五氯柳胺混懸液抑菌效力測定

孫繼超,姜興粲,王瑋瑋,董 朕,周緒正,張繼瑜

(中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室,甘肅 蘭州 730050)

肝片吸蟲病是由肝片吸蟲引起的食源性人獸共患病,五氯柳胺作為水楊酰苯胺類化學合成抗蠕蟲藥物,主要用于防治牛羊動物的吸蟲病、絳蟲病和蛔蟲病,對線蟲有一定的治療效果,其通過抑制蟲體線粒體中氧化磷酸化過程從而阻礙三磷酸腺苷的生成,使蟲體因能量耗盡而死亡[1-2]。五氯柳胺混懸液藥物粒徑小,顆粒粘附性高,相對于市售其他劑型,其藥物吸收度好,分布面積大[3]。

1 材料

1.1 供試品 五氯柳胺混懸液(中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所生產(chǎn),規(guī)格：100 mL∶3.4 g,批號：20180605)。

1.2 供試菌株 銅綠假單胞菌[CMCC(B)10 104]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44 102]、黑曲霉[CMCC(F)98 003]和白色念珠菌[CMCC(F)98 001]菌種0代,均購自中國食品藥品檢定研究院醫(yī)學菌種保藏中心,工作使用第3代傳代菌種。

1.3 培養(yǎng)基 胰酪胨大豆液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA),均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,經(jīng)培養(yǎng)基的適用性檢查,結(jié)果符合規(guī)定。

1.4 儀器 生物潔凈安全柜(上海力申,HFsafe-1 200LC型)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司,GHP-9 270型)；振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚有限公司,ZQZY-75BN型)；全波長酶標儀(Thermo Fisher,Multiskan公司,GO-1 510型)；超低溫冰箱(Thermo scientific公司,700系列)；高壓滅菌鍋(馳通儀器(上海)有限公司,CT62A型)；微量移液槍(Eppendorf公司,100 μL,1 mL)；一次性無菌培養(yǎng)皿(Thermo公司)。

2 方法

2.1 菌液的制備 將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠芽孢桿菌、白色念珠菌以及黑曲霉的第3代新鮮培養(yǎng)物制備為108CFU/mL的菌(孢子)懸液,用0.9%無菌氯化鈉溶液制成濃度約為100～1 000 CFU/mL的菌(或孢子)懸液[4]。

2.2 計數(shù)方法適用性

2.2.1 細菌計數(shù)方法適用性確認平皿法作為試驗組 取制備好的供試液,以稀釋液代替菌液同試驗組操作,作為供試液對照組。取不含中和劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液同試驗組操作,作為菌液對照組。取含中和劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液同試驗組操作,作為中和劑對照組。

2.2.2 真菌和酵母菌計數(shù)方法適用性確認 常規(guī)法聯(lián)合中和法：取五氯柳胺混懸液1 mL,分別置于2支無菌試管中,每管加入含0.5%碳酸氫鈣的pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至9 mL,混勻后,制成1∶10的供試液,混勻使每1 mL 1∶10的供試液中含菌(或孢子)量≤100 CFU,取此供試液1 mL,注入平皿中,傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,平行制備2個平皿,待凝固后,置25℃培養(yǎng)5 d,觀察并記錄菌落數(shù),作為試驗組。取制備好的供試液,以稀釋液代替菌液同試驗組操作,作為供試液對照組。取不含中和劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液同試驗組操作,作為菌液對照組。取含中和劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液同試驗組操作,作為中和劑對照組[6]。

根據(jù)細菌、真菌和酵母菌計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果,計算中和劑對照組菌落數(shù)與菌液對照組菌落數(shù)的比值,計算試驗組菌落數(shù)減去供試液對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值。

2.3 抑菌劑劑量驗證試驗 各取100 mL不加抑菌劑的五氯柳胺混懸液轉(zhuǎn)移至15個無菌容器中,分為三組：五氯柳胺A組加入對羥基苯甲酸甲酯0.15 g/L；五氯柳胺B組加入對羥基苯甲酸丙酯0.1 g/L；五氯柳胺空白組不加入抑菌劑。

各取100 mL不加入五氯柳胺的混懸液轉(zhuǎn)移至20個無菌容器中,分為四組：對照A組加入對羥基苯甲酸甲酯0.15 g/mL；對照B組加入對羥基苯甲酸丙酯0.1 g/mL；對照混合組加入對羥基苯甲酸甲酯0.15 g/mL和對羥基苯甲酸丙酯0.1 g/mL；對照空白組不加入抑菌劑。

上述8組分別接種上述試驗菌108CFU,充分混合,將容器內(nèi)的試驗菌分布均勻。然后將接種后的容器置于20℃ ～25℃避光保存,并防止被污染。貯存過程中,分別在14 d和28 d分別從供試品中取1 mL稀釋后,計數(shù)。根據(jù)菌落測定結(jié)果,計算1 mL供試品各間隔時間的菌數(shù),并換算成lg值。

另取5個容器,加入0.9%氯化鈉溶液10 mL,然后與樣品組同法操作后用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋計數(shù)。根據(jù)菌落測定結(jié)果,計算1 mL供試品中始濃度菌數(shù),并換算成lg值[7]。

2.4 抑菌效力試驗 各取100 mL五氯柳胺混懸液供試品轉(zhuǎn)移至5個無菌容器中,分別接種上述試驗菌108CFU,充分混合,將供試品中的試驗菌分布均勻。然后將接種后的供試品置于20℃～25℃避光保存,并防止被污染。貯存過程中,分別在14 d和28 d分別從供試品中取1 mL計數(shù)。根據(jù)菌落測定結(jié)果,計算1 mL供試品各間隔時間的菌數(shù),并換算成lg值。

