王 鑫， 王玉仙， 趙 犇， 楊海麟

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122)

近年來人們對健康的追求不斷提升，由于ω-3族長鏈多不飽和脂肪酸具有預(yù)防心腦血管疾病等醫(yī)療功效，逐漸被市場青睞。微擬球藻屬（Nannochloropsis）微藻是一種優(yōu)質(zhì)的水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料，富含二十碳五烯酸EPA（Eicosapentaenoic acid，20：5-Δ5，8，11，14，17），其胞內(nèi)油脂及 EPA 含量受光照[1]、氮源種類及濃度[2-3]等因素影響。微藻油脂是制備生物柴油的理想原料[4]，由于微擬球藻在氮匱乏條件下油脂質(zhì)量可達(dá)藻體干質(zhì)量的55%～68%，已被研究者視為生產(chǎn)生物柴油的潛力藻種之一。近年來，研究者對微擬球藻屬多個種進(jìn)行全基因組測序及基因注釋[5]、功能基因克隆表達(dá)[6]等研究工作，并針對其開發(fā)了高效的電轉(zhuǎn)化同源重組技術(shù)[5]，微擬球藻現(xiàn)已成為模式藻種之一。

氮源是微藻生長主要營養(yǎng)元素之一，是組成蛋白質(zhì)和DNA的重要元素，在培養(yǎng)基中主要以硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽及尿素形式提供。藻類代謝硝酸鹽需要經(jīng)過三大步驟：1）外界環(huán)境中的硝酸鹽在專一性透酶作用下進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，此步驟需要消耗能量； 2）硝酸鹽經(jīng)NAD （P）H-硝酸鹽還原酶（EC 1.6.6.2）及鐵氧還蛋白-亞硝酸鹽還原酶（EC 1.7.7.1）催化還原為銨根離子，此步驟需要消耗大量還原力；3）銨根離子經(jīng)谷氨酰氨合酶-谷氨酸合酶循環(huán)被加載到碳骨架上。銨鹽的吸收代謝不需要還原酶的參與。綠藻的硝酸鹽還原酶（EC 1.6.6.2）主要位于葉綠體中的蛋白質(zhì)核上[7]；綠藻的亞硝酸鹽還原酶（EC 1.7.7.1）主要位于葉綠體區(qū)域，包括類囊體及蛋白質(zhì)核上[8]。因此，藻類還原硝酸鹽主要的能量源于葉綠體的光反應(yīng)過程中產(chǎn)生的ATP和NADPH。

陸向紅等[3]研究發(fā)現(xiàn)，眼點微擬球藻更易同化銨根離子。本研究顯示，眼點微擬球藻細(xì)胞代謝不同類型氮源（氯化銨、乙酸銨、硝酸鈉）的途徑及能量需求差異，在微觀方面會造成主要生化組分及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)差異，宏觀方面會造成微藻生物量及生產(chǎn)強度差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

眼點微擬球藻（Nannchloropsis oculata）：購自中國海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫； 培養(yǎng)基：人工海水添加f/2營養(yǎng)元素。

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；FA 1004電子天平：上海上天精密儀器有限公司；JY 1002電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DZS-706A多參數(shù)分析儀：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HYL-A全溫?fù)u瓶柜：太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；GC-2010氣相色譜儀：日本SHIMADZU；R-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：無錫申科儀器有限公司；3K15離心機(jī)：德國SIGMA。

1.2 實驗方法

1.2.1 預(yù)培養(yǎng)實驗 采用500 mL鼓泡瓶反應(yīng)器培養(yǎng)，裝液量為400 mL，起始藻濃度調(diào)整至0.1 g/L左右，置于恒溫光照搖瓶柜中，培養(yǎng)條件為：溫度（25 ± 1） ℃，光強 13 μmol/（m2·s），培養(yǎng)基中初始硝態(tài)氮濃度為3 mmol/L，預(yù)培養(yǎng)5 d至其生長進(jìn)入對數(shù)生長中期后，8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，再用滅菌去離子水重懸清洗藻體后離心棄上清液，最后用不含氮的培養(yǎng)基重懸。

1.2.2 不同類型氮源補料實驗 將預(yù)培養(yǎng)獲得的種子液調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度至0.1 g/L并分配至500 mL鼓泡瓶反應(yīng)器，裝液量為400 mL，分別補加氯化銨、乙酸銨、硝酸鈉濃縮液，并控制每組初始氮元素濃度約為3 mmol/L，控制培養(yǎng)基pH 8～9范圍內(nèi)。培養(yǎng)5 d至各組生長進(jìn)入對數(shù)生長中期，取樣測定各組生化組分、油脂和脂肪酸組成以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)30 d至各組生長進(jìn)入穩(wěn)定期后，計算細(xì)胞生產(chǎn)強度。

