劉雪鶴，李正陽，高文青，洪利國，甘建華，李繼喜

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438； 2.復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438)

結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病是危害嚴(yán)重、傳染性較強的全球慢性傳染病之一，具有潛伏感染的特性.由于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁含有大量的分枝菌酸，對干燥、理化等因素抵抗能力強，可在環(huán)境中長時間保持活性與毒力，比如在陰暗灰塵中可存活90～120d、痰中可存活6～8個月[1].

RNA解旋酶(RNA helicases)是一個包含了與RNA代謝(從翻譯起始、核糖體形成、前mRNA拼接和mRNA降解)許多方面有關(guān)的蛋白質(zhì)家族.RNA解旋酶依賴于ATP水解，識別并依賴于單鏈結(jié)構(gòu)的存在，在RNA復(fù)制過程中起到催化雙鏈RNA解旋的作用[2-3].

在已知的核糖體組裝因子中，DEAD-box解旋酶家族蛋白起著關(guān)鍵作用.DEAD-box解旋酶有9個特征性基序，以其中MotifⅡ的氨基酸序列d-e-a-d而命名.這些蛋白具有RNA解旋酶活性，可解旋游離的雙鏈RNA；同時在多個生理過程中起著重要作用，比如可作為RNA分子伴侶，介導(dǎo)RNA-蛋白重組[4-5].結(jié)核分枝桿菌內(nèi)切核糖核酸酶E(RhlE)依賴于ATP水解，屬于RNA降解體中的RNA解旋酶[6-10].RNA降解體(RNA degradosome)在RNA代謝和核糖體組裝中起著重要作用.盡管結(jié)核分枝桿菌RNA降解體研究較少，但對大腸桿菌來源的RNA降解體的研究，表明其可根據(jù)環(huán)境的變化來選擇并招募解旋酶和其他輔助蛋白來裝配自己，主要包含5個同源蛋白： CSDA，DBPA，RhlB，RhlE和SRMB.這些酶具有特定的功能： SrmB和CSDA參與核糖體的生物合成[11-13]，RhlB參與mRNA的降解[14-15]，DbpA參與了mRNA降解，其解旋酶活性依賴于23S rRNA[16-18]，而RhlE調(diào)控其他解旋酶，一旦缺失可引起核糖體成熟延滯[19-20].結(jié)核分枝桿菌RNA降解體在宿主巨噬細(xì)胞發(fā)揮侵染過程中起著重要作用.因此，針對RNA降解體尤其是關(guān)鍵調(diào)控蛋白RhlE的研究可為發(fā)掘新型抗結(jié)核感染藥物提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料和主要試劑

1.1.1 材料

各種限制性內(nèi)切酶、以及T4DNA連接酶等均購自TaKaRa公司.E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)plys S感受態(tài)菌株，大腸桿菌表達載體pMST3質(zhì)粒均是本實驗室保存，鎳柱親和層析柱和凝膠過濾層析柱均購自GE Healthcare.DNA序列測定由上海擎科公司完成.

1.1.2 主要試劑

β-ME(β-巰基乙醇)購自Amresco公司，蛋白Maker購自NEB公司與Thermo-fisher公司，蛋白濃縮管(30kDa/50kDa)購自Millipore公司，帶有發(fā)光基團Cy3/Cy5的單鏈RNA購自金唯智公司.

1.2 方法

1.2.1 結(jié)核分枝桿菌RhlE的克隆，蛋白表達及純化

以結(jié)核分枝桿菌MycobacteriumtuberculosisH37Ra(無毒株)基因組DNA片段作為模板擴增獲得了全長RhlE蛋白(NP_217727.1).選用BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點將該目的基因連接到N端可表達6× His-Sumo標(biāo)簽的pSMT3載體中.經(jīng)測序正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)plysS細(xì)胞中用于蛋白表達.當(dāng)OD600達到0.8時，加入終濃度為0.5mmol/L IPTG在16℃條件下誘導(dǎo)蛋白表達.20h后于4℃以6000r/min離心20min收集細(xì)菌，將細(xì)菌沉淀重懸于裂解緩沖液(50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，500mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，5%甘油，2mmol/L β-ME)中經(jīng)高壓破菌儀破碎，然后在4℃以18000r/min離心60min去除細(xì)胞碎片.將收集到的上清溶液通過鎳親和層析柱(GE Healthcare)純化并在緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，5%甘油，2mmol/L β-ME)中洗脫.經(jīng)Ulp1酶酶切后，透析去除His-Sumo標(biāo)簽，再用Superdex 200 16/600凝膠過濾層析柱(GE Healthcare)進一步純化RhlE蛋白，其洗脫緩沖液為20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，300mmol/L NaCl，2mmol/L DTT.蛋白純化鑒定參考文獻[21]，使用SDS-PAGE方法.

