蘭阿峰 郭素芬 彭浩

摘要：純培養(yǎng)分離大鯢腸道細菌，選用細菌通用引物進行16S rRNA擴增，測序后提交序列并分析;免培養(yǎng)方法采用試劑盒提取腸道內(nèi)容物總DNA，選用細菌通用引物對總DNA進行16S rRNA擴增，構(gòu)建克隆文庫，對陽性克隆進行PCR-RFLP分析，用Hae Ⅲ內(nèi)切酶進行片段插入性驗證并進行測序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。純培養(yǎng)獲得103個菌株，分屬于16個不同的可操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），系統(tǒng)發(fā)育分析表明這些克隆序列分別屬于變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）。其中，變形菌門（占克隆總數(shù) 87.63%）為最優(yōu)勢類群。免培養(yǎng)結(jié)果將隨機挑取的105個陽性克隆歸為15個OTUs，系統(tǒng)發(fā)育分析表明這些克隆序列分別屬于變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）4個門。其中，變形菌門（占克隆總數(shù)的71.43%）為最優(yōu)勢類群。養(yǎng)殖大鯢腸道細菌多樣性豐富，具有進一步開發(fā)研究的價值。

關(guān)鍵詞：養(yǎng)殖大鯢;腸道細菌;純培養(yǎng);免培養(yǎng);多樣性

中圖分類號： S966.6 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0146-06

中國大鯢（Andrias davidianus）別稱“娃娃魚”，屬于兩棲綱有尾目隱腮鯢科，是現(xiàn)存?zhèn)€體最大的兩棲動物，1998年被列為國家二級保護動物[1]。我國大鯢主要分布在陜西、江西、湖北、四川等17個?。▍^(qū)）深山峽谷的溪流當中[1-3]。中國大鯢是肉食性捕食動物，野生大鯢捕食的動物有螃蟹、昆蟲、青蛙、魚等[4-5]。由于大鯢具有極高的經(jīng)濟價值和藥用價值，其人工養(yǎng)殖逐漸得到了重視，目前在陜西漢中、四川巴中等地區(qū)出現(xiàn)了較大規(guī)模的養(yǎng)殖。

動物腸道寄生著大量的微生物，這些微生物同時也是動物體的組成部分，腸道微生物與寄主消化吸收及健康狀況密切相關(guān)[6-8]。腸道是一個相對密閉的系統(tǒng)，其內(nèi)部生長的微生物以厭氧或兼性厭氧的微生物為主，采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法分離依然是腸道微生物研究的主要方法之一，有報道稱傳統(tǒng)方法分離到的微生物物種只有微生物總量的1%～5%，而其余95%～99%的微生物種群還未被分離和識別[9]。免培養(yǎng)方法是一種基于分子生物學的方法，與傳統(tǒng)的分離鑒定方法完全不同，可以彌補傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的缺點[10]。該方法利用分子生物學技術(shù)判斷微生物的種類及各個物種之間的親緣關(guān)系，其缺點是無法獲取微生物[11-12]。人工養(yǎng)殖由于其養(yǎng)殖密度高致使大鯢容易出現(xiàn)傳染性病害，部分傳染病與腸道微生物密切相關(guān)，因此研究養(yǎng)殖大鯢腸道微生物多樣性對人工飼養(yǎng)大鯢保護工作具有理論價值。本研究利用純培養(yǎng)及免培養(yǎng)2種方法對養(yǎng)殖大鯢的腸道微生物多樣性進行研究，以期為大鯢保護工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 養(yǎng)殖大鯢采自陜西理工大學大鯢研究所大鯢養(yǎng)殖室，樣本共10條，平均體質(zhì)量6.76 kg，解剖后取完整消化道放入4 ℃的冰箱中保存，2周內(nèi)處理完。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺（江蘇蘇州凈化設(shè)備有限公司），高壓滅菌器（美國Stik公司），凝膠掃描成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），PCR擴增儀（英國Techen公司），高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），移液器（Eppendorf公司），恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），超低溫冰箱（日本Panasonic公司），核酸測定儀（Eppendorf公司），超純水凈化系統(tǒng)（上海優(yōu)普實業(yè)有限公司）。

