋白基因 apo和 gltP與脂類物質合成之間的關系，選取重油作為脂類物質的代表進行研究．出芽短梗霉分泌的重油是一種脂類物質，在醫(yī)藥、化工等行業(yè)有巨大的應用前景，apo和gltP對以重油為代表的脂類物質合成的影響如圖4所示．由圖4可知：整合過表達 apo或 gltP后，重油產量分別較親本株增加了41.38%和3.5倍．敲除apo或gltP抑制了脂類物質的合成，重油產量分別較親本株降低了 17.24%和28.74%．這些結果表明，apo和gltP都能影響出芽短梗霉對重油的合成，但是gltP基因的影響更顯著．

圖4 apo和gltP對重油合成的影響Fig. 4 Effect of apo and gltP genes on the synthesis of heavy oil

2.5 普魯蘭多糖結構鑒定

采用傅里葉紅外光譜儀對重組菌株所產普魯蘭多糖結構進行了鑒定，并同普魯蘭多糖標品進行比對，結果如圖 5所示．由圖 5可知：所有樣品均在755cm-1和 915cm-1處有吸收峰，這些特征峰證實了α-(1→4)和α-(1→6)糖苷鍵的存在，而這個鍵型結構是構成普魯蘭多糖最基本的結構．同普魯蘭多糖標品的紅外光譜圖比對發(fā)現(xiàn)，所有重組菌株與標品結構基本一致，確認了所產胞外多糖為普魯蘭多糖．

圖5 重組菌株所產普魯蘭多糖與普魯蘭多糖標品紅外光譜的比對Fig. 5 Comparison of the IR spectra of pullulan produced by the recombinant strains with that of the standard pullulan

2.6 獲得的重組菌株apo和gltP基因相對表達量

對敲除或整合過表達 apo，以及敲除或整合過表達 gltP基因的菌株所對應基因的轉錄水平進行了檢測，見圖 6．從圖 6中可知，敲除 apo或 gltP基因后apo或 gltP基因轉錄幾乎檢測不到，進一步證實了apo或gltP基因已經被敲除．整合過表達apo或gltP則顯著增強了對應基因的轉錄水平，OA21菌株的apo轉錄水平較原始菌株增加了4.1倍，OG5菌株的gltP轉錄水平較原始菌株增加了3.9倍．

圖6 重組菌株對應基因轉錄水平與親本株的比較Fig. 6 Comparison of the transcription levels of the recombinant strains with parent strains

3 討 論

普魯蘭多糖理化性能獨特，在食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)應用廣泛[1]．經文獻匯總，本文繪制普魯蘭多糖合成途徑(圖7)．

圖7 普魯蘭多糖合成途徑Fig. 7 The proposed pullulan synthesis pathway

已有的文獻報道部分印證了該合成途徑，葡萄糖基轉移酶、磷酸葡萄糖變位酶、UDPG焦磷酸化酶和普魯蘭合酶被認為是普魯蘭多糖合成途徑中的關鍵酶[1,3-4]．除了上述關鍵酶外，脂類物質也同普魯蘭多糖合成密不可分．脂類物質與 UDPG的結合形成普魯蘭多糖合成的基本單元lipid-G[5]，而這是普魯蘭多糖合成所必須的．載脂蛋白負責調控脂類物質的生物合成[6]，那么載脂蛋白勢必會影響普魯蘭多糖的合成．多位研究者[5-6,11]也認為胞外多糖的合成與脂類物質緊密相關．

為了確認脂類物質是否參與普魯蘭多糖的合成過程，本文考察了載脂蛋白基因 apo和 gltP對普魯蘭多糖合成的影響．載脂蛋白基因 apo和 gltP能夠影響出芽短梗霉生長性能和葡萄糖利用能力．apo或者 gltP的敲除抑制了菌株的生長，這可能是由載脂蛋白對胞內多種細胞器膜的調控引起的[12]．敲除apo或者 gltP后菌株葡萄糖利用能力降低，這是由較慢的菌株生長和生成產物的減少引起的(圖3和圖4)．

載脂蛋白能調節(jié)脂類物質的合成和運輸[13]．本文研究結果表明整合過表達apo或者gltP能夠促進以重油為代表的脂類物質和普魯蘭多糖的合成，而敲除 apo或者 gltP則抑制了重油和普魯蘭多糖的生成．由此可知，適量增強出芽短梗霉脂類物質的合成有助于提高普魯蘭多糖產量，這與 Sutherland[11]和Simon等[6]的推測是相符合的．Price等[14]的研究表明，過度強化出芽短梗霉脂類物質的合成不利于普魯蘭多糖合成．研究結果還發(fā)現(xiàn)，雖然apo和gltP能夠調控普魯蘭多糖的產量，但是并不引起普魯蘭多糖結構的改變．

通過測定重組菌株普魯蘭多糖合成途徑中關鍵酶的酶活力，發(fā)現(xiàn)整合過表達 apo或者 gltP能夠促進葡萄糖基轉移酶、磷酸葡萄糖變位酶和 UDPG焦磷酸化酶的活力，而敲除 apo或者 gltP則降低了 3個關鍵酶的活性．葡萄糖基轉移酶、磷酸葡萄糖變位酶和 UDPG焦磷酸化酶對普魯蘭多糖合成至關重要[1,3-4]，這3個關鍵酶活力的改變能直接影響普魯蘭多糖的合成．

重油是普魯蘭多糖所產脂類物質的主要成分．研究結果顯示普魯蘭多糖產量和重油產量呈正相關，這預示著重油可能參與普魯蘭多糖合成所需基本單元糖脂中間體 lipid-G的生成．但是，并非重油合成能力越強普魯蘭多糖合成能力越強，比如 Price等[14]就發(fā)現(xiàn)過度強化的重油合成能力能夠抑制普魯蘭多糖的生成．

apo和 gltP對出芽短梗霉普魯蘭多糖合成的調節(jié)作用可以從以下幾點來解釋．第一，apo和 gltP調控脂類物質的合成，進而影響普魯蘭多糖合成所需基本單元糖脂中間體 lipid-G的生成，最終改變普魯蘭多糖合成．第二，apo和 gltP表達量的改變引起了脂類物質含量的改變，某些脂類物質作為反式作用因子強化了 UDPG 的合成[15]，導致普魯蘭多糖合成途徑中關鍵酶活力性的增加．第三，出芽短梗霉重油是一種表面活性劑[16]，重油合成的增強有助于改善出芽短梗霉細胞膜通透性[17]，有利于普魯蘭多糖的外泌．

綜上，本文研究結果表明載脂蛋白基因 apo和gltP能夠調節(jié)出芽短梗霉普魯蘭多糖的合成，并且gltP對普魯蘭多糖合成的影響大于 apo．gltP和 apo都負責介導脂類物質的轉運，但 gltP主要負責脂類物質向胞外轉運[7]，而 apo負責胞內轉運[18]，不同的分工導致了這兩個基因對于脂類物質合成的作用相區(qū)別．

4 結 語

本文研究結果顯示，整合過表達 apo或 gltP能使普魯蘭多糖產量分別增加 7.78%和 15.23%，而分別敲除apo或gltP則使普魯蘭多糖產量降低21.35%和 35.07%；證實了脂類物質和普魯蘭多糖合成緊密相關，豐富和完善了普魯蘭多糖合成途徑，為增加普魯蘭多糖合成基本單元糖脂中間體lipid-G的來源提供了新的思路．