1.2.2 動態(tài)光散射(DLS)分析

動態(tài)光散射(DLS)測定參考文獻[22]，在DynaProNanoStar(Wyatt Technology， USA)的DYNAMICS軟件上完成，光源波長為658nm，固定散射角為90°.將結(jié)核分枝桿菌RhlE稀釋至1mg/mL，稀釋緩沖液成分為20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，300mmol/L NaCl，2mmol/L DTT，每個樣品測量10次.

1.2.3 RhlE酶活性質(zhì)的測定

酶活性質(zhì)測定所用的RNA底物均購自金唯智公司，序列如下： Cy5標(biāo)記的RNA單鏈，Cy5-5′-GCUUUACGGUG-3′；Cy3標(biāo)記的RNA單鏈，5′-AACAAAACAAAAUAGCACCGUAAAGC-3′-Cy3；未標(biāo)記的RNA單鏈，5′-UAGCACCGUAAAGC-3′.RNA粉末溶于DEPC水，Cy5標(biāo)記的RNA單鏈與Cy3標(biāo)記的RNA單鏈共20μmol/L，在75mmol/L KCl和10mmol/L Hepes-Na(pH 7.5)緩沖液中室溫孵育10min，構(gòu)成復(fù)合物底物(圖1).此復(fù)合物在解旋酶RhlE的解旋作用下打開雙鏈，Cy3熒光強度增強，由Cy3至Cy5的熒光偏振強度減弱.

RhlE解旋緩沖液為： 10mmol/L Hepes-Na(pH 7.5)，60mmol/L NaCl，55mmol/L KCl，5%(體積比)甘油.反應(yīng)體系包括20nmol/L雙熒光基團復(fù)合物，0.2μmol/L未標(biāo)記的RNA單鏈，和2mmol/L ATP/Mg，最后加入RhlE蛋白(0.6μmol/L).底物熒光基團(Cy3)在500nm波長處激發(fā)，565nm波長處發(fā)射.與此同時，Cy3到Cy5兩熒光基團的熒光共振能量轉(zhuǎn)移由540nm波長處激發(fā)，由665nm波長處發(fā)射.參考文獻[23]，通過M5e酶標(biāo)儀(美谷分子儀器上海有限公司SpectraMax M5)進行檢測，所有實驗均有3組平行.

1.2.4 小角散射分析RhlE蛋白

小角X射線散射(SAXS)是指當(dāng)X射線透過試樣時，在靠近原光束2°～5°的小角度范圍內(nèi)發(fā)生的散射現(xiàn)象.被用于分析蛋白輪廓，測定蛋白在溶液中的大小、形狀及分布.對于完全均勻的物質(zhì)，其散射強度為零.當(dāng)出現(xiàn)第二相或不均勻區(qū)時才會發(fā)生散射，且散射角度隨著散射體尺寸的增大而減小.新鮮純化好的RhlE蛋白在國家蛋白質(zhì)中心上海光源BL19U2線站上收集數(shù)據(jù).蛋白濃度為1～5mg/mL，緩沖液為20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，100mmol/L NaCl.每個蛋白樣品重復(fù)3次，并以空白緩沖液做對照.收集的SAXS數(shù)據(jù)，經(jīng)PRIMUS和GASBOR軟件處理，得出RhlE蛋白分子輪廓.分析工作均在上海光源BL19U2線站進行，其波長為1.03?.具體流程參考文獻[24]，所用程序均來自ATSAS程序包(https：∥www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html).

2 結(jié)果與分析

2.1 RhlE與同源家族解旋酶蛋白的生物信息學(xué)分析

為了揭示蛋白RhlE的潛在催化活性位點，將RhlE和DEAD-box家族的其他同源酶類(包括嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的CshA，幽門螺旋桿菌來源的RhpA，蠟樣芽胞桿菌來源的CshE，豌豆蚜來源的DeaD)進行了多序列同源比對，結(jié)果見圖2.二級結(jié)構(gòu)比對是基于CshA的晶體結(jié)構(gòu)通過Clustal W(https：∥www.genome.jp/tools-bin/clustalw)進行的，然后用ESPript3.0(http：∥espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)進行顯示.結(jié)果表明RhlE與其他幾個酶均具有較多共有的區(qū)域，這表明RhlE確實屬于DEAD-box家族.

2.2 RhlE蛋白的表達和純化

重組RhlE質(zhì)粒在大腸桿菌中可溶性表達且表達量較高.通過鎳柱親和層析純化后獲得高純度的重組蛋白，使用凝膠過濾層析柱Superdex 200 16/600進一步純化，Ulp1酶酶切去除Sumo標(biāo)簽后的RhlE蛋白，在凝膠過濾層析柱上以98ml的峰洗脫出來，其對應(yīng)分子量為60kDa，與理論分子量52.8kDa相符合，表明RhlE在溶液中以單體形式存在，如圖3(a)所示，其洗脫樣品的SDS-PAGE考馬斯亮藍染色分析結(jié)果如圖3(b)所示.

