簡旖沫 湯小虎 賴張鳳

摘要：目的?通過液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)分析桂枝附子溫通經(jīng)脈配伍灌胃后膠原關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠的血清移行成分，考察桂枝附子含藥血清對類風濕關(guān)節(jié)炎模型的影響。方法?選取雄性Wistar大鼠25只隨機取6只分為正常組、桂枝附子組，每組3只，其余大鼠采用Ⅱ型膠原造模。將造模成功的6只CIA大鼠隨機平均分為模型組、造模桂枝附子組，每組3只。予20倍給藥劑量的桂枝附子配伍灌胃給藥，正常組和模型組大鼠予生理鹽水灌胃，60 min后經(jīng)肝門靜脈取血，采用甲醇沉淀法處理血清，予LC-MS技術(shù)對其進行分析。通過將含藥血清與相同條件下測定的模型組血清、正常組血清、供試品以及對照品圖譜比較，分析大鼠給藥后血清中的移行成分。結(jié)果?桂枝附子組含藥血清中產(chǎn)生了10個移行成分，均為代謝產(chǎn)物;造模桂枝附子組含藥血清產(chǎn)生了25個移行成分，其中8個為原形成分，17個為代謝產(chǎn)物。結(jié)論?造模后大鼠的含藥血清中移行成分明顯增加，成分濃度也較高。由此可見，CIA大鼠病理模型選擇性的吸收了桂枝附子含藥學清中的成分，從基礎(chǔ)層面探討中醫(yī)“有是病用是藥”理論。

關(guān)鍵詞：CIA病理模型;類風濕關(guān)節(jié)炎;桂枝附子;含藥血清;LC-MS

中圖分類號：R255.6?文獻標志碼：A?文章編號：1007-2349（2019）04-0069-05

風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是慢性、侵蝕性、全身性的自身免疫疾病，其基本病理改變?yōu)閷ΨQ性的關(guān)節(jié)滑膜炎，血管翳形成，并逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的侵蝕與破壞，最終可導致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。目前治療RA的常用藥物為非甾體類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素類和慢作用抗風濕藥等，這些藥物的毒副作用較大，而生物制劑則價格昂貴。結(jié)合我國幾千年中醫(yī)藥治療風濕病的特色，及云南吳佩衡扶陽學術(shù)思想，以溫陽通絡(luò)法治療風濕病為切入點，開展中醫(yī)藥防治風濕病，對提高人民群眾健康水平具有重要的意義。通過臨床實踐及實驗研究發(fā)現(xiàn)，溫陽通絡(luò)法對風寒濕痹的臨床癥狀有明顯改善，可顯著降低CRP、ESR、RF滴度等指標。其中桂枝、附子做為主要藥物，具有溫經(jīng)通陽、散寒除濕之功，發(fā)揮著蠲痹止痛之效。藥物經(jīng)口服后通過消化道直接吸收入血，或經(jīng)消化酶及腸內(nèi)菌群的分解成代謝產(chǎn)物被吸收入血。中藥的有效物質(zhì)最終都會以血液為媒介輸送到不同的作用靶點發(fā)揮藥效。本課題通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）分析桂枝、附子以及桂枝附子溫通經(jīng)脈配伍灌胃后膠原關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠的血清移行成分，考察含藥血清對CIA大鼠模型的影響，建議入血色譜圖，進一步探討桂枝附子配伍灌胃后的入血藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及配伍環(huán)境的相互作用，從而為桂枝附子溫通經(jīng)脈配伍抗RA提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?實驗動物?雄性Wistar大鼠25只，SPF級，體重（200±20）g;由成都達碩生物科技有限公司提供，實驗動物使用許可證號SCXK（川）2013-24。

1.2?實驗藥材于與試劑?中藥材桂枝、附子由云南省中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供。牛Ⅱ型膠原，四川大學;完全弗氏佐劑（263810，BD公司）;苯甲酰新烏頭原堿63238-67-5、苯甲酰烏頭原堿466-24-0、苯甲酰次烏頭原堿63238-66-4、桂皮醛89Z9-G2NP、對甲氧基桂皮酸乙酯XW99-CWBR、肉桂酸VUZS-DKSH，均來自中國藥品生物制品檢定所;甲醇、乙酸乙酯、乙腈、三氯乙酸、冰醋酸等。

