鳳凰單樅茶不同香型的分類研究

魏建華 張林田 李冠斯

摘要 [目的]建立一種簡單實(shí)用的鳳凰單樅茶香型分類方法。[方法]應(yīng)用高效液相色譜方法研究香型不同的鳳凰單樅茶的指紋圖譜，采用相似度分析軟件進(jìn)行分析比較，獲得21個識別用共有特征峰;根據(jù)相對峰面積，采用判別分析法進(jìn)行分類研究，初步建立鳳凰單樅茶8種香型鑒定方法。[結(jié)果]能夠?qū)⑴c試驗(yàn)的52個樣品按照8個香型明顯分類，正確分類率為100%。其中鴨屎香和杏仁香區(qū)分明顯，證明可將鴨屎香獨(dú)立于杏仁香，單獨(dú)歸為一個香型。[結(jié)論]該研究驗(yàn)證了基于化學(xué)指紋圖譜的鳳凰單樅茶以不同香型分級判別研究是可行的。

關(guān)鍵詞 鳳凰單樅茶;香型;高效液相色譜;色譜指紋圖譜;判別分析法

中圖分類號 TS272 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）05-0193-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.055

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract [Objective]A simple and practical method was established to classify Fenghuang Dancong Tea with different aromatics.[Method]The chromatographic fingerprint of Fenghuang Dancong Oolong Tea was studied by high performance liquid chromatography（HPLC）.The similarity analysis software was used to analyze and compare the fingerprints.The precision and repeatability of the method were good.Twentyone common characteristic peaks for identification were obtained. According to the relative peak area， the method of discrimination analysis was used to classify Fenghuang Dancong Tea by different aromatics， and an elevation identification method for Fenghuang Dancong Tea was preliminarily established.[Result]The results showed that fiftytwo samples were classified according to eight fragrance types， and the correct classification rate was 100%.The distinction between Yashixiang and Xingrenxiang was obvious， so the Yashixiang could be clsassified as a single aroma pattern.[Conclusion]This study verified that the Fenghuang Dancong Tea based on chemical fingerprints was practicable for differentiating the classification of different aroma types.

Key words Fenghuang Dancong tea;Aromatics;High performance liquid chromatography;Chromatographic fingerprint;Method of discrimination analysis

鳳凰單樅茶是與武夷巖茶、安溪觀音齊名的烏龍茶三大品系，具有特定的栽培技術(shù)和采集加工方法，已經(jīng)獲得了國家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)以及注冊了國家地理標(biāo)志商標(biāo)，保護(hù)范圍為潮州市所轄41個鎮(zhèn)中的30個，該山區(qū)海拔為300～1 500 m，茶的立地條件以及品種有很大差異，導(dǎo)致茶的品質(zhì)、香型多種多樣。鳳凰單樅茶是從鳳凰水仙品種中選育出來的優(yōu)異單株及其培育出來的品種、品系和株系，并采用獨(dú)特的加工工藝制作而成的具有類似多種天然花香和特殊韻味品質(zhì)的烏龍茶[1]。由于長期的小戶分散種植，品種命名依據(jù)不統(tǒng)一，使得新同名異物、同物異名，品種（系）的香型難以斷定，所以鳳凰單樅茶的香型分類與鑒定一直受到關(guān)注。傳統(tǒng)的以感官審評為主的香型鑒定存在一定的主觀性，缺乏客觀的科學(xué)依據(jù)，分類結(jié)果時有爭議。香氣質(zhì)量是茶葉的核心競爭力之一，香氣品質(zhì)是影響鳳凰單樅茶風(fēng)味和價格的重要因素。因此亟需一種客觀、科學(xué)、有效的分類鑒定方法[2]。

現(xiàn)有的對于鳳凰單樅茶香型研究主要集中于：①研究揮發(fā)性物質(zhì)，了解茶的呈香原理，指導(dǎo)茶樹育種，選育培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)的品種[3];②通過茶鮮葉所含的芳香物質(zhì)成分及其在加工過程中的變化分析，對茶葉芳香物質(zhì)的形成機(jī)理進(jìn)行研究，改進(jìn)加工方法[4];③為了通過配茶，提高低山茶、田地茶品質(zhì)而進(jìn)行的香型研究[5]。當(dāng)茶葉流轉(zhuǎn)到市場時，消費(fèi)者、市場監(jiān)管部門所面對的是已經(jīng)加工好了的成茶，特別是茶葉國際貿(mào)易中涉及到進(jìn)口商、出口商、海關(guān)以及第三方檢測機(jī)構(gòu)的品質(zhì)驗(yàn)證，需要一種簡單的鳳凰單樅茶的香型分類方法[6]。

