格絨澤仁，皇甫潔，韓興林，江偉，王德良，劉書亮

1 (四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014) 2 (中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)3(科技部國家酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心，北京，100015)

飲酒不適感通常指人在飲酒后，呈現(xiàn)醉酒狀，出現(xiàn)頭暈、頭痛[1]。造成飲后不適感的原因相當(dāng)復(fù)雜，除了飲酒人的身體狀況、飲用量、飲酒習(xí)慣、思維情緒及環(huán)境因素等以外[2]，還有酒體本身設(shè)計和質(zhì)量的因素。目前研究結(jié)果表明，造成白酒飲后產(chǎn)生不適感原因，一是由于乙醇自身的麻醉作用和其所代謝產(chǎn)生的乙醛引起的腦缺氧[3]，二是由于酒體自身的復(fù)雜成分在人體內(nèi)的作用以及代謝，這些物質(zhì)包括高級醇，生物胺等物質(zhì)[4-5]。其中高級醇是3個C以上一元醇類物質(zhì)的總稱[6]，在白酒中常見的有異戊醇、正丙醇、異丁醇、正己醇等[7]。高級醇是濃香型白酒中的重要成分和呈味物質(zhì)。適量的高級醇能夠使酒體醇甜，還能與酸酯化生成酯類物質(zhì)，使酒體豐滿[8]。但由于高級醇化學(xué)結(jié)構(gòu)較乙醇更為復(fù)雜，代謝也更加緩慢，過量累積會導(dǎo)致肝損傷[9-10]，同時其對人體神經(jīng)系統(tǒng)所產(chǎn)生的毒害和麻醉作用比乙醇更強，其能使神經(jīng)系統(tǒng)充血，對腦神經(jīng)細(xì)胞的損害作用，使人產(chǎn)生頭疼、頭暈的感覺，引起大醉現(xiàn)象[11-14]。

曠場實驗(open field test, OFT)作為一個經(jīng)典的動物行為學(xué)實驗，可以檢測小鼠的自發(fā)活動行為(locomotor activity)和探索行為(exploratory behavior)[15]。由于小鼠有畏懼空曠場地的天性，其活動具有趨避性(thigmotaxis)，而另一方面，又會對新環(huán)境產(chǎn)生好奇心進(jìn)而進(jìn)行探索[16]。常用的曠場系統(tǒng)是一個方形的箱子(亦有圓形)，小鼠在曠場中可以自由活動，箱子頂部有攝像機以記錄小鼠活動[17]。曠場實驗可通過1次實驗對小鼠的自發(fā)活動、探索行為及焦慮/抑郁狀態(tài)進(jìn)行定量評價[18]。現(xiàn)階段，曠場實驗常應(yīng)用于藥物副作用的檢測，如藥物對行動、睡眠的影響等[19]，是一個簡單實用的動物實驗手段。

因此，本研究通過小鼠的濃香型白酒灌胃模型，利用曠場實驗飲后行為分析結(jié)合白酒常規(guī)風(fēng)味物質(zhì)分析，建立對濃香型白酒中引起飲后不適感的關(guān)鍵高級醇的判定方法，確定在濃香型白酒中引起飲后不適的主要高級醇類物質(zhì)。以進(jìn)一步提高酒類品質(zhì)，降低飲后不適感奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗酒樣和動物

酒樣：酒樣A、B、C、D、E、F分別為市售的6款不同品牌濃香型白酒，均為52%vol。

實驗動物：C57小鼠，雄性，清潔Ⅱ級，4～6周齡，由北京維通利華公司實驗動物有限公司提供。隨機選取小鼠80只，平均體重為(23±2) g，于室溫(23±2) ℃，光照(150 xl)12 h和黑暗12 h環(huán)境，自由飲水進(jìn)食飼喂，1周后進(jìn)行實驗。實驗前提前1 d將小鼠置于曠場實驗室以適應(yīng)環(huán)境；實驗時，將小鼠隨機分為實驗組(酒樣A、B、C、D、E、F組)、對照組1(Control 1，52%vol食用酒精)和對照組2(Control 2，生理鹽水)，每組10只。