1.3?實驗儀器?Waters Xevo TQD三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，美國Waters公司;Agilent1100 高效液相色譜儀，美國Agilent公司;AL 204萬分之一分析天平，瑞士Metter T-oledo公司;Biofuge Primo R 離心機，德國Thermo ScientificHeraeus公司;YLS-7B足趾容積測量儀，濟南益延科技發(fā)展有限公司。

1.4?醇提浸膏的制備

1.4.1?附子醇提浸膏的制備?取附子藥材飲片，打粉過60目篩，精密稱定600 g，置圓底燒瓶中，按料液比1：10（g/mL）加入95%乙醇，于超聲清洗器中振蕩提取50min，浸泡1天，回流提取2h，提取2次，過濾，合并提取液，測定浸膏得率，回收乙醇得浸膏，滅菌后置低溫處保存?zhèn)溆肹1-2]。

1.4.2?桂枝醇提浸膏的制備?取桂枝藥材飲片，打粉過60目篩，精密稱定600 g，置圓底燒瓶中，按料液比1：10（g/mL）加入95%乙醇，熱回流提取2 h，連續(xù)3次，合并濾液，測定浸膏得率，回收乙醇得浸膏，滅菌后置低溫處保存?zhèn)溆肹3]。

1.5?含藥血清和空白血清的制備?選取Wistar大鼠25只，隨機選取4只平均分為正常組和桂枝附子組，每組2只，剩下21只造CIA大鼠模型。造模后21天的大鼠采用關(guān)節(jié)炎分數(shù)評分法計算關(guān)節(jié)炎指數(shù)。將造模成功后的4只大鼠隨機平均分為模型組和造模桂枝附子組，每組2只。根據(jù)云南扶陽流派臨床常用生藥劑量（桂枝20 g，制附子30 g）的20倍給藥，按“人和動物之間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算出大鼠等效劑量，即實驗組大鼠相當給生藥量為90 g·kg-1。桂枝附子組以及造模桂枝附子組予桂枝附子配伍灌胃，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，給藥容積為1 mL/100 g。給藥前將大鼠禁食12 h，使大鼠處于空腹狀態(tài)，以促進藥物的吸收。灌胃后60 min于肝門靜脈取血0.5 mL，待血液凝固后，置離心機于4 ℃，12000 r，3 min離心后分離血清，同組血清合并，用甲醇沉淀法對血清進行處理。造模評價方法：致炎后第21天采用關(guān)節(jié)炎分數(shù)評分法計算關(guān)節(jié)炎指數(shù)。0級：無紅斑或腫脹，0分;I級：輕微的紅斑和一個趾關(guān)節(jié)腫脹，1分;II級：紅斑和超過一個趾關(guān)節(jié)的腫脹，2分;III級：紅斑和踝部或腕部腫脹，3分;IV級：全部紅斑以及腳趾和踝部或手指和腕部的腫脹，踝或腕不能彎曲，4分;4只肢體關(guān)節(jié)腫脹級之和（最高分為16分）即為大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)，大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)≥2為造模成功的標準。7天/次，共4次。

1.6?供試品的制備?精密稱取附子、桂枝浸膏1 g，置100 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

1.7?對照品溶液的制備?分別精密稱定桂皮醛對照品、肉桂酸對照品、對甲氧基桂皮酸乙酯對照品、苯甲酰新烏頭原堿對照品、苯甲酰烏頭原堿對照品、苯甲酰次烏頭原堿對照品適量，精密稱定，加入甲醇制備成每1 mL含10μg的溶液。

1.8?檢測條件

1.8.1?色譜條件?ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱;水為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫程序為甲醇的濃度梯度 1%（0-1.0 min），1.0%-3.0%（1.0-1.5 min），3.0%-32%（1.5-13.5 min），32%-60%（13.5-18.5 min），60%-90%（18.5-20.5 min）進行梯度洗脫;柱溫25度，流速5μL/min;測波長分別為242 nm、254 nm、265 nm、290 nm及320 nm。