1.1.3 主要試劑 Fast DNA Spin Kit For Feces（美國Mo Bio公司），2×Taq PCR Kit（Takara公司），2×HieffTM PCR Master Mix（Takara公司），高效感受態(tài)DH5α（Escherichia coli competent cells，DH5α）（上海Sangon公司），pMDTM19-T Vocter Cloning Kit（Takara公司），Spin柱式DNA回收試劑盒（Biofulx公司），PCR引物（上海Sangon公司），Hae Ⅲ（Takara公司），Ampicillin（上海Sangon公司），Trytone（Oxoid公司），Yeast Extract（Oxoid公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 大鯢腸道細菌純培養(yǎng) 純培養(yǎng)腸道細菌分離，按照文獻[13]報道方法進行。將大鯢腸道內(nèi)容物稀釋涂布于牛肉膏蛋白胨平板，37 ℃培養(yǎng)，挑取單菌落進行純化并保藏菌種于4 ℃冰箱中。

1.2.2 對大鯢腸道純培養(yǎng)細菌進行分子鑒定 純培養(yǎng)腸道細菌DNA擴增，參照文獻[14]報道方法進行。進行菌液16S rRNA擴增，選用引物799F：5′-AACAGGATTAGATACCCT G-3′/1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行擴增，長度750 bp左右。反應(yīng)體系（50 μL）：2×Taq Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min;55 ℃ 0.5 min;72 ℃ 1 min，33 個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用的瓊脂糖電泳檢測后送上海生工生物工程股份有限公司測序，結(jié)果整理后提交NCBI申請大鯢腸道細菌菌株16S rRNA基因序列登錄號。

1.2.3 大鯢腸道內(nèi)容物中微生物總DNA提取及16S rRNA擴增 解剖大鯢后將其腸道內(nèi)容物收集到滅菌的1.5 mL EP管中。總DNA的提取使用美國Mo Bio公司生產(chǎn)的糞便基因組提取試劑盒。按照試劑盒說明提取DNA后將其干燥，加入20 μL TE緩沖液溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩？侱NA特異性擴增，參照純培養(yǎng)腸道細菌擴增方法進行。

1.2.4 克隆文庫的構(gòu)建及陽性克隆的篩選 用Sanprep柱式DNA膠回收試劑盒將擴增后750 bp左右的目的條帶切膠純化回收。純化產(chǎn)物與pMDTM19-T Vocter連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。陽性克隆子的初步篩選參照文獻[15]，將轉(zhuǎn)化后的細胞涂布含氨芐青霉素（100 mg/L）、X-gal、IPTG的LB瓊脂平板37 ℃避光培養(yǎng) 14～16 h進行藍白斑篩選。對陽性PCR產(chǎn)物選用限制性核酸內(nèi)切酶Hae Ⅲ對目標插入片段多態(tài)性分析（PCR-RFLP）后進行測序。將Hae Ⅲ酶切帶譜分析不同，且測序結(jié)果也不同的克隆歸為1個OTU?？寺∥膸旄采w率統(tǒng)計分析應(yīng)用公式：C=[1-（n/N）]×100%[16]，這里n代表在16S rRNA基因克隆文庫僅出現(xiàn)1次的OTU的數(shù)量，N代表16S rRNA基因克隆文庫的總數(shù)。

1.2.5 免培養(yǎng)獲取細菌及克隆文庫發(fā)育分析 免培養(yǎng)獲取的測序結(jié)果及克隆文庫獲取的細菌測序結(jié)果用Vector Screen去除載體序列后提交到EzTaxon-eserver（http：//eztaxon-e.ezbiocloud.net）進行BLAST檢索，下載同源性較高的模式菌株的數(shù)據(jù)，生成Fasta格式文件。用ClustalX軟件對所得序列進行人工校正及比對分析。利用Mega 5.02，按照Neighbor-Joining法聚類，選擇1 000個重復(fù)做Bootstrap值分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。所得的16S rRNA基因序列已提交GenBank數(shù)據(jù)庫，申請16S rRNA基因序列登錄號。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢腸道細菌純培養(yǎng)

