關(guān) 波 皇甫俊茹 徐 媛 周雪姣 劉雪英 王慶偉

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，陜西西安 710038；2.西安金花制藥廠生產(chǎn)部，陜西西安 710065；3.西安市胸科醫(yī)院藥劑科，陜西西安 710075；4.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物化學(xué)與藥物分析學(xué)教研室，陜西西安 710032

根皮素（Phloretin）是一種主要存在于梨、蘋果、金橘果皮或根皮及多種蔬菜中的類黃酮化合物[1-2]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)含有4 個(gè)酚羥基，決定了其較強(qiáng)的抗氧化活性[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，根皮素具有多種生物學(xué)活性，對(duì)癌細(xì)胞具有抑制作用[6-7]，對(duì)皮膚光損傷具有保護(hù)作用[8]，對(duì)心血管系統(tǒng)、高脂血癥和骨質(zhì)疏松等疾病也具有一定的治療作用[9-11]。透皮給藥可以顯著減少藥物的首過效應(yīng)和不良反應(yīng)，從而使藥物以恒定速度透過皮膚進(jìn)入體內(nèi)產(chǎn)生藥理作用[12-13]。本文擬分別考察氮酮、冰片、薄荷醇、麝香酮4 種促透劑對(duì)根皮素透過SD 大鼠皮膚的促透效應(yīng)，篩選出最優(yōu)促透劑，為根皮素系列經(jīng)皮給藥制劑研發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity 液相色譜系統(tǒng)（Agilent，American；包含Agilent 1260 泵、Agilent 1260 DAD 二極管陣列檢測(cè)器、Agilent 1260 色譜工作站）；Franz YB-P6智能透皮實(shí)驗(yàn)儀（天津標(biāo)準(zhǔn)儀器制造廠）；電子天平（德國(guó)Sartorius 公司，精度0.1 mg）；電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度0.01 mg）。

1.2 試劑

根皮素對(duì)照品（空軍軍醫(yī)大學(xué)藥化教研室提供，含量99.00%，批號(hào)：20170922）；根皮素原料（空軍軍醫(yī)大學(xué)藥化教研室提供，含量98.70%，批號(hào)：20170910）；氮酮（天門科捷制藥有限公司）；薄荷醇（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；冰片（天津市登峰化學(xué)品有限公司）；麝香酮（湖北夢(mèng)盛化工）；辛酸葵聚乙二醇甘油酯（法國(guó)嘉法師）；生理鹽水（西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司）；無水乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純）；乙腈（美國(guó)Tedia 公司，色譜純）；色譜用超純水自制。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2 月齡雄性SD 大鼠，18 只，SPF 級(jí)別，體重200～220 g，合格證號(hào)：37009200001779。購自空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號(hào)：SCXK（軍）2014-007]。自由飲食和進(jìn)食，室溫保持在（25±3）℃。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 法測(cè)定樣品中根皮素的含量

2.1.1 溶液的制備 精密稱量根皮素對(duì)照品5.20 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為520.0 μg/mL 根皮素母液，4℃冰箱中保存待用。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Iinertsil ODS-3（150 mm×4.6 mm，5 μm）；C18保護(hù)柱（10 mm ×4.6 mm，江蘇漢邦）；流動(dòng)相：乙腈-水（45∶55）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，進(jìn)樣量：20 μL，柱溫：25℃。

2.1.3 專屬性 取適當(dāng)濃度的根皮素對(duì)照品30%乙醇-生理鹽水（EPS）溶液、根皮素透皮吸收接收液和甲醇溶液，色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，根皮素色譜峰基線分離完全，tR 為3.8 min，其他成分不干擾根皮素的測(cè)定（圖1）。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與線性范圍的確定 精密量取根皮素對(duì)照品母液適量，用30%EPS 溶液逐步稀釋成0.1030、0.5148、2.574、5.148、17.16、34.32、51.48 μg/mL系列溶液。色譜條件下進(jìn)樣，根皮素峰面積Y 對(duì)濃度C進(jìn)行回歸，回歸方程為：Y=86.45C+3.901（r=0.9999），根皮素在0.1030～51.48 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 根皮素對(duì)照品及樣品色譜圖（根皮素色譜峰）

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取濃度分別為0.1030、5.148、51.48 μg/mL 的根皮素對(duì)照品30% EPS 溶液，于同一天重復(fù)進(jìn)樣5 次，連續(xù)3 d，每個(gè)樣品各進(jìn)樣5 次，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果見表1。所有RSD 均＜2.0%，表明該方法的精密度良好。