1.2 儀器與設(shè)備

Clarus 590/690氣相色譜火焰離子化檢測器(gas chromatography-flame ionization detection,GC-FID)，美國PerkinElmer公司。

曠場實驗動物行為學(xué)跟蹤系統(tǒng)ANY-Maze系統(tǒng)(v.4.72)，美國Stoelting公司。該儀器主要由一個半徑為20cm的白底箱壁透明半封閉有機玻璃圓筒組成，其頂部中央懸掛有攝像機，并與記錄系統(tǒng)相連，以此來跟蹤小鼠在曠場中的行為，其數(shù)據(jù)由ANY-Maze軟件進(jìn)行記錄并分析。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠灌胃

按照實驗分組對實驗動物分別進(jìn)行灌胃，實驗各組和對照組1灌胃劑量均為15 mL/kg，對照組2采用等量生理鹽水進(jìn)行灌胃。

1.3.2 曠場實驗

在灌胃完成后，計錄時間。在30 min后，依次按照分組將每只小鼠放置于曠場底面中央。利用高頻攝像機及軟件跟蹤記錄動物在曠場內(nèi)自由運動60 s內(nèi)的行為變化。采集的數(shù)據(jù)包括活動總路程、移動平均速度、停滯時間及停滯次數(shù)[20]。實驗過程中保持安靜，動作輕柔；每只動物實驗結(jié)束后及時清除糞便，使用72%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液清潔底面并擦干，減少之前動物的氣味，防止行為干擾。

1.3.3 醇類物質(zhì)測定

色譜條件：自動進(jìn)樣器；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；載氣：N2；流速：1 mL/min；FID檢測器溫度：FID(280 ℃)；H2：45 mL/min；空氣：450 mL/min；色譜柱：CP-Wax57CB (50 m×0.25 mm×0.20 μm)。升溫程序，起始溫度：35 ℃，保持4.00 min；以4.0 ℃/min升溫到60 ℃，再以10.0 ℃/min升溫到130 ℃，再以15.0 ℃/min升溫到205 ℃，保持15.00 min。采用30∶1分流比進(jìn)樣。采用內(nèi)標(biāo)法。內(nèi)標(biāo)濃度為：叔戊醇1%，乙酸正丁酯1%，2-乙基丁酸1%(體積分?jǐn)?shù))。

1.4 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本實驗結(jié)果采用SPSS Statistics 24軟件，使用單因素ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計，并使用Tableau作圖，數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；同時，利用SPSS Statistics 24.0軟件，使用其中的降維功能，分別使用數(shù)值變量對應(yīng)分析方法和因子分析方法對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 曠場實驗結(jié)果

本研究前期研究成果表明，灌胃30 min～1 h小鼠血液乙醇積累程度達(dá)到最高，對行為影響最大。所以本實驗對灌胃后30 min小鼠行為數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果(表1，圖1)發(fā)現(xiàn)，對照組1小鼠在曠場中的活動總路程為(6.607±0.723) m，平均速度為(0.110±0.030) m/s，相較于對照組2的(7.479±0.085) m和(0.125±0.001) m/s略有所下降，但在統(tǒng)計學(xué)上均無顯著性差異(P>0.05)；而兩者在曠場中的停滯時間分別為(1.850±0.238) s和(1.660±0.245) s，食用酒精組時間略長于生理鹽水組，但差異不顯著(P>0.05)；在停滯頻數(shù)上，食用酒精組和生理鹽水組并無顯著差異(P>0.05)。本研究旨在判定濃香型白酒中可能引起飲后不適的關(guān)鍵高級醇類物質(zhì)，需消除乙醇的干擾，所以在其后的實驗中選擇食用酒精組與實驗組進(jìn)行比較。

表1 各組小鼠曠場中運動的行為學(xué)指標(biāo)Table 1 Behaviors of different groups’ mice in open field