另取5個容器,加入0.9%氯化鈉溶液100 mL,然后與樣品組同法操作計數(shù)。根據(jù)菌落測定結(jié)果,計算1 mL供試品中始濃度菌數(shù),并換算成lg值。

3 結(jié)果與分析

3.1 細菌、真菌和酵母菌計數(shù)方法適用性確認結(jié)果

中和劑對照組菌落數(shù)與菌液對照組菌落數(shù)的比值,試驗組菌落數(shù)減去供試液對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值,均在規(guī)定范圍內(nèi),方法適用性結(jié)果符合要求,說明細菌可采用平皿法聯(lián)合中和法計數(shù),真菌和酵母菌可采用常規(guī)法聯(lián)合中和法對細菌進行計數(shù)。結(jié)果見表1。

表1 細菌計數(shù)方法適用性

真菌和酵母菌方法適用性試驗結(jié)果：中和劑對照組菌落數(shù)與菌液對照組菌落數(shù)的比值,試驗組菌落數(shù)減去供試液對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值,均在規(guī)定范圍內(nèi),方法適用性試驗結(jié)果符合要求,說明可采用常規(guī)法聯(lián)合中和法對真菌和酵母菌進行計數(shù)。結(jié)果見表2。

表2 真菌和酵母菌計數(shù)方法適用性

3.2 抑菌劑劑量驗證試驗結(jié)果 抑菌劑劑量驗證試驗各時間段的菌落lg值見表3。由2015版《中國獸藥典》一部附錄1121抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則中的評價標準中規(guī)定,五氯柳胺混懸液按照“內(nèi)服制劑、直腸給藥制劑的抑菌效力判斷標準”來進行評價。要求為：細菌14 d菌數(shù)下降不少于3 lg值,28 d相對于前一個測定時間,試驗菌增加的數(shù)量不超過0.5 lg值；真菌14 d菌數(shù)下降不少于1 lg值,28 d相對于前一個測定時間,試驗菌增加的數(shù)量不超過0.5 lg值。表3數(shù)據(jù)表明,添加抑菌劑對羥基苯甲酸甲酯0.15 g/L和對羥基苯甲酸丙酯0.1 g/L的混合組,與只添加對羥基苯甲酸甲酯0.15 g/L或只添加對羥基苯甲酸丙酯0.1 g/L的組相比,更加符合“內(nèi)服制劑、直腸給藥制劑的抑菌效力判斷標準”的要求；且五氯柳胺本身具有一定的抑菌活性。

表3 抑菌劑劑量驗證試驗數(shù)據(jù)

3.3 抑菌效力試驗結(jié)果 抑菌效力試驗各時間段的菌落lg值見表4。由2015版《中國獸藥典》一部附錄1121抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則中的評價標準中規(guī)定,五氯柳胺混懸液按照“內(nèi)服制劑、直腸給藥制劑的抑菌效力判斷標準”來進行評價。要求同3.2。表4數(shù)據(jù)表明,該供試品的抑菌效力對細菌和真菌能夠達到“內(nèi)服制劑、直腸給藥制劑的抑菌效力判斷標準”的要求。該供試品符合規(guī)定。

表4 抑菌效力試驗數(shù)據(jù)

4 討論

4.1 存活菌數(shù)的測定方法的確認 抑菌效力檢查試驗過程中,需要在規(guī)定的間隔時間測定每份供試品中存活菌數(shù),因此存活菌數(shù)的測定方法的正確與否,直接關(guān)系能否真實反映藥品抑菌效力的強弱。由于五氯柳胺混懸液具有一定的抑菌活性,對細菌和真菌均有抑菌作用,而碳酸氫鈣能中和五氯柳胺的抑菌作用,因此在存活菌數(shù)的測定方法中采用含0.5%碳酸氫鈉的pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋劑,該中和劑能中和該混懸劑中五氯柳胺的抑菌作用,并且不影響微生物的生長。為保證菌數(shù)測定結(jié)果能真實反映供試品中存活菌數(shù)的真實情況,對選定的菌數(shù)測定方法進行方法適用性確認,結(jié)果細菌計數(shù)可采用常規(guī)法聯(lián)合中和法,真菌和酵母菌計數(shù)可采用常規(guī)法聯(lián)合中和法。

4.2 抑菌劑劑量驗證試驗結(jié)果的分析 抑菌劑劑量驗證試驗中,得出將對羥基苯甲酸甲酯0.15 g/L和對羥基苯甲酸丙酯0.1 g/L混合加入五氯柳胺混懸液中作為抑菌劑,其對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌具有較強的滅菌作用,在第14天時,菌落數(shù)降為零；第28天時,細菌、真菌和酵母菌都會被完全滅殺。因為制劑中添加的抑菌劑都具有一定的毒性,為保證用藥安全,制劑中添加的抑菌劑濃度應(yīng)考慮調(diào)整至對動物不會造成副作用為宜。

4.3 抑菌效力測定結(jié)果的分析 由于五氯柳胺混懸液為瓶裝制劑,容易在貯藏和使用過程中發(fā)生微生物污染,尤其是在治療的過程中,容易被微生物污染[8-9]；但五氯柳胺混懸液中的有效成分五氯柳胺,本身具有一定的抑菌活性,與國外對于五氯柳胺抑制白色念珠菌和幽門螺旋桿菌[10-11]均有報道,并且對于其抗癌活性也有相關(guān)研究[12]的結(jié)果相符合。本試驗按照《中國獸藥典》2015年版“抑菌效力檢查法”對其抑菌效力進行了測定,結(jié)果表明該產(chǎn)品符合《中國獸藥典》要求,具有充分的抗菌效力,可避免在貯藏和使用過程中發(fā)生微生物污染。