張爽 葛雯 呂佳莉 黃聞宇

煎煮法提取苦櫧果總黃酮的響應(yīng)面分析

張爽1葛雯1呂佳莉2黃聞宇2

（1.安徽省蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽蕪湖，241000；2.安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，安徽蕪湖，241000）

研究人員采用傳統(tǒng)煎煮技術(shù)提取苦櫧果粉中黃酮，通過析因?qū)嶒?yàn)篩選，結(jié)合響應(yīng)面分析，以煎煮溫度、煎煮時(shí)間、煎煮料液比為自變量，總黃酮得率為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken中心組合輔助優(yōu)化提取條件，得出苦櫧果粉煎煮法最佳提取條件為：煎煮溫度為90°C ，煎煮時(shí)間為54min ，煎煮料液比為1：43 。

苦櫧果；總黃酮；煎煮法；響應(yīng)面分析。

苦櫧（是山毛櫸目、殼斗科、錐屬喬木，分布于中國長江五嶺以北各地，喜溫暖、濕潤氣候，喜光，也能耐陰；喜深厚、濕潤土壤，也耐干旱、瘠薄?？鄼焦麑?shí)的外表與板栗類似，種仁富含淀粉，總黃酮化合物含量豐富[1-2]。黃酮類化合物具有諸多生物活性，包括抗氧化、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗病毒、抗腫瘤等[3]。本實(shí)驗(yàn)通過煎煮法對苦櫧果實(shí)中的總黃酮進(jìn)行提取，在析因?qū)嶒?yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析中Box-Benhnken中心組合法輔助優(yōu)化提取條件，得到苦櫧果粉煎煮法最佳提取條件[4]。在該最佳條件下，我們可通過傳統(tǒng)煎煮法高效提取苦櫧果實(shí)中的總黃酮，操作簡單、成本低廉，有利于開發(fā)利用山區(qū)野生食物資源，促進(jìn)鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)致富。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

苦櫧果粉；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液；乙醇；5%亞硝酸鈉；10%硝酸鋁；氫氧化鈉；蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋；UV759CRT紫外可見分光光度計(jì)；JA1003N電子分析天平；T-D4高速離心機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1建立工作曲線回歸方程

精密稱取20.00mg干燥至恒重的蘆丁，置于小燒杯中；用少量60%乙醇溶解，再移至100.00mL容量瓶內(nèi)定容，即為0.20mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液；精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL及5.00 mL分別置于10.00mL容量瓶中，各加乙醇5.00 mL、4.50 mL、4.00 mL、3.00 mL、2.00 mL、1.00 mL及0.00mL，再加5%亞硝酸鈉溶液0.30mL，搖勻，靜置6min；加10%硝酸鋁溶液0.30mL，搖勻，放置6min；加入1.00mol/L氫氧化鈉溶液4.00mL，用乙醇定容至10.00mL，放置15min；在波長510nm處測吸光度；以濃度c對吸光度A作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到回歸方程?？傸S酮提取率計(jì)算公式如下：

式中：c 為總黃酮的濃度（mg·mL-1）；m為苦櫧果粉的質(zhì)量（g）； V 為溶液的體積（mL）；n 為稀釋倍數(shù)。

1.3.2煎煮溫度對苦櫧果粉中總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取1.00g苦櫧果粉，共稱五份，按料液比1：40g/ ml加水，標(biāo)記為試樣一、試樣二、試樣三、試樣四和試樣五；試樣一加熱至80℃，試樣二加熱至85℃，試樣三加熱至90℃，試樣四加熱至95℃，試樣五加熱至100℃，并維持60min，使苦櫧果粉中的總黃酮盡可能浸出；煎煮結(jié)束后，先用6層紗布粗濾，濾去較大的殘?jiān)?；所得濾液再用高速離心機(jī)（4000r/min）離心15min，分離除去細(xì)微殘?jiān)?，最后得澄清提取液；在波長510nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出濃度，計(jì)算得總黃酮得率，記錄數(shù)據(jù)C1、C2、C3、C4與C5，取三次平行實(shí)驗(yàn)數(shù)值的平均值為數(shù)值代表。

1.3.3煎煮料液比對苦櫧果粉中總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取1.00g苦櫧果粉，共稱五份，分別按料液比1：30g/ ml、1：35g/ml、1：40g/ml、1：45g/ ml、1：50g/ ml加水，在最適溫度下加熱并維持50min，使苦櫧果粉中的總黃酮盡可能浸出；煎煮結(jié)束后，先用6層紗布粗濾，濾去較大的殘?jiān)?；所得濾液再用高速離心機(jī)（4000r/min）離心15min，分離除去細(xì)微殘?jiān)?，最后得澄清提取液；在波長510nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出濃度，計(jì)算得總黃酮得率，記錄數(shù)據(jù)為V1、V2、V3、V4與V5，取三次平行實(shí)驗(yàn)數(shù)值的平均值為數(shù)值代表。