1.2.3 生物量測定 參照鞏波等[9]方法，采用紫外可見光光度計測定各組樣品在688 nm處的吸光值，計算培養(yǎng)液中微擬球藻質(zhì)量濃度。

生物量（g/L） =0.182 8A688-0.009（R2=0.993）

1.2.4 生化組分測定 分別取藻液1、2、2、2 mL測定葉綠素a、總蛋白質(zhì)、總油脂、總糖。葉綠素a質(zhì)量濃度測定采用潘欣等[10]的二甲基甲酰胺（DMF）法測定。

葉綠素 a（mg/L） =12.7A663-2.35A645

總蛋白質(zhì)質(zhì)量測定采用福林酚法[11]，以牛血清白蛋白BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總蛋白質(zhì)質(zhì)量（μg） =714A660-40（R2=0.996）

總油脂質(zhì)量測定采用磷酸香草醛法[12]，以微擬球藻藻油作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總油脂質(zhì)量（μg）=87A530-2.7（R2=0.999）

總糖質(zhì)量測定采用硫酸苯酚法[13]，以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總糖（μg）=278A485-8.6（R2=0.995）。

1.2.5 脂肪酸組成檢測 取10 mL藻液，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，60℃干燥箱烘干1 h。加入0.5 mol/L NaOH/甲醇 2 mL，60℃水浴 1 h，冷卻至室溫，加入4℃保存的25%三氟化硼甲醇溶液2 mL，60℃水浴30 min，冷卻至室溫，加入飽和NaCl溶液1 mL，2 mL正己烷，振蕩 60 s，靜置2 min分層，取正己烷相用于檢測。檢測前樣品要用無水Na2SO4脫水，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后上樣，防止損壞氣相色譜柱。色譜柱型號：Agilent HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm），火焰離子檢測器 FID。升溫程序：130℃恒溫2 min，每分鐘10℃的升溫速率升高到180℃，之后每分鐘4℃的升溫速率升高到240℃并保持6 min。進(jìn)樣口溫度250℃，檢測器溫度250℃。載氣N2流速為3 mL/min，H2流速為40 mL/min，空氣流速為 400 mL/min，分流比為 10∶1，進(jìn)樣量為 1 μL。

1.2.6 藻油提取 取100 mg凍干微擬球藻藻粉，加入石英砂充分研磨，將獲得的粉末平分至40 mL具塞聚丙烯離心管中，各加入20 mL甲醇∶氯仿∶去離子水（體積比 2∶1∶0.8），劇烈振蕩混勻，8 000 r/min離心10min，將上清液合并后各取15mL加入到30mL具塞玻璃離心管，加入氯仿及去離子水調(diào)整甲醇∶氯仿∶去離子水（體積比 2∶2∶1.8），振蕩混勻，3 000 r/min離心10 min，合并下層氯仿層于旋蒸瓶中，設(shè)置40℃、50 r/min旋蒸去除氯仿后得藻油。

1.2.7 油脂分離 取1 g藻油，加入10 g正己烷∶乙醚（體積比 1∶1），室溫攪拌 1 h，分裝至 10 mL 離心管，8 000 r/min離心10 min，將上層液倒入旋蒸瓶，設(shè)置40℃、50 r/min旋蒸去除溶劑后得中性藻油；下層殘油中加入10 g丙酮，混勻后于4℃靜置12 h，分裝至10 mL離心管，8 000 r/min離心10 min，將上層液倒入旋蒸瓶，設(shè)置40℃、50 r/min旋蒸去除溶劑后得極性藻油。

1.2.8 藻細(xì)胞透射電鏡觀察 取10 mL藻液，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，用PB緩沖液（pH 7.5）重懸后離心，棄上清液，重復(fù)此操作兩次。用2.5 g/dL戊二醛4℃固定48 h，充分漂洗后用1 g/dL鋨酸4℃固定2 h，用酒精、丙酮梯度脫水各30 min，然后用Epon812包埋聚合 （35℃ 16 h，48℃ 24 h，65℃48 h）。金剛石刀超薄切片后用200目銅網(wǎng)收集。經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色后，TEM-2100透射電子顯微鏡觀察[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用origin軟件進(jìn)行分析，每個實驗重復(fù)3次，實驗所得值為平均值加上標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源類型對眼點微擬球藻生化組分的影響