表1 根皮素測(cè)定方法精密度（n=5）

2.1.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取根皮素的甲醇和30% EPS 溶液，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，色譜條件下分別測(cè)定根皮素峰面積。24 h 峰面積的RSD 分別為0.912%和0.934%（n=5），表明根皮素甲醇和30%EPS 溶液在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取12 h 透皮接收液（根皮素含量為15.28 μg/mL）9 份，每份1.0 mL，置于5 mL 量瓶中，分為3 組，每組分別加入根皮素對(duì)照品30%EPS溶液（濃度為17.16 μg/mL）0.80、1.00、1.20 mL，加30%EPS 溶液至刻度，搖勻，測(cè)定根皮素含量。計(jì)算得平均回收率為99.36%。RSD 為1.02%（n=9）。

2.2 透皮吸收實(shí)驗(yàn)

2.2.1 皮膚的制備 健康SD 大鼠用乙醚麻醉，剪取劍突以下腹部去毛皮膚。剔除皮下脂肪組織及黏膜，生理鹽水沖洗至皮膚洗液不再白色渾濁，濾紙吸干皮膚表面，透過燈光檢查皮膚完整性，選取適當(dāng)大小無損傷的皮膚備用。

2.2.2 藥物溶液的制備 30%EPS 溶液中加入Labrasol（含量1.0%），作為基礎(chǔ)溶液。取多份適量基礎(chǔ)溶液加入根皮素和不同促透劑，根皮素的含量均為30 mg/mL，氮酮、冰片、薄荷醇、和麝香酮的含量分別是0.0%、1.0%、2.0%、4.0%，超聲混合均勻后待用。

2.2.3 促透劑促進(jìn)根皮素透皮吸收實(shí)驗(yàn) 設(shè)定Franz 擴(kuò)散池系統(tǒng)溫度為（37.0±0.2）℃，攪拌子轉(zhuǎn)速為300 r/min（長(zhǎng)度為1.0 cm）。SD 大鼠皮膚角質(zhì)層向上固定于供藥池和接收池之間，接收池中注入30%EPS 溶液，真皮一側(cè)與接收液充分接觸。系統(tǒng)溫度恒定后，供藥池中加入1.0 mL 供試液。恒速攪拌并開始計(jì)時(shí)，分別于1、2、4、6、8、12 h 抽取接收液1.0 mL，同時(shí)補(bǔ)加1.0 mL已預(yù)熱至37℃的30%EPS 溶液，排凈氣泡。HPLC 測(cè)定接收液樣品中根皮素的含量，按下式計(jì)算單位面積累計(jì)透過量（Qn）：式中，Cn為第n個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的根皮素濃度（μg/mL）；V 為接收液體積（17.0 mL）；Ci為第i 個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的根皮素濃度（μg/mL）；Vi為取樣體積（1.0 mL）；A 為滲透面積（1.67 cm2）。將Qn對(duì)時(shí)間t 進(jìn)行回歸，Qn-t 方程斜率即為根皮素的透皮速率常數(shù)Jss[μg/（cm2·h）]。根皮素的滲透系數(shù)為Kp=Jss/C，C 為供藥池的藥物濃度；增滲倍數(shù)為ER=KP/KP0，KP為加促透劑后根皮素的滲透系數(shù)，KP0為根皮素固有的滲透系數(shù)。供試液中根皮素濃度相同，故ER 為透皮速率常數(shù)之比，即ER=J促透劑組/J對(duì)照組。

2.3 結(jié)果

2.3.1 氮酮對(duì)根皮素的促透結(jié)果 不同濃度氮酮對(duì)根皮素透過大鼠皮膚均具有不同程度的促進(jìn)作用，與不含氮酮的對(duì)照液比較，隨著氮酮濃度的增大，促透效應(yīng)越強(qiáng)。Qn與時(shí)間t 呈較好線性關(guān)系，r 值均＞0.92。見表2、圖2 和表3。

表2 氮酮促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量（n=3）

圖2 氮酮促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量

表3 氮酮作用下根皮素透過大鼠皮膚的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.3.2 薄荷醇對(duì)根皮素的促透結(jié)果 不同濃度薄荷醇對(duì)根皮素透過大鼠皮膚均具有不同程度的促進(jìn)作用，與不含薄荷醇的對(duì)照液比較，隨著薄荷醇濃度的增大，促透效應(yīng)越強(qiáng)。Qn與時(shí)間t 呈較好線性關(guān)系，r 值均＞0.86。見表4、圖3 和表5。