茶葉指紋圖譜是指特定品種或特定產(chǎn)地的茶葉經(jīng)處理后，采用適當(dāng)分析手段，得到能表征其特征的色譜圖以及數(shù)據(jù)庫。如歐陽石光[7]利用 GC/GC-MS技術(shù)分析茶樣香氣，構(gòu)建了婺源綠茶和武夷巖茶的香氣指紋圖譜。但是茶葉香氣是揮發(fā)性或半揮發(fā)性成分，相對含量少，成分復(fù)雜，穩(wěn)定性差，提取過程中易受外界條件影響發(fā)生氧化、縮合、聚合、基團(tuán)轉(zhuǎn)移等復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)[8]。

該研究嘗試直接對茶葉提取物進(jìn)行高效液相分析，避開不穩(wěn)定的揮發(fā)性香氣成分，關(guān)注能夠穩(wěn)定提取的香氣化學(xué)成分的整體性和模糊性，將試驗(yàn)分析與化學(xué)計(jì)量法兩者結(jié)合分析，建立一種基于高效液相指紋圖譜和判別分析法的鳳凰單樅茶不同香型的鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

選用Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國）：DAD檢測器，四元梯度泵;Millipore Advantage A10超純水系統(tǒng)（美國）;梅特勒-托利多AL204-IC電子分析天平（瑞士）;CBL photoelectron TECHNOLOGY Model C9860A型超聲波清洗器。

1.2 試劑

液相用乙腈、甲酸為色譜純;液相用水為超純水;其余試劑均為分析純。

沒食子酸（GA）的標(biāo)準(zhǔn)品（Dr.E）、表沒食子酸兒茶素（EGC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）的標(biāo)準(zhǔn)品（Chromadex）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、兒茶素沒食子酸酯（CG）的標(biāo)準(zhǔn)品，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.3 試驗(yàn)材料

該試驗(yàn)材料根據(jù)《鳳凰單從（樅）茶地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)管理辦法》規(guī)定的鳳凰單樅茶產(chǎn)地范圍，向當(dāng)?shù)夭柁r(nóng)直接購買的已知香型的鳳凰單樅茶樣品52個，屬于8種香型，分別是黃枝香4個、桂花香4個、玉蘭香3個、芝蘭香8個、蜜蘭香9個、杏仁香5個、鴨屎香14個、姜花香5個。

1.4 供試品的制備

稱取3.00 g（粉碎）干茶樣，用50%乙醇在室溫下浸提15 min，過濾并洗滌濾渣3次，合并濾液，冷卻后定容100 mL;0.22 μm濾膜過濾后備用。

1.5 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Synergi MAX-RP C12 80A（250 mm×4.6 mm，4 μm）;柱溫30 ℃;流動相：A相為1%甲酸，B相為乙腈，B相梯度從10%到30%;流速：1 mL/min;檢測時長60 min;檢測波長280 nm[9]。

1.6 樣品測定

吸取“1.4”所得供試品溶液，注入高效液相色譜儀中進(jìn)行高效液相色譜檢測，進(jìn)樣量為20 μL。按照“1.5”色譜條件分析測定，采集60 min色譜數(shù)據(jù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析軟件

用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012.130723版本）評價色譜指紋圖譜相似度;使用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜指紋圖譜的建立

對上述52個已知香型的鳳凰單樅的樣品均進(jìn)行高效液相色譜檢測，在獲取了每個樣品的高效液相色譜圖后，使用的色譜指紋圖譜相似度評價軟件再獲取每類的鳳凰單樅茶的指紋圖譜的共有特征峰。

分別將屬于不同香型的茶樣品的高效液相色譜圖導(dǎo)入色譜指紋圖譜相似度評價軟件中進(jìn)行指紋圖譜相似度分析，每類茶相似度大于0.9，生成對照圖譜，使用數(shù)據(jù)匹配功能可以獲得每種香型所有測試樣品的共有峰;將8種不同香型的鳳凰單樅茶的對照圖譜使用相似度分析軟件進(jìn)行相似度分析，相似度大于0.9，通過匹配數(shù)據(jù)功能，獲得8種不同香型鳳凰單樅茶指紋圖譜所具有的共有峰;確定共有特征峰的數(shù)量及與共有特征峰對應(yīng)的保留時間。

2.2 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的目的是避免了保留時間數(shù)據(jù)漂移和色譜檢測儀器造成的峰面積不一致問題，以便于使用多元分析法進(jìn)行分類。樣品指紋圖譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，首先需要確定基峰，其次樣品指紋圖譜中共有特征峰的保留時間和峰面積與基峰的保留時間和峰面積的比值為相對保留時間和相對峰面積。