2.1.1 對主要生化組成的影響 氮源是微藻生長主要營養(yǎng)元素之一，在培養(yǎng)基中主要以硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽及尿素形式提供。氮源類型差異會影響微藻氮代謝，進(jìn)一步造成胞內(nèi)生化組分的變化。圖1顯示了氯化銨、乙酸銨、硝酸鈉這三種氮源對眼點微擬球藻胞內(nèi)葉綠素a、總蛋白質(zhì)、總碳水化物及總油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。

圖1 不同氮源類型眼點微擬球藻胞內(nèi)主要生化組分的變化Fig.1 Variations of the main biochemical composition of N.oculata grown under different kind of nitrogen sources

培養(yǎng)終了時，氯化銨、乙酸銨、硝酸鈉組的胞內(nèi)葉綠素 a質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 3.12%、3.16%、3.32%；胞內(nèi)總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為49.7%、50.0%、42.8%；胞內(nèi)碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.2%、8.3%、16.5%；胞內(nèi)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.9%、13.5%、11.4%。葉綠素a是微擬球藻僅含的葉綠素類型，其胞內(nèi)葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)受培養(yǎng)環(huán)境及營養(yǎng)因素影響。Sukenik等[1]研究發(fā)現(xiàn)光強與葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)負(fù)相關(guān)； Simionato等[14]研究發(fā)現(xiàn)缺氮會造成葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。作者研究發(fā)現(xiàn)，氮源類型也會影響胞內(nèi)葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)，硝酸鈉組葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)比氯化銨、乙酸銨組分別提高了6.4%、5.1%。不同氮源類型同化吸收需要消耗的能量存在差異，同化一分子銨根離子需要消耗ATP及NADPH各一分子；硝態(tài)氮同化吸收，需要經(jīng)硝酸鹽還原酶[7]、亞硝酸鹽還原酶[8]的催化生成銨根離子后才可被藻細(xì)胞直接利用，因此消耗的能量更多。微擬球藻同化氮源的最終能量來源為光能，增加葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)有利于光能吸收，從而強化藻細(xì)胞光反應(yīng)，產(chǎn)生大量的同化力（ATP、NADPH及還原態(tài)的鐵氧還蛋白），用于同化硝態(tài)氮。

微擬球藻利用硝態(tài)氮合成蛋白質(zhì)需要多種酶的參與，且消耗大量能量，因此硝態(tài)氮同化效率較銨氮低。作者研究發(fā)現(xiàn)，氯化銨、乙酸銨組蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異很小，但均高于硝酸鈉組，且較之分別提高了16.1%、16.8%。

氯化銨、硝酸鈉組碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于油脂含量，乙酸銨組結(jié)果相反。研究表明，微擬球藻在缺氮培養(yǎng)條件下，碳元素主要流向油脂[2]； 氯化銨、硝酸鈉組結(jié)果表明，在氮充足情況下，微擬球藻固定的碳元素主要流向碳水化合物。Schneider等[15]研究發(fā)現(xiàn)，微擬球藻利用乙酸鹽合成脂肪酸，且主要用于延長碳鏈。乙酸銨組結(jié)果表明，微擬球藻利用乙酸銨一方面利用銨根離子合成蛋白質(zhì)，另一方面利用乙酸合成油脂，因此乙酸銨組的油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于其余兩組。

2.1.2 對油脂及脂肪酸組成的影響 氮源類型不僅影響微擬球藻胞內(nèi)總油質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對其油脂及脂肪酸組成也有影響。表1結(jié)果顯示，極性油與中性油的比值均大于1，說明在氮源充足的條件下，微擬球藻主要合成結(jié)構(gòu)性極性油，而儲能性中性油合成較少。

進(jìn)一步分析各實驗組總油中的脂肪酸組成，結(jié)果見表 2。 微擬球藻主要脂肪酸為軟脂酸（C16∶0）、棕櫚油酸（C16∶1）和 EPA（C20∶5n-3），氯化銨、乙酸銨、硝酸鈉組總油中EPA相對含量分別為25.2%、23.1%、26.6%，硝酸鈉組EPA相對含量最高。不同脂肪酸在不同脂質(zhì)中分布存在顯著差異。Schneider等[15]研究發(fā)現(xiàn)，微擬球藻極性油中的單半乳糖基二酰甘油MGDG高含EPA（可達(dá)53.2%），且MGDG在極性油中的占比（可達(dá)28%）均高于其他極性油脂組分[16]，這可能與MGDG在維持葉綠體膜完整性中起的作用有關(guān)[17]； 微擬球藻中性油中的三酰甘油TAG幾乎不含EPA，而高含短鏈飽和脂肪酸。因此，EPA富集于極性油中，短鏈飽和脂肪酸富集于中性油內(nèi)。硝酸鈉組極性油與中性油比值最大，EPA相對含量最高； 乙酸銨組比值最小，EPA相對含量最低，C16∶0相對含量最高。