2.1.1 大鯢腸道細菌純培養(yǎng)分離 經(jīng)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，獲取103株純細菌。對獲取細菌菌株進行保藏，待分析鑒定。

2.1.2 大鯢腸道純培養(yǎng)細菌分子生物學的鑒定 應(yīng)用細菌16S rRNA通用引物799F和1492R對分離得到的細菌進行菌液PCR，得到約750 bp清晰的片段（圖1）?？梢奝CR產(chǎn)物條帶清晰，產(chǎn)物量大，可用于測序反應(yīng)。將750 bp的清晰條帶所對應(yīng)的的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測序，成功測通103個序列。序列整理后提交GenBank數(shù)據(jù)庫中NCBI并獲得養(yǎng)殖大鯢純培養(yǎng)腸道細菌保守區(qū)基因登錄號。獲取登陸號為KU872287-KU872389。

2.2 大鯢腸道免純培養(yǎng)及鑒定

2.2.1 腸道內(nèi)容物總DNA提取及16S rRNA擴增 參照糞便總DNA提取試劑盒的步驟，提取野生大鯢腸道內(nèi)容物總DNA。0.9%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。提取大鯢腸道微生物的總DNA較完整，條帶較為清晰，可用于下游試驗。應(yīng)用細菌16S rRNA基因通用引物進行特異性擴增，得到約 750 bp 的目標片段見圖3。另外還可看到位于100～200 bp之間較清楚的條帶，推測可能為PCR擴增時，退火溫度不合適導致大量引物二聚體產(chǎn)生的基因片段。切膠純化回收位于750 bp的目標條帶可避免其影響。

2.2.2 克隆文庫的構(gòu)建及陽性克隆的篩選 將上述750 bp處PCR產(chǎn)物切膠回收后鏈接pMD-19T載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞內(nèi)。構(gòu)建基因克隆文庫后獲取191個陽性克隆，以質(zhì)粒通用引物進行菌落PCR擴增，擴增產(chǎn)物用Hae Ⅲ進行插入目的片段的RFLP分析，初步獲取酶切帶譜不同的克隆后選擇105個樣品送上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結(jié)果去除嵌合序列，并排除重復(fù)序列后共得到15個OTUs（代表100個有效序列）。根據(jù)公式，計算得克隆文庫的覆蓋率C為 85.00%，可以代表大鯢腸道內(nèi)生細菌的多樣性。

2.3 細菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3.1 大鯢腸道純培養(yǎng)細菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析 純培養(yǎng)獲得103個菌株，成功測通9個序列。整理后提交NCBI數(shù)據(jù)庫，去除嵌合體后得到93條有效序列，登錄號為KU872251-KU872389，進行BLAST檢索對比，所得到細菌16S rRNA序列如下：變形菌門（Proteobacteria）85株，占總細菌分離數(shù)87.63%，其中愛德華氏菌屬（Edwardsiella sp.）27株，占總數(shù)的27.81%，志賀氏菌屬（Shigella sp.）11株占總數(shù)的11.34%，沙雷氏菌屬（Serratia sp.）5株，占總數(shù)的 5.15%，其中埃希氏菌屬（Escherichia sp.）8株，占總數(shù)的8.25%，沙門氏菌屬（Salmonella sp.）2株，占總數(shù)的2.06%，肥桿菌屬（Obesumbacterium sp.）1株，占總數(shù)的1.03%，鄰單胞菌屬（Plesiomonas sp.）2株，占總數(shù)的2.06%，耶爾辛氏菌屬（Yersinia sp.）1株，占總數(shù)的1.03%，腸桿菌屬（Enterobacter sp.）1株，占總數(shù)的1.03%，孤菌屬（Vibrio sp.）4株，占總數(shù)的4.12%，克呂沃氏菌屬（Kluyvera sp.）1株，占總數(shù)的1.03%，克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.）3株，占總數(shù)的3.09%，氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）17株，占總數(shù)的17.53%，假單胞菌（Pseudomona sp.）2株，占總數(shù)的2.06%;厚壁菌門（Firmicutes）占總分離數(shù)5.15%，芽孢桿菌屬（Bacilli sp.）5株，占總數(shù)的 5.15%;放線菌門（Actinobacteria）7株，占總數(shù)的7.22%，其中短桿菌屬（Brevibacterium sp.）7株，占總數(shù)的7.22%。

依據(jù)16S rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），變形菌門（Proteobacteria）作為優(yōu)勢種群，其序列集中在1個大的分支上，而這一分支又分為多個小分支。志賀氏菌屬（Shigella sp.）、埃希氏菌屬（Escherichia sp.）、沙門氏菌屬（Salmonella sp.）在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一族。沙雷氏菌屬（Serratia sp.）及腸桿菌屬（Enterobacter sp.）相似性較高，在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一族。愛德華氏菌屬（Edwardsiella sp.）與肥桿菌屬（Obesumbacterium sp.）相似性較高，在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一族。孤菌屬（Vibrio sp.）與氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）中的大部分相似性較高，聚為一族。厚壁菌門（Firmicutes）中的短桿菌屬（Brevibacterium sp.）占據(jù)了進化樹的一個獨立分支。放線菌門（Actinobacteria）中的短桿菌屬（Brevibacterium sp.）占據(jù)了進化樹的一個獨立分支。

2.3.2 大鯢腸道免培養(yǎng)細菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析 將測序的105條有效序列，整理后提交GenBank數(shù)據(jù)庫中，取除嵌合體序列獲得100個養(yǎng)殖大鯢免培養(yǎng)腸道細菌登錄號：KU872390-KU872489。由表2可知，進行BLAST檢索后，陽性克隆單元序列（operational taxonomic units，OTU）如下：變形菌門（Proteobacteria）75株，占總克隆數(shù)的71.43%，其中埃希氏菌屬（Escherichia sp.）29單元，占總數(shù)的27.62%，志賀氏菌屬（Shigella sp.）30單元，占總數(shù)的28.57%，沙雷氏菌屬（Serratia）3單元，占總數(shù)的2.86%，耶爾辛氏菌屬（Yersinia sp.）2單元，占總數(shù)的1.90%，食堿菌屬（Alcanivorax sp.）7單元，占總數(shù)的6.67%，沙門氏菌屬（Salmonella sp.）1單元，占總數(shù)的0.10%，哈夫尼菌屬（Hafnia sp.）1單元，占總數(shù)的 0.10%，希萬氏菌屬（Shewanella sp.）1單元，占總數(shù)的 0.10%，布丘氏菌屬（Buttiauxella sp.）1單元，占總數(shù)的 0.10%;放線菌門（Actinobacteria）21株，占總克隆數(shù)的 20.01%，其中短桿菌屬（Brevibacterium sp.）19單元，占總數(shù)的18.10%，戈登氏桿菌屬（Gordonibacter sp.）1單元，占總數(shù)的0.10%，紅蝽桿菌屬（Coriobacterium sp.）1單元，占總數(shù)的 0.10%;厚壁菌門（Firmicutes）8株，占總克隆數(shù)的7.62%，其中芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）7單元，占總數(shù)的6.67%，葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.）1單元，占總數(shù)的0.10%;擬桿菌門（Bacteroidetes）占總克隆數(shù)的0.95%，其中理研菌屬（Rikenella sp.）1單元，占總數(shù)的0.10%。

依據(jù)16S rRNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），可見進化樹明顯分為4個大的分支，第1個分支中主要包含了變形菌門（Proteobacteria）大部分種屬;第2個分支主要包含了放線菌門（Actinobacteria）的大部分種屬;第3個分支只有1個屬，是擬桿菌門（Bacteroidetes）的理研菌屬（Rikenella sp.）;第4個分支主要包含了厚壁菌門（Firmicutes）的大部分種屬。