2.2.1 確定基峰及指紋圖譜中相同色譜峰的認(rèn)定范圍。

分析該研究收集的所有茶葉的高效液相色譜圖發(fā)現(xiàn)，在保留時間為（17.20±0.25）min內(nèi)峰面積最大峰是整個指紋圖譜中峰面積最大或者次大峰;經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品檢測，該峰為表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG的色譜峰。選擇該峰為基峰，進(jìn)行保留時間和峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化。同樣的儀器和色譜條件下，不同次的檢測，其相對保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%。因此該研究設(shè)定對于不同茶樣品指紋圖譜中是否含有相同的峰的標(biāo)準(zhǔn)方法是：保留時間為（17.20±0.25）min內(nèi)峰面積最大峰，即表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG的色譜峰，以該峰為基峰，計(jì)算相對保留時間，設(shè)定相對保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為2%，處于該設(shè)定范圍，認(rèn)為不同鳳凰單樅茶樣品的指紋圖譜與此峰的相對保留時間一致的，是相同的色譜峰。避免了保留時間數(shù)據(jù)漂移和色譜檢測儀器造成的峰不一致問題，提高鑒定模型的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

2.2.2 保留時間和峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化。

將每類樣品指紋圖譜中共有特征峰的保留時間和峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

分別計(jì)算每種鳳凰單樅茶的指紋圖譜中的共有特征峰保留時間與基峰保留時間的比值，作為相對保留時間;分別計(jì)算每個鳳凰單樅茶的指紋圖譜中的共有特征峰峰面積與基峰峰面積的比值，作為相對峰面積。

2.3 篩選識別用共有特征峰

從“2.1”中獲得的共有峰中，篩選共有特征峰，作為識別用共有特征峰。

共有特征峰的相對保留時間和相對峰面積作為篩選參數(shù)，相對保留時間一致的且穩(wěn)定出現(xiàn)的峰作為鳳凰單樅茶不同香型識別用共有特征峰。

篩選步驟：①相對峰面積排序，去除與最大峰面積比小于0.01%的共有峰。

②相對保留時間。根據(jù)每類鳳凰單樅茶的共有特征峰的相對保留時間一一進(jìn)行匹配，設(shè)定相對保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為2%，各類鳳凰單樅茶的共有特征峰的相對保留時間，處于該設(shè)定范圍，認(rèn)為每類鳳凰單樅茶指紋圖譜與此峰的相對保留時間一致的，保留該峰，否則棄去。共獲得21個用于鳳凰單樅茶不同香型的共有特征峰（占總峰面積的 90%以上）;將此21個峰對應(yīng)的相對保留時間進(jìn)行集中排序，以識別用共有特征峰作為列，每個樣品作為行，所述相對峰面積填入相應(yīng)的單元格。不同香型的鳳凰單樅茶的共有特征峰的相對保留時間如表1所示。

2.4 判別分析

上述數(shù)據(jù)集中包含8組52條單茶葉樣品數(shù)據(jù)，用變量T作為樣品標(biāo)識。每條樣品數(shù)據(jù)都由21個變量信息（記為x1，x2，…，x11）構(gòu)成;并用分類變量P記錄類別，P值為1代表黃枝香，P值為2代表桂花香，P值為3代表玉蘭香，P值為4代表芝蘭香，P值為5代表蜜蘭香，P值為6代表杏仁香，P值為7代表鴨屎香，P值為8代表姜花香。使用SPSS 20.0軟件，將典則判別分析源文件輸入統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行典則判別分析，以P為分組變量，對數(shù)據(jù)集做判別分析。線性判別函數(shù)中選取了7個較大的特征值，累積方差達(dá)到100%，保留了變量的所有信息量，香型鑒定的典則判別特征值見表2。

從8組不同香型的鳳凰單樅茶樣品散點(diǎn)圖（圖1）可以看到，在以典則判別函數(shù)1為X軸、典則判別函數(shù)2為Y軸的坐標(biāo)圖中，8組不同香型的鳳凰單樅茶，其中第3類即鳳凰單樅玉蘭香樣品明顯聚集在坐標(biāo)圖的左側(cè)中部;第5類即鳳凰單樅蜜蘭香明顯聚集在坐標(biāo)圖的左側(cè)上部;第1類即鳳凰單樅黃枝香和第4類即鳳凰單樅芝蘭香明顯聚集在坐標(biāo)圖的右側(cè)下部，兩者質(zhì)心間有較大距離，有比較明顯的界線;第7類即鳳凰單樅鴨屎香、第2類即鳳凰單樅桂花香、第8類即鳳凰單樅姜花香、第6類即鳳凰單樅杏仁香樣品明顯聚集在坐標(biāo)圖的右側(cè)上和中部，四者質(zhì)心間距離較大，第7類即鳳凰單樅鴨屎香和第2類即鳳凰單樅桂花香之間有比較明顯的界線，第8類即鳳凰單樅姜花香和第6類即鳳凰單樅杏仁香之間也有比較明顯的界線，但第2類即鳳凰單樅桂花香和第8類即鳳凰單樅姜花香各有一個樣品重疊交叉，分類效果不很好。