表1 氮源類型對胞內(nèi)總油質(zhì)量分?jǐn)?shù)及油脂極性的影響Table 1 Effects of nitrogen sources on cellular lipid content and polarity of N.oculata

表2 氮源類型對眼點微擬球藻脂肪酸組成的影響Table 2 Effects of nitrogen sources on fatty acid profile of N.oculata

2.2 氮源類型對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

培養(yǎng)環(huán)境及營養(yǎng)類型會對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生相應(yīng)影響，這是細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境及調(diào)整胞內(nèi)代謝后產(chǎn)生的變化。圖2展示了不同氮源類型下的微擬球藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，2（a）-（c）分別為氯化銨、乙酸銨、硝酸鈉組藻細(xì)胞透射電鏡圖。

表3結(jié)果顯示，采用氯化銨、乙酸銨培養(yǎng)的眼點微擬球藻細(xì)胞尺寸明顯大于硝酸鈉組。Herman Campos等[18]研究了4種氮源（硝酸鈉、尿素、氨水、氯化銨）對鹽生微擬球藻細(xì)胞尺寸的影響。結(jié)果顯示，采用尿素培養(yǎng)時細(xì)胞尺寸最小為2.9 μm，氨水及氯化銨組尺寸大于硝酸鈉組。微擬球藻細(xì)胞尺寸越小，比表面積越大，營養(yǎng)及光能吸收效率越高。

圖2 不同氮源類型眼點微擬球藻超微結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Ultrastructure of N.oculata grown under different kind of nitrogen sources

表3 不同氮源類型眼點微擬球藻細(xì)胞形態(tài)分析Table 3 Morphometric summary of cellular components of N.oculata grown under different kind of nitrogen sources

葉綠體是進(jìn)行光合作用的專門細(xì)胞器，葉綠體大小、個數(shù)、類囊體密度對光合效率存在影響。不僅光強及氮源濃度會影響微擬球藻葉綠體數(shù)量及超微結(jié)構(gòu)[1，14]，本研究結(jié)果顯示氮源類型也會產(chǎn)生影響。表3結(jié)果顯示，硝酸鈉組的葉綠體數(shù)量、相對體積、類囊體密度均高于氯化銨、乙酸銨組，因此硝酸鈉組光合效率更高。硝酸鈉組葉綠體量及質(zhì)方面的改變是微擬球藻適應(yīng)硝態(tài)氮代謝后產(chǎn)生的。

油體是微藻細(xì)胞內(nèi)主要用于儲存能量的細(xì)胞器，微擬球藻在缺氮脅迫情況下可積累大量三酰甘油并存儲于油體中，油體幾乎充滿整個細(xì)胞[14]。本研究顯示在氮源充足情況下，乙酸銨組也存在少量油體，相對體積約占細(xì)胞體積的10%，其余兩組均無明顯的油體存在，造成差異的原因可能是眼點微擬球藻利用乙酸鹽合成的過量的脂肪酸被儲存于油體中。

2.3 氮源類型對生物量及生產(chǎn)強度的影響

氮源類型在微觀上影響了眼點微擬球藻的生理生化，宏觀上則表現(xiàn)為其生物量和生產(chǎn)強度差異。圖3顯示氯化銨、乙酸銨、硝酸鈉組的最終生物量分別為 817、873、775 mg/L； 生產(chǎn)強度分別為23.4、25.3、22.0 mg/（L·d）。 因此，采用乙酸銨生產(chǎn)微擬球藻生物質(zhì)最佳，其生產(chǎn)強度分別比氯化銨、硝酸鈉組提高了6.9%和12.6%。陸向紅等[3]研究了尿素、氯化銨、乙酸銨對眼點微擬球藻生長的影響，發(fā)現(xiàn)乙酸銨為氮源時，眼點微擬球藻生物量最大。

3 結(jié) 語

氮源類型對眼點微擬球藻的生理生化及生產(chǎn)均會造成影響。采用銨鹽培養(yǎng)的眼點微擬球藻胞內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、細(xì)胞尺寸明顯大于硝酸鈉組，生物量及生產(chǎn)強度也高于硝酸鈉組。乙酸銨組生物量及生產(chǎn)強度最大，分別為 873 mg/L 和 25.3 mg/（L·d）。采用硝酸鈉培養(yǎng)眼點的微擬球藻葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)、葉綠體數(shù)量、相對體積、類囊體密度均高于銨鹽組，EPA相對含量最高，為26.6%；總碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為16.5%。乙酸銨培養(yǎng)的微擬球藻存在油體，總油質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為13.5%。