1.3.4煎煮時(shí)間對苦櫧果粉中總黃酮得率的影響

準(zhǔn)確稱取1.00g苦櫧果粉，共稱五份，按最適料液比加水，在最適溫度下加熱并分別維持30min、40min、50min、60min及70min，使苦櫧果粉中的總黃酮盡可能浸出；煎煮結(jié)束后，先用6層紗布粗濾，濾去較大的殘?jiān)?；所得濾液再用高速離心機(jī)（4000r/min）離心15min，分離除去細(xì)微殘?jiān)?，最后得澄清提取液；在波長510nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出濃度，計(jì)算得總黃酮得率，記錄數(shù)據(jù)為T1、T2、T3、T4和T5，取三次平行實(shí)驗(yàn)數(shù)值的平均值為數(shù)值代表。

1.3.5析因?qū)嶒?yàn)

我們利用Minitab軟件設(shè)計(jì)析因?qū)嶒?yàn)，選取煎煮溫度、煎煮時(shí)間、煎煮料液比3個(gè)因素，采用3因素3水平的析因?qū)嶒?yàn)篩選主要影響因素，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 析因?qū)嶒?yàn)因素及水平

1.3.6響應(yīng)面分析

在析因?qū)嶒?yàn)基礎(chǔ)上，我們根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以煎煮溫度、煎煮時(shí)間、煎煮料液比3個(gè)因素，以總黃酮得率為響應(yīng)值，做3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)共17個(gè)實(shí)驗(yàn)，其中5個(gè)為中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

繪制總黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=1.7636x+0.0041，R2=0.9991，由標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程可計(jì)算得出總黃酮得率。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1煎煮溫度對苦櫧果粉中總黃酮得率的影響

煎煮溫度對苦櫧果粉中總黃酮提取率的影響如圖1所示?？梢钥闯觯S著溫度升高，所測得樣液總黃酮得率逐漸增大，在90℃左右時(shí)總黃酮得率最大，超過這個(gè)溫度的提取率出現(xiàn)下降趨勢，這一現(xiàn)象可能與溫度過高會導(dǎo)致總黃酮分解速度加快有關(guān)。

圖1 煎煮溫度對苦櫧果粉中總黃酮得率的影響

2.2.2 煎煮料液比對苦櫧果粉中總黃酮得率的影響

由圖2可以看出，在最適煎煮溫度下，隨著料液比的增加總黃酮得率逐漸增大，在1:40左右處總黃酮得率達(dá)到最大，超過這個(gè)料液后，總黃酮得率逐漸減小。這一現(xiàn)象可能與提取液對黃酮溶解的飽和度有一定關(guān)聯(lián)。

圖2 煎煮料液比對苦櫧果粉中總黃酮得率的影響

2.2.3 煎煮時(shí)間對苦櫧果粉中總黃酮得率的影響

煎煮時(shí)間對苦櫧果粉中總黃酮提取率的影響如圖3所示?？梢钥闯?，在最適煎煮溫度和最佳料液比的條件下，在20-30min時(shí)，苦櫧總黃酮提取率隨時(shí)間延長逐漸增高，在30min處提取率最高，之后總黃酮提取率呈穩(wěn)定或下降趨勢。

圖3 煎煮時(shí)間對苦櫧果粉中總黃酮得率的影響

2.3 析因?qū)嶒?yàn)結(jié)果及分析

以煎煮溫度、煎煮時(shí)間、煎煮料液比為自變量，總黃酮得率為響應(yīng)值。回歸方程的方差分析結(jié)果如表3所示。我們利用MINITAB軟件對析因?qū)嶒?yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：煎煮料液比P值< 0.05，表明煎煮料液比對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著；煎煮溫度、煎煮時(shí)間P值> 0.05，說明它們對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著；復(fù)相關(guān)系數(shù)為94.72%，說明該模型可以對94.72%的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行解釋，可以用此模型對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析和預(yù)測。

表3 析因?qū)嶒?yàn)顯著性檢驗(yàn)表及方差分析

（Adj SS：調(diào)整后的離差平方和；Adj MS：調(diào)整后的均方差；F：綜合評分；P<0.01，結(jié)果極顯著；0.01

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 回歸方程的建立及模型的方差分析

根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以煎煮溫度、煎煮時(shí)間與煎煮料液比為3個(gè)影響因素，以總黃酮得率為響應(yīng)值，所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。回歸方程的方差分析結(jié)果如表5所示。

