巖藻黃質(zhì)對(duì)人紅白血病HEL細(xì)胞的凋亡作用及其機(jī)制

徐麗華 丁浩淼 金旭東 黃冠杰 夏彭奎 汪財(cái)生 王忠華

(浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100)

白血病是造血系統(tǒng)的一種惡性腫瘤疾病。21世紀(jì)以來，14歲以下兒童罹患白血病比例最高，白血病在兒童及36歲以下年輕人的死亡率中居首位[1]。白血病主要包括四種類型:急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓系白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病和慢性髓系敗血病，其發(fā)生與細(xì)胞的增殖失調(diào)、分化障礙、凋亡受阻密切相關(guān)，目前主要治療手段有放療、化療、介入等，但治療效果十分有限，且會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生巨大的副作用[2-3]。因此，近年來從海洋資源中尋找安全、高效的天然抗腫瘤物質(zhì)受到許多國(guó)家和學(xué)者的重視。研究表明，天然提取物具有抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，且副作用小，具備作為藥物用于預(yù)防癌癥的潛力[4]，其可以為白血病患者提供潛在的替代治療。

巖藻黃質(zhì)(fucoxanthin)又稱巖藻黃素，屬于類胡蘿卜素中的葉黃素，廣泛存在于各種藻類、海洋浮游植物、水生貝殼類等動(dòng)植物中。巖藻黃質(zhì)具有共軛雙鍵，且含有丙二烯和環(huán)氧烷結(jié)構(gòu)，具有抗肥胖活性、抗腫瘤活性、調(diào)節(jié)血糖等多種生理功效[5-7]，近年來受到人們的廣泛關(guān)注。多項(xiàng)研究表明，巖藻黃質(zhì)能明顯抑制白血病細(xì)胞的增值并誘導(dǎo)其凋亡，如Konishi 等[8]從海鞘中提取出巖藻黃質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其呈劑量和時(shí)間依賴性抑制人白血病HL-60 細(xì)胞生長(zhǎng)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)巖藻黃質(zhì)還能誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞和人結(jié)腸癌Caco-2 細(xì)胞凋亡；Kim 等[9]研究發(fā)現(xiàn)來源于鐵釘菜中巖藻黃質(zhì)通過ROS 介導(dǎo)的Bcl-xL 途徑誘導(dǎo)人白血病HL-60 細(xì)胞的凋亡。人紅白血病屬于白血病的一種，前期一般轉(zhuǎn)變是紅白血病轉(zhuǎn)急性白血病，有關(guān)巖藻黃質(zhì)誘導(dǎo)人紅白血病細(xì)胞凋亡的研究鮮見報(bào)道。因此，本研究以人紅白血病細(xì)胞株HEL細(xì)胞為研究對(duì)象，初步探討巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用的分子機(jī)制，旨在為巖藻黃質(zhì)應(yīng)用于白血病的治療提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及試劑

細(xì)胞株:HEL細(xì)胞，由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。巖藻黃質(zhì)(貨號(hào):F6932，HPLC ≥95%)，美國(guó)Sigma 公司；RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清，美國(guó)Gibco公司；青鏈霉素混合液(100×)、二甲基亞砜、MTT，北京索萊寶公司；25 cm2培養(yǎng)瓶、96 孔板、12 孔板、6 孔板，美國(guó)Corning 公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)，美國(guó)BD 公司；TRIzol、RT-PCR 相關(guān)試劑，日本TaKaRa 公司；兔anti-Bax 單克隆抗體、兔anti-Bcl-2單克隆抗體、兔anti-Bcl-xL 單克隆抗體、兔anti-Caspase-3 單克隆抗體、兔anti-GAPDH 單克隆抗體、HRP 標(biāo)記羊抗兔抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology公司；全蛋白提取試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠配置試劑盒、聚氰基丙烯醇正丁酯(polybutylcyanoacrylate，BCA)蛋白定量試劑盒，杭州聯(lián)科生物公司；Western blot 化學(xué)發(fā)光液，北京全式金公司；PVDF 膜，美國(guó)Millipore 公司。其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Series ⅡWater Jacket 恒溫CO2培養(yǎng)箱、Nano Drop 2000 分光光度計(jì)、Heraguard ECO 超凈工作臺(tái)、5417R 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo 公司；TI-DH 熒光倒置顯微鏡，日本Nikon 公司；CFX96Touch 熒光定量PCR 系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司；FACSVerse 流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD 公司；SpectraMax190 連續(xù)波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)MD 公司；Clinx 凝膠成像儀，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；Mini 4K 渦旋振蕩儀，上海生工生物工程有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HEL細(xì)胞株復(fù)蘇后在37℃、5% CO2條件下，用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基對(duì)HEL細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 MTT 法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以5×104個(gè)·mL-1接種于96 孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后給藥處理，每孔加藥10 μL，每個(gè)濃度平行5個(gè)復(fù)孔。其中，空白組加入等量RPMI1640培養(yǎng)基及MTT溶液，對(duì)照組加入含細(xì)胞的培養(yǎng)基及MTT溶液，試驗(yàn)組分別加入巖藻黃質(zhì)，使其終濃度為10、20、30 μg·mL-1，藥物作用24 h 后，每孔中加入10 μL 5 mg·mL-1MTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h，然后500×g離心15 min，吸取上清液加入100 μL 二甲基亞砜，置于搖床上低速避光震蕩15 min，使晶體充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm 處OD值[10-11]，按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率:

細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%

式中，As為試驗(yàn)孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、MTT、巖藻黃質(zhì))OD值；Ac為對(duì)照孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、MTT、沒有巖藻黃質(zhì))OD值；Ab為空白孔(不含有細(xì)胞和巖藻黃質(zhì)、含有MTT)OD值。

1.5 Hoechst 法檢測(cè)HEL細(xì)胞凋亡形態(tài)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以5×104個(gè)·mL-1接種于12 孔板中，每孔加入1 mL細(xì)胞懸液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后給藥處理，每孔加入100 μL 巖藻黃質(zhì)，使其終濃度分別為10、20、30 μg·mL-1，對(duì)照組加入100 μL 1640 培養(yǎng)基，藥物作用24 h 后，500×g離心10 min，用4℃磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)清洗2次，小心吸出上清液，加入0.5 mL 固定液固定10 min，然后加入0.5 mL Hoechst 33258 染色液孵育5 min，500×g離心5 min，去除染色液后再用PBS 清洗2次，置于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)并拍照。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HEL細(xì)胞的早期、晚期凋亡率

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以5×104個(gè)·mL-1接種于12 孔板中，每孔加入1 mL細(xì)胞懸液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后給藥處理，每孔加入100 μL 巖藻黃質(zhì)，使其終濃度分別為10、20、30 μg·mL-1，對(duì)照組加入100 μL 1640 培養(yǎng)基，藥物作用24 h 后，500×g離心10 min，用預(yù)冷的PBS 清洗2次，小心吸出上清液，用100 μL 雙染孵育液將細(xì)胞重懸，然后向重懸液中先加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 染液，再加入5 μL PI 染液，置于搖床上室溫低速避光染色15 min[12-13]。檢測(cè)前加入400 μL 雙染孵育液混勻后檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，統(tