鐘靈毓 王元紅 白彩霞 楊侃侃 俞趙榮 魯智敏 張學(xué)琪 劉自敏蔣書東 李永東 王勇

摘要：為了對(duì)羊口瘡病毒（ ORFV） AH-FlO株/27基因進(jìn)行原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位，本試驗(yàn)采用PCR方法擴(kuò)增出ORFV127基因，成功構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-6p-1—ORFV127和真核重組質(zhì)粒pECFP-N1- ORFV127。將原核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸埃希氏菌中表達(dá)，并進(jìn)行純化和鑒定。以純化的蛋白質(zhì)免疫BALB/e雌鼠制備多克隆抗體，利用Western-blot技術(shù)鑒定其反應(yīng)原性。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ORFV/27轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，通過倒置熒光顯微鏡觀察其在細(xì)胞中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，獲得的ORFV127基因序列全長為558bp，ORFV127蛋白在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，主要以包涵體蛋白質(zhì)的形式表達(dá)，大小約49 000。Western-blot結(jié)果顯示，免疫小鼠獲得的抗ORFV127蛋白的多克隆抗體可特異性識(shí)別ORFV127蛋白，倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，ORFV127蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)研究ORFV127蛋白的功能提供了寶貴的生物材料。

關(guān)鍵詞：羊口瘡病毒;ORFV127基因;原核表達(dá);亞細(xì)胞定位

中圖分類號(hào)：S855.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)： 1000-4440（2019）03-0646-07

羊口瘡，即羊傳染性膿皰，是由痘病毒科、副痘病毒屬的羊口瘡病毒（ Orf virus，ORFV）引起的綿羊、山羊、人、紅鹿、松鼠和馴鹿等多種動(dòng)物的一種急性、接觸性、嗜上皮性人獸共患病，以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水皰、膿皰和結(jié)成疣狀結(jié)痂為特征，且主要引起皮膚和黏膜的增生性病變，3-6月齡的羔羊最易感染，成年羊發(fā)病較少[1-4]。ORFV導(dǎo)致的死亡率不高，但若混合其他病原感染時(shí)，死亡率會(huì)顯著升高[5]。自19世紀(jì)50年代起，中國10余個(gè)省份不斷有羊口瘡疫情的相關(guān)報(bào)道，目前該病主要流行于中國西北地區(qū)，對(duì)中國畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的危害[6-7]。

口瘡病毒基因組為線性雙鏈DNA，其全長約為138 kb?；蚪M由中央核心基因和末端基因組成[8]。中央核心基因（ORFV009 - ORFV111）相對(duì)保守，主要參與調(diào)控病毒粒子在細(xì)胞漿中的裝配成熟以及病毒的復(fù)制、包裝和釋放，兩側(cè)末端基因（OR-FVO01 - ORFV008、ORFV12 - ORFV134、主要為與病毒的毒力、宿主嗜性、免疫逃避和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的基因，這些基因具有較高的種間變異性，且大多與病毒的致病機(jī)制有關(guān)，因此末端變異區(qū)具有重要的研究價(jià)值[9-13];本試驗(yàn)研究的ORFV127基因位于基因組的3'UTR，編碼白介素-10（vIL-IO），是ORFV早期表達(dá)的基因之一[14]。

本試驗(yàn)擬以羊口瘡病毒AH-F10株基因組為模板，擴(kuò)增出ORFV127基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-ORFV127和pEGFP-NI-ORFV/27，結(jié)合Western-blot及亞細(xì)胞定位等技術(shù)，獲得了抗ORFV127蛋白的多克隆抗體及ORFV127基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況，以期為后續(xù)研究ORFV127蛋白的生物學(xué)功能以及ORFV與宿主細(xì)胞相互作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DH5a和Rosetta（ DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司，ORFV AH-F10株[15]、pGEX-6p-l載體及Vero細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，6周齡SPF級(jí)BALB/c雌鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（皖）2017-001。

1.2 主要試劑

Solution I、rTaq DNA聚合酶、pMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Bam H I均購自TaKaRa公司，質(zhì)粒小提試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自Axygen公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自Tiangen公司，谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶（ GST）標(biāo)簽鼠源單抗、羊抗小鼠IgG/HRP購自ZSGB-BIO公司，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購自Boster公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（ DMEM）、胎牛血清（FBS）購自Ther-moFisher公司，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液購自Beyotime公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 0RFV127基因的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上公布的ORFV127基因序列（ No. KP010354.1），通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物用于擴(kuò)增ORFV127基因，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為558 bp。上、下游引物序列為：ORFV127-（pGEX-6p-l）up：5’-CGGGATCCATGTCGAACAA-CAAAAITCT-3'（下劃線處為添加的Bam H I酶切位點(diǎn)），ORFV127-（ pGEX-6p-l）dw：5’-GGAAT-TCrITATGATTTAGTAGTCATGTATGAT_3’（下劃線處為添加的Eco R I酶切位點(diǎn)），ORFV127-（ pEGFP-N1） up：5’_GGAAITCTGATGTCGAACAACAAAArITCT_3’（下劃線處為添加的Eco R I酶切位點(diǎn)），ORFV127-（ pEGFP-NI） dw：5’-CGGGATCCCGTGATITAGTAGT-CATGTATGAT-3’（下劃線處為添加的Bam H I酶切位點(diǎn)）。引物由上海生物工程有限公司合成。