而在各實驗組與食用酒精組的比較中發(fā)現(xiàn)，酒樣B、D、E、F組灌胃30 min后的小鼠，在曠場運動1 min內(nèi)，活動總路程和平均速度均顯著增加(P<0.05)；灌胃A、E兩組酒樣的小鼠停滯時間和停滯次數(shù)均顯著低于食用酒精組(P<0.05)，而C組小鼠的停滯時間則顯著高于食用酒精組(P<0.01)，B、D、F組的停滯次數(shù)相較于食用酒精組明顯增加(P<0.05)。將A、B、C、D、E、F各行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行對應(yīng)分析，對應(yīng)分析圖結(jié)果見圖2，酒樣E灌胃后的小鼠活動總路程較長，同時停滯時間和停滯次數(shù)減少；酒樣F灌胃后的小鼠停滯次數(shù)更多，酒樣C灌胃后小鼠停滯時間變長；酒樣D灌胃后小鼠平均速度更快，同時小鼠的停滯次數(shù)也會相應(yīng)增加。

A-活動總路程；B-平均速度；C-停滯時間；D-停滯次數(shù)圖1 各組小鼠灌胃30 min后在曠場中運動1 min的行為學(xué)指標(biāo)Fig.1 Behavioral indices of mice in different group who who exercised in open field for 1 minute after 30 minutes of gavage注：*代表差異顯著，P<0.05。

結(jié)合圖1和圖2分析可知，在酒樣E的作用下，小鼠的運動能力提高，呈現(xiàn)出酒后興奮，同時其受抑制出現(xiàn)間斷性麻木的情況最輕，說明該酒樣所引起的小鼠興奮并非異常興奮；小鼠在酒樣A的作用下，受抑制出現(xiàn)間斷性麻木的情況較輕，但其運動能力提高并不明顯，說明其興奮受到抑制，呈現(xiàn)醉酒狀；酒樣F作用下的小鼠受抑制出現(xiàn)間斷性麻木的次數(shù)增加，酒樣C則造成小鼠間斷性麻木的時間最長，同時兩組小鼠運動能力都有所提高，說明在這兩種酒樣的作用下，小鼠的運動能力應(yīng)屬于在異常狀態(tài)下產(chǎn)生的興奮，即飲后不適感所引起的刺激；同理，酒樣D雖然引起小鼠運動能力提高在所有酒樣中程度最高，但其對小鼠所造成的間斷性麻木時間和次數(shù)也處在較高水平，由此可認(rèn)為酒樣D造成飲后不適所引起的興奮程度最強。

圖2 酒樣-行為指標(biāo)對應(yīng)分析圖Fig.2 The correspondent analysis chart between Baijiu samples and mice’s behaviors

綜上所述，可以發(fā)現(xiàn)，酒樣D為引起小鼠飲后不適感最強的酒樣，而酒樣E為引起小鼠飲后不適感程度最弱的酒樣。

2.2 六款濃香型白酒醇類物質(zhì)成分的定量檢測結(jié)果

將A、B、C、D、E、F六款白酒按照給定條件進(jìn)行GC-FID檢測，檢測共計13種醇類物質(zhì)，其中包含12種高級醇，分別為仲丁醇、正丙醇、異丁醇、2-戊醇、正丁醇、活性戊醇、異戊醇、正戊醇、正己醇，1，2-丙二醇、糠醇以及2-苯乙醇，各酒樣醇類物質(zhì)含量測定結(jié)果見表2。

表2 六款酒樣醇類物質(zhì)含量 單位：mg/L

2.3 PCA主成分分析結(jié)果

通過PCA將所檢測出的除乙醇外的其他醇類物質(zhì)(共計13種)作為指標(biāo)進(jìn)行分析，共計得到13個主成分，其中主要的主成分各自的特征值、貢獻(xiàn)率(方差百分比)及累積貢獻(xiàn)率(累積)見表3，因子負(fù)荷矩陣見表4。