表4 薄荷醇促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量（，n=3）

表4 薄荷醇促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量（，n=3）

2.3.3 冰片對(duì)根皮素的促透結(jié)果 不同濃度冰片對(duì)根皮素透過大鼠皮膚均具有不同程度的促進(jìn)作用，與不含冰片的對(duì)照液比較，隨著冰片濃度的增大，促透效應(yīng)越強(qiáng)。Qn與時(shí)間t 呈良好線性關(guān)系，r 值均＞0.88。4.0%時(shí)冰片的透皮速率相對(duì)較大：4.0%>2.0%>1.0%>0.0%。見表6、圖4 和表7。

圖3 薄荷醇促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量

表5 薄荷醇促根皮素的滲透動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表6 冰片促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量（，n=3）

表6 冰片促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量（，n=3）

注：“-”表示無數(shù)據(jù)

圖4 冰片促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量

表7 冰片促根皮素的滲透動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.3.4 麝香酮對(duì)根皮素的促透結(jié)果 不同濃度麝香酮對(duì)根皮素透過大鼠皮膚均具有不同程度的促進(jìn)作用，與不含麝香酮的對(duì)照液比較，隨著麝香酮濃度的增大，促透效應(yīng)越強(qiáng)。Qn與時(shí)間t 呈良好線性關(guān)系，r 值均＞0.90。4.0%時(shí)麝香酮的透皮速率相對(duì)較大：4.0%>2.0%>1.0%>0.0%。見表8、圖5 和表9。

表8 麝香酮促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量（，n=3）

表8 麝香酮促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量（，n=3）

圖5 麝香酮促根皮素離體大鼠皮膚的單位面積累積透過量

表9 麝香酮促根皮素的滲透動(dòng)力學(xué)參數(shù)

3 討論

根皮素結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基，是親脂性化合物，易溶于醇類中，在乙醇中有較好的溶解度[14]，為了增加根皮素在供給液及接收液中的溶解度，選擇30%EPS 作為實(shí)驗(yàn)供給液和接收液的溶劑。氮酮、冰片、薄荷醇、麝香酮4 種促透劑相對(duì)于水均為低密度脂溶性物質(zhì)，不能完全溶于供試溶液中形成均一體系，實(shí)驗(yàn)過程中不能與皮膚充分接觸，因此在供試液體系中加入表面活性劑Labrasol，發(fā)揮其增溶和乳化作用，使供試液為均一體系。

化合物自身的理化性質(zhì)是影響化合物透過皮膚屏障的關(guān)鍵因素，一般分子量與藥物的經(jīng)皮擴(kuò)散速度呈負(fù)相關(guān)，脂水分配系數(shù)在lgP 為1～3 時(shí)能較好透過皮膚[15]。已有研究表明，根皮素可以改變細(xì)胞膜的通透性，也作為滲透增強(qiáng)劑，被廣泛用于局部透皮給藥制劑中[16]，但根皮素自身透皮吸收較差。促透劑的選擇是透皮吸收的關(guān)鍵，本文選擇不同促透劑機(jī)制的促透劑，考察其對(duì)根皮素透皮吸收的促進(jìn)效應(yīng)。薄荷醇屬于單萜類化合物，研究發(fā)現(xiàn)一般在1%～5%范圍內(nèi)其促透效果與劑量呈效應(yīng)關(guān)系，其促透作用隨著濃度增大而增強(qiáng)[17]。氮酮能使角質(zhì)層的類脂質(zhì)產(chǎn)生不規(guī)則排列，增強(qiáng)角質(zhì)層的流動(dòng)性，有利于藥物透過角質(zhì)層[18]，冰片的促透機(jī)制是提取和擾亂角質(zhì)層類脂[19]，麝香酮可以選擇性改變皮膚阻力問題[20]。

實(shí)驗(yàn)考察的四種促透劑對(duì)根皮素均有促透皮效應(yīng)，且促透作用隨促透劑的濃度增加而增加，在實(shí)驗(yàn)考察的范圍內(nèi)，每一種促透劑濃度為4.0%的促透作用較大。以增滲倍數(shù)為指標(biāo)，促透劑濃度為1.0%時(shí)促透效應(yīng)為薄荷醇>麝香酮>冰片>氮酮；促透劑濃度為2.0%時(shí)促透效應(yīng)為薄荷醇>冰片>氮酮>麝香酮；促透劑濃度為4.0%時(shí)促透效應(yīng)為薄荷醇>氮酮>冰片>麝香酮。結(jié)果表明，薄荷醇對(duì)根皮素透過皮膚的促進(jìn)作用最好，其次為冰片和氮酮。但是，冰片和薄荷醇均有強(qiáng)烈的皮膚清涼感，當(dāng)濃度過大時(shí)皮膚難以接受，因此，在制劑研發(fā)時(shí)有必要依據(jù)產(chǎn)品的需求進(jìn)一步考察合適用量或多個(gè)促透劑聯(lián)合應(yīng)用。