采用合成的引物PCR擴(kuò)增ORFV127基因，PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min：95℃變性50 s，57℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增體系：rTaq DNA聚合酶Mix 10μl，AH-FIO株基因組模板1μl，上、下游引物各1μl，補(bǔ)加滅菌ddH，O至20μl。PCR產(chǎn)物按膠回收試劑盒步驟回收純化后克隆至pMD19-T載體，并進(jìn)行PCR、雙酶切及序列測(cè)定，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 0RFV127基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將鑒定正確的質(zhì)粒經(jīng)Eco R I和Bam H I酶切后分別克隆至同樣經(jīng)雙酶切的pGEX-6p-l及pEGFP-N1載體中。菌液PCR擴(kuò)增、雙酶切鑒定陽性克隆，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別命名為pGEX-6p-l-ORFV/27和pEGFP-N1-ORFV/27.

1.5 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)及純化

將重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-l-ORFV/27轉(zhuǎn)化至Rosetta感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的溶菌肉湯（ LB）液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時(shí)，加入異丙基-p-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為l mmol/L，33 0C恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)3-6 h后離心收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳。采用常規(guī)包涵體洗滌、尿素復(fù)性及蔗糖濃縮方法[16]對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。

1.6 重組蛋白質(zhì)的Westen-blot鑒定

將純化后的重組蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，雜交膜清洗液（TBST）漂洗3次后加入1：1 000稀釋的抗GST標(biāo)簽的鼠源單抗，37℃孵育th。TBST漂洗3次后加入1：1 000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育th。TBST漂洗3次，DAB試劑盒顯色。

1.7 多克隆抗體的制備及分析

以純化的ORFV127蛋白免疫6周齡BALB/c雌鼠，免疫程序參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行。第4次免疫7d后，從小鼠眼眶采血，分離血清。對(duì)已誘導(dǎo)的重組蛋白質(zhì)及pGEX-6P-1對(duì)照菌蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，以制備的血清為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗進(jìn)行Western-blot分析。

1.8 亞細(xì)胞定位分析

常規(guī)方法復(fù)蘇Vero細(xì)胞，接種于6孔板中，加入含IO%FBS的DMEM培養(yǎng)基并將其置于37℃、5% CO，的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待其細(xì)胞密度達(dá)到70% - 80%時(shí)，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法按Lipofectamine 2000試劑盒說明書將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ORFV/27轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞。設(shè)置空載體轉(zhuǎn)染組作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后DAPI染色細(xì)胞核，在倒置熒光顯微鏡下觀察表達(dá)蛋白質(zhì)在Vero細(xì)胞中的定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增

以AH-F10株基因組為模板，經(jīng)PCR成功擴(kuò)增出ORFV127基因，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳鑒定，顯示出l條大小約為558 bp的特異性片段，與預(yù)期相符（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

將重組質(zhì)粒pGEX-6p-l-ORFV/27和pEGFP-N1-ORFV127，分別經(jīng)Bam H I和Eco R I雙酶切得到2個(gè)片段，均與預(yù)期相符（圖2、圖3）。測(cè)序結(jié)果顯示，目的基因已成功克隆至pGEX-6p-l和pEG-FP-N1載體中且未發(fā)生堿基缺失或突變。

2.3 序列分析

采用DNAstar軟件將AH-FIO株ORFV127基因編碼的氨基酸序列與GenBank公布的10株ORFV127基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。對(duì)比結(jié)果（圖4）顯示，本試驗(yàn)毒株與10株參考毒株的氨基酸序列同源性為97.0% - 100. 0%。AH-F10株與N22株的氨基酸序列完全一致，與OV-SAOO株的氨基酸序列同源性高達(dá)97.0%，而與中國福建、山東及廣東地區(qū)流行毒株的氨基酸序列同源性為97.3% -99.1%。ORFV127基因位于末端變異區(qū)，該區(qū)域的基因大多具有較高的種間變異性，但根據(jù)對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AH-F10株的ORFV127基因編碼的蛋白質(zhì)保守性較高，因此本試驗(yàn)研究的ORFV127蛋白具有一定的代表性。

2.4 重組蛋白質(zhì)的SDS-PAGE檢測(cè)

取不同誘導(dǎo)時(shí)間的菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以未誘導(dǎo)的菌液作陰性對(duì)照。SDS-PAGE電泳結(jié)果（圖5）顯示，重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)的蛋白質(zhì)大小約為49 000，且在誘導(dǎo)3h時(shí)表達(dá)量最高。對(duì)ORFV127蛋白進(jìn)行可溶性分析，取超聲破碎后菌液的上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果（圖6）顯示，沉淀中有明顯特異性條帶，說明表達(dá)的ORFV127蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體的形式存在。