表3 主成分提取總方差解釋Table 3 Total variance explained by PCA

表4 因子負(fù)荷矩陣分析Table 4 Component matrixan alysis

由表3可知，前3個主成分特征根大于1，且累計貢獻(xiàn)率達(dá)到92%，故選擇前3個因子。從表4中可以得知，異戊醇、異丁醇和2-戊醇在主成分1(FAC 1)上有較大載荷；正戊醇，正己醇及正丁醇在主成分2(FAC 2)上有較大載荷；仲丁醇、正丙醇則在主成分3(FAC 3)中擁有較大載荷。將上述PCA所得結(jié)果進(jìn)行投影后，3個因素間可得PCA投影圖,如圖3所示。

圖3 醇類物質(zhì)PCA投影圖Fig.3 Projection plot of principal component analysis for alcohols

由圖3可以發(fā)現(xiàn)，各酒樣中3個主成分的權(quán)重各不相同，較為直觀地表明不同酒樣中不同主成分所代表的物質(zhì)貢獻(xiàn)不同。由圖3可知，酒樣A中FAC 3所占權(quán)重最大，說明FAC 3所代表的正丙醇和仲丁醇在其所含醇類物質(zhì)中起到主要作用；酒樣B中則為FAC 1所代表的異戊醇、異丁醇和2-戊醇在其所含醇類物質(zhì)中起到主要作用；酒樣C受3個主成分影響，但其中以FAC 2所代表的正戊醇，正己醇及正丁醇起主要作用；酒樣D中，F(xiàn)AC 1所代表的異戊醇、異丁醇和2-戊醇起到了主要作用，其程度較之于酒樣B更為突出；酒樣E中則3個主成分均不起主要作用；酒樣F中是以FAC 2所代表的正戊醇，正己醇及正丁醇起主要作用。

3 結(jié)論

曠場實驗作為評價嚙齒類動物運動功能和焦慮行為的經(jīng)典方法，被廣泛運用于藥理學(xué)的基礎(chǔ)研究中[21]。動物對新奇環(huán)境的探究習(xí)性和對空曠場地恐懼的矛盾沖突是曠場實驗的主要原理，動物水平運動情況代表其運動活性[22]。本研究基于小鼠行為學(xué)實驗和酒樣常規(guī)風(fēng)味物質(zhì)測定，通過將兩者結(jié)合分析對能引起濃香型白酒飲后不適的關(guān)鍵物質(zhì)進(jìn)行初步判定。行為學(xué)實驗結(jié)果表明，酒樣D能引起小鼠較為強烈的飲后不適感，而酒樣E為引起小鼠飲后不適感程度最弱的酒樣；從酒樣中風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果來看，酒樣D中起主要作用的高級醇是異戊醇、異丁醇和2-戊醇，且觀察異戊醇含量發(fā)現(xiàn)，酒樣D在所有酒樣中為最高，而引起小鼠飲后不適感程度最弱的酒樣E中異戊醇含量在所有酒樣中最低。將上述行為實驗結(jié)果與物質(zhì)含量測定結(jié)果相對應(yīng)，可初步判定異戊醇為引起濃香型白酒飲后不適的關(guān)鍵高級醇之一，推測其含量愈高的濃香型白酒，飲后不適感愈強。

同時，通過實驗發(fā)現(xiàn)，酒樣A作用的小鼠雖受抑制出現(xiàn)間斷性麻木的情況較輕，但其運動能力提高并不明顯，說明其興奮受到抑制，呈現(xiàn)出醉酒狀；而在酒樣風(fēng)味物質(zhì)的分析中，發(fā)現(xiàn)酒樣A起主要作用的高級醇為正丙醇和仲丁醇，正丙醇含量為所有酒樣中最高的，所以將其行為實驗結(jié)果與物質(zhì)含量測定結(jié)果相對應(yīng)，懷疑濃香型白酒中正丙醇含量越高，其越易造成飲后易醉的現(xiàn)象。但濃香型白酒作為一個復(fù)雜的體系，要進(jìn)一步確定異戊醇和正丙醇是否是引起濃香型白酒飲后不適的關(guān)鍵高級醇，以及本研究所使用方法可否應(yīng)用于其他香型白酒，還需更加深入的研究。本文旨在以進(jìn)一步提高酒類品質(zhì)，為降低飲后不適感奠定基礎(chǔ)。