8組共52個樣品分類結(jié)果顯示，樣本中的第1類即鳳凰單樅黃枝香中有4個樣品，沒有誤判;第2類即鳳凰單樅桂花香中有4個樣品，沒有誤判;第3類即鳳凰單樅玉蘭香樣品有3個樣品，沒有誤判;第4類即鳳凰單樅芝蘭香有8個樣品，沒有誤判;第5類即鳳凰單樅蜜蘭香有9個樣品，沒有誤判;第6類即鳳凰單樅杏仁香有5個樣品，沒有誤判;第7類即鳳凰單樅鴨屎香有14個樣品，沒有誤判;第8類即鳳凰單樅姜花香有5個樣品，沒有誤判。對已知香型的鳳凰單樅茶樣本總的正確分類率為100%。

茶葉提取物在給定試驗(yàn)條件下所得到的色譜指紋圖譜反映了該茶葉的化學(xué)組成及其含量分布狀況，嘗試?yán)闷涮卣鞣彖b別茶葉不同香型。根據(jù)相似度軟件進(jìn)行相似度分析，發(fā)現(xiàn)同一香型的鳳凰單樅茶指紋圖譜的相似度大于0.9，不同香型的鳳凰單樅茶的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行的相似度分析，相似度也都大于0.9，說明對于鳳凰單樅茶來說，所含有的化學(xué)成分相似，化學(xué)成分的含量也大致相似，無法通過相似度軟件直接區(qū)分不同香型的鳳凰單樅茶。但是香型是影響鳳凰單樅茶品質(zhì)的非常重要的因素。通過共有峰的識別，篩選出21個判別分析用共有特征峰，采用判別分析方法建立鳳凰單樅茶不同香型的鑒別模型。對不同香型的鳳凰單樅茶的分析結(jié)果表明，對于筆者所研究的黃枝香、桂花香、玉蘭香、芝蘭香、蜜蘭香、杏仁香、鴨屎香、姜花香，通過判別分析建立的鑒別模型鑒別準(zhǔn)確率為100%。

3 小結(jié)與討論

鴨屎香品種的鳳凰單樅茶香型一般認(rèn)為屬于杏仁香，該研究通過高效液相指紋圖譜結(jié)合模式識別技術(shù)，得出的結(jié)論是鴨屎香可以和杏仁香的鳳凰單樅茶進(jìn)行有效區(qū)分，這與楊環(huán)等[10]的研究結(jié)論是一致的。驗(yàn)證了基于化學(xué)指紋圖譜的鳳凰單樅茶以不同香型分級判別研究是可行的。

該研究利用指紋圖譜技術(shù)和化學(xué)計(jì)量法軟件對不同香型鳳凰單樅的茶葉進(jìn)行研究，獲得21個判別用共有特征峰，進(jìn)行判別分析，判別結(jié)果鑒別準(zhǔn)確率為100%，一定程度上反映了該鑒別方法的應(yīng)用前景，以改變?nèi)斯じ泄僭u審的方法，使茶葉審評客觀化、科學(xué)化和標(biāo)準(zhǔn)化。該研究雖然只針對鳳凰單樅茶進(jìn)行不同香型的分類與鑒定，但仍然可以作為鳳凰單樅茶其他品質(zhì)識別研究的參考。

對鳳凰單樅茶品質(zhì)特點(diǎn)的分析應(yīng)從多方面入手，綜合從感觀審評、生化成分以及分子水平上來分析各單樅茶的差異，才能比較全面地分析各單樅的品質(zhì)差異，為其生產(chǎn)加工提供理論指導(dǎo)[10]。但是對于茶葉貿(mào)易各方的品質(zhì)控制而言，簡單經(jīng)濟(jì)的鑒定方法更有實(shí)用價值。該研究的特點(diǎn)是僅從高效液相色譜指紋圖譜方面對鳳凰單樅代表樣茶進(jìn)行了香型的比較分析，避免了香型化學(xué)成分的提取和分析需要的復(fù)雜過程，分類效果良好。

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