1.8.2?質(zhì)譜條件?電噴霧離子源（正負離子掃描）;正離子掃描為3000 V，負離子掃描為2800 V，離子源溫度為110 ℃，霧化氣流量為150 L/h，脫溶劑氣流量為600 L/h，脫溶劑溫度為250 ℃，毛細管電壓錐孔電壓為35 V，微通道板電壓為2700 V，碰撞氣為氬氣，碰撞能為4 V;每0.1s采集一次譜圖;亮氨酸-腦啡肽（leucine-enkephalin，[M+H]+=556.2771;[M-H]-=554.2615）溶液校正質(zhì)量，進樣速度為100 μL/min，頻率為5 s;采用全掃描方式，掃描范圍m/z100～1000Da。

1.9?測定與方法學考察?分別吸取含藥血清、空白血清、供試品溶液、對照品溶液各10μL，注入高效液相色譜質(zhì)譜儀，予液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）對血清進行檢測分析。通過記錄桂皮醛對照品、肉桂酸對照品、對甲氧基桂皮酸乙酯對照品、苯甲酰新烏頭原堿對照品、苯甲酰烏頭原堿對照品、苯甲酰次烏頭原堿對照品以及空白血清的色譜圖，觀察相同保留時間處空白血清色譜圖中是否檢測出對照品的色譜峰。結(jié)果顯示對照品及大鼠血清內(nèi)源性物質(zhì)均實現(xiàn)基線分離，且在對照品色譜峰的“信號窗”（信號附近的有限范圍）內(nèi)沒有出現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)信號的干擾。

2?實驗結(jié)果

通過對比含藥血清與正常組空白血清的圖譜，篩選出有差異化合物峰，即為桂枝、附子灌胃后血中移行成分;通過對比含藥血清中的移行成分與桂枝、附子供試品的圖譜，篩選相同的化合物峰，即為被吸收的原型成分，在中藥供試品圖譜中沒有被檢測到的化合物峰即為代謝產(chǎn)物[4]。通過分析相關(guān)圖譜，考察類風濕關(guān)節(jié)炎造模對中藥灌胃后大鼠血清中移行成分的影響。

進樣14 min～18 min正離子模式下造模桂枝附子組、桂枝附子組以及正常組的血清質(zhì)譜圖。通過質(zhì)譜圖的對比，在造模桂枝附子組的血清中檢測到離子峰m/z409.2與m/z425.2，m/z429.3，m/z452.2。桂枝附子組的血清中檢測到離子峰m/z318.3，m/z362.4與m/z384.4。

同理，通過對比0 min～2 min，2 min～6 min，6 min～10 min，10 min～14 min，14 min～18 min以及18 min～22 min的正、負離子模式下造模桂枝附子組、桂枝附子組、正常組的血清以及桂枝、附子供試品相同時段質(zhì)譜圖，結(jié)果顯示CIA大鼠灌胃桂枝附子配伍后含藥血清中產(chǎn)生了25個移行成分，其中8個為中藥原形成分，其余17個為代謝產(chǎn)物;正常大鼠灌胃桂枝附子后含藥血清中產(chǎn)生了10個移行成分，均為代謝產(chǎn)物。見表1、表2。

3?討論

中醫(yī)辨病論治的理論由來已久。《黃帝內(nèi)經(jīng)》早有熱論、咳論、痿論、痹論、厥論、風論、瘧論、癲狂等病名的記載，而“內(nèi)經(jīng)十三方”也提及的相應(yīng)疾病，如生鐵落飲治療狂證，雞矢醴治療臌脹，蘭草湯治療脾癉等等[5]?！吨T病源候論》、《神農(nóng)本草經(jīng)》、《千金要方》以及《三因極一病證方論》等古籍也有關(guān)于辨病論治的闡述。明清時期醫(yī)家喻嘉言曰：“有是病用是藥，病千變，藥亦千變”;“故治病必先識病，識病然后議藥，藥者所以勝病者也。識病，則千百藥中，任舉一二種用之且通神;不識病，則歧多而用眩。”辨識疾病是治療疾病的首要任務(wù)和方法。近代著名醫(yī)家岳美中指出“有是病即用是藥，故一病有一病之專方……不能辨病，焉能識證，不能用方，焉能施治”，同樣強調(diào)了辨病論治的重要性。疾病是機體在一定病因作用下，因自穩(wěn)調(diào)節(jié)紊亂而發(fā)生的異常生命活動過程。由于生理與病理狀態(tài)下機體對藥物的吸收分布不同，隨之產(chǎn)生的藥效物質(zhì)成分也不同，而這些差異很大程度上影響中藥的藥效的發(fā)揮。本實驗采用血清藥化學方法，通過分析比較模型組與非模型組含藥血清成分，考察桂枝附子含藥學清對CIA大鼠病理模型的影響，探討中醫(yī)“有是病用是藥”以及“有故無殞，亦無殞”的理論基礎(chǔ)。