3 討論與結(jié)論

本研究采用純培養(yǎng)及免培養(yǎng)方法對養(yǎng)殖大鯢腸道細菌多樣性進行研究，傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法獲取103株細菌，分子生物學方法鑒定為3門16個分類單元。免培養(yǎng)方法獲取105條序列，經(jīng)NCBI上BLAST比對后，鑒定為4門15個分類單元。

筆者所在實驗室前期應(yīng)用免培養(yǎng)技術(shù)對野生大鯢腸道細菌多樣性進行研究，野生大鯢腸道細菌免培養(yǎng)獲得分4個門：變形菌門（Proteobacteria）占總克隆數(shù)的92.08%，梭菌門（Clostridia）、衣原體門（Chlamydiae）、芽孢菌門各占總克隆數(shù)的1.98%， 其中變形菌門為最優(yōu)勢類群，另外還存在1.98%

細菌未確定到屬[15-16]。本研究中養(yǎng)殖大鯢腸道純培養(yǎng)細菌共分離的103株細菌可分為3個門16個屬，在門的分類上優(yōu)勢菌為變形菌門（Proteobacteria），占87.63%，其次為厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）;免培養(yǎng)獲取105條細菌克隆序列可分為4個門15個屬，在門的分類上，優(yōu)勢菌株為變形菌門（Proteobacteria），占總克隆數(shù)的71.43%?？梢娨吧篥F與養(yǎng)殖大鯢腸道細菌在門一級分類中最優(yōu)勢類群均為變形菌門。在屬這一級分類上野生大鯢最優(yōu)勢細菌為氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）占總細菌數(shù) 66.34%;養(yǎng)殖大鯢免培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)埃希氏菌屬（Escherichia sp.）29單元占總數(shù)的27.62%，志賀氏菌屬（Shigella sp.）30單元占總數(shù)的28.57%，這2個屬數(shù)量基本相當，同為最優(yōu)勢細菌類群;純培養(yǎng)養(yǎng)殖大鯢腸道細菌最優(yōu)勢菌群為愛德華氏菌屬（Edwardsiella sp.）占總數(shù)的27.81%?？梢娫趯僖患壏诸惿弦吧c養(yǎng)殖大鯢腸道細菌最優(yōu)勢菌群差異較大，這可能與大鯢的生活環(huán)境、攝食的物種種類等有一定的關(guān)系。野生大鯢生活在環(huán)境溫度較低的山澗溪流中，以小型水生動物及昆蟲等為食，食性相對比較復(fù)雜，而本試驗所用養(yǎng)殖大鯢以小鯽魚為食，食性相對單一，環(huán)境也單一。

大鯢為雖然是兩棲類動物，但其一般都生活在水里，很少出水活動，所以大鯢生活環(huán)境與水生動物更相近。經(jīng)比較中華絨螯蟹（Brachyura）腸道細菌研究[17]，東方鲀（tetraodon fluviatilis）腸道細菌[18]，南美白對蝦（Penaeus vannamei Boone）腸道細菌[19]與本研究大鯢（Andrias davidianus）腸道細菌多樣性的差異，可知它們的腸道細菌優(yōu)勢種群都是變形菌門（Proteobacteria）;而陸生環(huán)境中的揚州鵝[20]、牛[21]、豬[22]等動物都是厚壁菌門（Firmicutes）為優(yōu)勢群落?？梢姯h(huán)境對腸道細菌多樣性的影響是明顯的。

養(yǎng)殖大鯢腸道細菌多樣性豐富，基于純培養(yǎng)技術(shù)可將養(yǎng)殖大鯢腸道細菌歸為3門16屬，免培養(yǎng)技術(shù)可將養(yǎng)殖大鯢腸道細菌歸為4門15屬。養(yǎng)殖大鯢腸道細菌多樣性研究純培養(yǎng)技術(shù)與免培養(yǎng)技術(shù)的結(jié)果表明在門的差異性較小，在屬的差異性較大。就純培養(yǎng)技術(shù)比較養(yǎng)殖與野生大鯢腸道細菌在屬的分類上差異性很大。就免培養(yǎng)技術(shù)比較養(yǎng)殖與野生大鯢腸道細菌差異性在門與屬的分類上都很大。

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