2.3 動態(tài)光散射(DLS)分析RhlE蛋白溶液均一性

動態(tài)散射光(DLS)用于確定蛋白溶液中顆粒的粒度分布，以評估蛋白溶液的均一性.通常Pd%(Polydispersity%)<20%的樣品被認(rèn)為是單分散溶液.通過DLS測定表明RhlE蛋白在溶液中擁有兩個峰，如圖(4)所示，峰1的半徑、Pd%和Mass%分別為8.2nm、8.7%和92.0%.峰2的半徑、Pd%和Mass%分別為108.2nm、24.9%和8.0%.綜上所述，RhlE蛋白在溶液中是均勻分布的.

2.4 RhlE的酶學(xué)活性分析

為了揭示RhlE蛋白的催化活性和酶學(xué)特性，我們對其酶學(xué)性質(zhì)進行了測定.酶活反應(yīng)是在22℃，10mmol/L Hepes(pH 7.5)，60mmol/L NaCl，55mmol/L KCl，5%甘油(體積比)的反應(yīng)液中進行，通過RhlE水解帶有熒光發(fā)光基團的雙鏈RNA底物的能力來確定[23]，此底物在解旋酶RhlE的解旋作用下打開雙鏈，通過由Cy3至Cy5的熒光偏振強度和對Cy3熒光強度的測定來檢測RhlE蛋白的解旋酶能力.當(dāng)由Cy3至Cy5的熒光偏振強度減弱，說明擁有完整結(jié)合形態(tài)的RNA底物濃度降低，RhlE存在有效的解旋能力，當(dāng)Cy3熒光強度增強，說明解旋開來的帶有Cy3標(biāo)記的RNA單鏈濃度升高，同時也證明了RhlE的解旋能力.測定結(jié)果如圖5所示.可以看出，當(dāng)有ATP/Mg存在情況下，RhlE可以解旋帶有熒光基團的雙鏈RNA底物，具有較高活性(雙鏈RNA的熒光強度設(shè)定為1)；同時在ATP/Mg的存在下熒光偏振相對強度較低.二者結(jié)合表明，在ATP/Mg存在時，大腸桿菌表達純化的RhlE可以高效解旋雙鏈RNA底物.

2.5 RhlE小角散射(SAXS)分析

我們主要通過SAXS來研究RhlE在溶液中的結(jié)構(gòu)輪廓.收集到的SAXS數(shù)據(jù)經(jīng)相應(yīng)軟件(primus與pymol軟件)處理后，發(fā)現(xiàn)RhlE蛋白在溶液中形成骨頭形狀，如圖6所示.通過GNOM計算出分子距離分布函數(shù)(Interparticle Distance Distribution Function)P(r)，可以得到RhlE在溶液中粒徑大小為125?.后使用Dammin軟件進行3D建模，并將模型與同源性為43.39%的ATP依賴性解旋酶CshA(PDB： 5IVL)三維結(jié)構(gòu)模型相疊加，結(jié)果如圖6(c，d)所示，CshA結(jié)構(gòu)與RhlE分子輪廓基本吻合，這表明解旋酶RhlE與CshA具有結(jié)構(gòu)上的保守性，其參與的生理功能也很相似[25].

3 討 論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的全球范圍的慢性傳染病，危害嚴(yán)重.我國是結(jié)核病高發(fā)病國家之一，發(fā)病人數(shù)僅次于印度位居世界第二位[26].已有研究表明，大腸桿菌來源的RhlE廣泛存在于不同細(xì)菌中，尤其在嗜冷生物適應(yīng)性中起著重要的功能.RhlE參與RNA降解體的形成，通過解旋雙鏈RNA的螺旋結(jié)構(gòu)來輔助PNP酶的活性，對核糖體的裝配有著重要的意義[27].同時，結(jié)核分枝桿菌來源的RhlE與大腸桿菌RhlE的一級序列同源度為51%，所參與的生理功能類似.我們克隆、表達并純化了結(jié)核分枝桿菌RhlE，并結(jié)合DLS和SAXS進行了分析，發(fā)現(xiàn)RhlE具有解旋雙鏈RNA的活性，在溶液中性質(zhì)均一，以單體形式存在，這些發(fā)現(xiàn)可以為將來進一步通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段解析其三維結(jié)構(gòu)，闡述其功能提供重要的參考價值.另外，結(jié)核病治療藥物鹽酸莫西沙星氯化鈉，通過抑制細(xì)菌解開DNA超螺旋的解旋酶拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的酶活性而起作用.因此，RhlE作為結(jié)核分枝桿菌來源的RNA解旋酶，也有可能作為結(jié)核病的藥物靶點，對以后結(jié)核病的藥物靶點研究起到借鑒作用.