表4 析因?qū)嶒?yàn)結(jié)果

我們以煎煮溫度（A）、煎煮時(shí)間（B）、煎煮料液比（C）為自變量，以總黃酮含量（Y）為因變量，建立回歸方程：

Y=0.011850 + 0.000071 A + 0.000000 B- 0.001205 C - 0.004608 A*A - 0.003049 B*B + 0.000212 C*C - 0.000565 A*B+ 0.000427 A*C + 0.004255 B*C

表5 回歸方程的方差分析結(jié)果

對該模型進(jìn)行方差分析及復(fù)相關(guān)系數(shù)考察的結(jié)果表明：該模型的P值為0.000 < 0.01，表明該模型顯著性極好；溫度的P值0.850 > 0.05，說明溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著，但溫度×溫度的P值0.000 < 0.05，說明溫度×溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著；時(shí)間的P值0.975 > 0.05，但時(shí)間×?xí)r間的P值0.000 < 0.05，說明時(shí)間×?xí)r間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著；煎煮料液比P值0.036 < 0.05，說明料液比對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著。

2.4.2實(shí)驗(yàn)因素的交互作用分析

實(shí)驗(yàn)因素之間交互作用的等值線圖和響應(yīng)面立體分析圖如圖4、圖5及圖6所示。響應(yīng)面圖可以直觀地反映出煎煮時(shí)間、煎煮溫度和煎煮料液比三個(gè)因素對苦櫧果實(shí)樣品中總黃酮得率的影響。

圖4 煎煮時(shí)間和煎煮溫度對總黃酮得率影響的等值線圖

圖5 煎煮料液比和煎煮溫度對總黃酮得率影響的等值線圖

圖6 煎煮料液比和煎煮時(shí)間對總黃酮得率影響的等值線圖

2.4.3最優(yōu)提取工藝條件驗(yàn)證

為了驗(yàn)證提取工藝的可靠性，我們在上述最佳工藝條件下平行提取5次，苦櫧果粉總黃酮平均得率3.553%。該數(shù)值與模型預(yù)測值比較接近，說明該模型具有實(shí)際使用價(jià)值。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

通過響應(yīng)面分析，我們初步得出結(jié)論：傳統(tǒng)煎煮法提取苦櫧果實(shí)中總黃酮的最佳工藝方法是煎煮溫度為90°C，煎煮時(shí)間為54min及煎煮料液比為1：43。采取此工藝得出的總黃酮提取率最高，且經(jīng)多次檢驗(yàn)被證明為合格有效。

[1]劉光憲. 苦櫧黃酮、淀粉、果膠的提取及理化性質(zhì)研究[D]. 南昌:南昌大學(xué), 2008.

[2]涂宗財(cái),劉光憲,豆玉新,等. 苦櫧果實(shí)總黃酮的提取及純化[J]. 食品研究與開發(fā), 2008,29(1):33-36.

[3]孔方,李莉,劉言娟. 超聲輔助低共熔溶劑提取蘋果葉中的總黃酮[J/OL]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20200311.1847.015.html. 食品工業(yè)科技, 2020-03-12.

[4]上官艷妮,李林,潘胤池,等. Box-Benhnken響應(yīng)面法優(yōu)化白及愈傷組織的增殖培養(yǎng)基配方[J]. 生物資源, 2020,42(1):131-135.

Response Surface Analysis on Total Flavones Extracted from Castanopsis Sclerophylla Fruit by Decocting Method

ZHANG Shuang1& GE Wen1& LV Jia-li2& HUANG Wen-yu2

The traditional decocting technology was used to extract the flavones from Castanopsis sclerophylla fruit powder. Through screening by the factorial experiment, combined with response surface analysis, by taking the decocting temperature, decocting time and decocting material liquid ratio as independent variables and the total flavones yield as the response value, and the Box-Benhnken center combination was used to assist in optimizing the extraction conditions so that the optimal extraction conditions for the decocting method of Castanopsis sclerophylla fruit powder were obtained as follows: the decocting temperature was 90 ℃; the decocting time was 54 minutes; the ratio of decocting material to liquid was 1:43.

Castanopsis Sclerophylla fruit; total flavones; decocting method; response surface analysis.

TS251.9

A

1009-1114（2020）02-0021-05

2020-02-28

張爽(1975—)，女，安徽蕪湖人，碩士，教授，食品檢驗(yàn)高級技師，主要從事食品營養(yǎng)與安全研究。

安徽省高校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：KJ2017A555）；安徽省高校質(zhì)量工程項(xiàng)目高水平高職專業(yè)（項(xiàng)目編號：2018ylzy156）成果。

文稿責(zé)編 張瑋