中藥以及中藥復方是一個巨大而復雜的系統(tǒng)，其藥效的發(fā)揮是多種化學成分相互作用產(chǎn)生的綜合效果[6]。中藥的有效物質(zhì)最終都會以血液為媒介輸送到不同的作用靶點從而發(fā)揮藥效[7]。20世紀90年代初王喜軍教授提出了“中藥血清藥物化學”理論及研究內(nèi)容，研究結(jié)果不僅揭示中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，也為解析方劑配伍規(guī)律、闡釋中藥藥理學特性等中醫(yī)藥研究提供了科學有效的方法。本課題利用CIA大鼠模型模擬人類類風濕關(guān)節(jié)炎，從藥物吸收情況考察桂枝附子含藥血清對類風濕關(guān)節(jié)炎模型的影響，從而驗證了中醫(yī)“有是病用是藥”的理論基礎(chǔ)。CIA大鼠發(fā)病機制主要是由Ⅱ型膠原活化的T細胞和巨噬細胞早期侵入滑膜內(nèi)層，局部釋放炎性因子，隨著粒細胞等侵入，共同形成血管翳[8]。破骨細胞和膠原酶的介入最終導致骨結(jié)構(gòu)的喪失，自愈再發(fā)的反復過程中新生骨的形成，致使關(guān)節(jié)變形和僵硬。CIA大鼠膝、踝關(guān)節(jié)可見明顯的滑膜細胞增生、毛細血管增生以及炎細胞浸潤與關(guān)節(jié)軟骨面剝脫，這些表現(xiàn)接近人類的類風濕關(guān)節(jié)炎[9]。相關(guān)報道顯示殷飛等通過觀察正常大鼠、病理狀態(tài)的大鼠清肝化瘀方藥含藥血清對人肝癌細胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示病理狀態(tài)下大鼠的血清對肝癌細胞有明顯的抑制作用[10]。呂濤等用40%CCl4皮下注射9周制備大鼠肝纖維化模型，運用HPLC檢測正常、肝纖維化大鼠分別灌服黃芪后血清中的黃芪甲苷含量，結(jié)果病理大鼠含藥血清中的黃芪甲苷含量高于正常大鼠含藥血清[11]。由此可見，病理狀態(tài)下的機體對藥物的吸收有促進作用。正常生理狀態(tài)下的動物血清能在一定程度上避免疾病機體對體內(nèi)藥物有效成分的“消耗”，從而導致正[FQ（21*1。175mm，X，DY-W]常動物血清中的有效成分與病理狀態(tài)的有所差異[12]。由于生理與病理狀態(tài)下機體對藥物的吸收轉(zhuǎn)化不同，產(chǎn)生的內(nèi)源性活性成分及其濃度也有所不同。本實驗結(jié)果顯示CIA大鼠的含藥血清產(chǎn)生了25個移行成分，其中8個為原形成分，17個為代謝產(chǎn)物;而未造模大鼠含藥血清只產(chǎn)生10個移行成分，CIA大鼠的含藥血清濃度也較未造模的高。由此可見類風濕關(guān)節(jié)炎模型促進了桂枝附子配伍有效成分的吸收。故病理狀態(tài)下制備的中藥含藥血清更有利于中藥藥效的發(fā)揮，其結(jié)果也更加真實、可靠。這也從基礎(chǔ)層面驗證了中醫(yī)“有是病用是藥”的理論，這不僅為中醫(yī)藥現(xiàn)代化、國際化提供了一定的途徑，也而為更好的指導臨床提供了理論基礎(chǔ)。

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