2.5 Western-blot鑒定

純化后的蛋白質(zhì)經(jīng)抗GST標(biāo)簽的單抗進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果（圖7）顯示，存在大小約49 000的特異性條帶及大小約27 000的GST蛋白，說明ORFV127-GST融合蛋白能夠被GST單抗特異識(shí)別，重組融合蛋白質(zhì)具有良好的反應(yīng)原性。

2.6 多克隆抗體的制備

獲得的蛋白質(zhì)經(jīng)第4次免疫后7d，小鼠眼眶采血并分離血清，用該血清作為一抗，ORFV127蛋白作為抗原進(jìn)行Western-blot鑒定，結(jié)果（圖8）表明，制備的多克隆抗體能夠與ORFV127蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而未誘導(dǎo)的pGEX-6P-1-ORFV/27重組菌未見該條帶。這說明制備的抗127-GST融合蛋白質(zhì)多克隆抗體特異性較好。

2.7 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ORFV127在Vero細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè)

轉(zhuǎn)染48 h后，用DAPI染色細(xì)胞核，在倒置熒光顯微鏡下觀察空載體和重組質(zhì)粒在Vero細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果（圖9）表明，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載體質(zhì)粒及pEGFP-N1-ORFV/27重組質(zhì)粒的細(xì)胞中綠色熒光均在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)。

3 討論

羊口瘡是一種重要的人畜共患傳染病，主要感染部分羊?qū)賱?dòng)物和人類，傳播速度較快，在世界各地的發(fā)生率不斷上升，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)造成威脅[6]。葛士坤等[18]對(duì)2006-2016年中國羊口瘡病毒的遺傳進(jìn)化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)世界各地流行的代表性毒株在中國均有變種分布，推測(cè)中國ORFV毒株進(jìn)化特殊且可能來源于國外OV-SAOO株和N22株。本研究從AH-F10株中擴(kuò)增出ORFV127基因全長，測(cè)序后將其序列與各地區(qū)經(jīng)典毒株序列進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果表明，AH-F10株ORFV127基因編碼的氨基酸序列與N22株的完全一致，與OV-SAOO株的氨基酸序列同源性為97.0%，而與中國福建、山東及廣東地區(qū)流行毒株的氨基酸序列同源性為97.3% - 99.1%。由此可見，在安徽地區(qū)流行的ORFV毒株較復(fù)雜，需對(duì)其演化進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)，為當(dāng)?shù)匾卟》揽丶皣鴥?nèi)外ORFV遺傳進(jìn)化分析提供基礎(chǔ)。

為深入了解ORFV127基因的功能，本試驗(yàn)對(duì)ORFV127基因進(jìn)行原核表達(dá)。原核表達(dá)是目前外源基因表達(dá)最常用的方法之一，而成功表達(dá)目的蛋白質(zhì)后獲取抗體則是研究該基因及其基因表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)功能的關(guān)鍵。本研究通過GST標(biāo)簽融合表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pGEX-6P-1-ORFV127，并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。在本試驗(yàn)中，IPTG濃度的變化對(duì)目的蛋白質(zhì)表達(dá)影響不明顯，但轉(zhuǎn)速及溫度的變化對(duì)目的蛋白質(zhì)表達(dá)有顯著影響，在33℃恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)誘導(dǎo)3h，大量高效表達(dá)出127-GST融合蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)經(jīng)尿素純化、蔗糖濃縮后免疫6周齡BALB/c雌鼠，經(jīng)Western-blot鑒定，成功獲得特異性良好的抗127-GST融合蛋白質(zhì)的多克隆抗體血清。這為建立新的ORFV檢測(cè)方法以及深入研究ORFV127功能提供寶貴的生物材料。

另外，為研究ORFV127基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)分布情況，本試驗(yàn)利用融合表達(dá)EGFP和ORFV127蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞中進(jìn)行127-EGFP融合蛋白質(zhì)的表達(dá)檢測(cè)。在病毒侵染過程中，病毒基因組的復(fù)制、蛋白質(zhì)的表達(dá)、粒體的組裝以及病毒在細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)等都是在特定的亞細(xì)胞位點(diǎn)完成的，病毒編碼蛋白質(zhì)的功能與其在細(xì)胞內(nèi)的定位密切相關(guān)。相關(guān)研究指出，在ORFV感染早期，ORFV127蛋白能夠抑制宿主體內(nèi)的先天反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，削弱抗原提呈細(xì)胞的抗原提呈能力，達(dá)到病毒抵抗宿主免疫反應(yīng)的目的[19-20]。本試驗(yàn)亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，綠色熒光聚集在細(xì)胞質(zhì)，提示該蛋白質(zhì)主要在細(xì)胞質(zhì)中行使其生物學(xué)功能，這與ORFV127蛋白抑制細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，干擾抗原呈遞的功能相一致。日后可以進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)過程，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)ORFV127蛋白的定位進(jìn)行觀察，有利于更加準(zhǔn)確、全面地掌握OR-FV127蛋白的定位信息，進(jìn)而分析該蛋白質(zhì)在ORFV感染宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮的作用。

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（責(zé)任編輯：王妮）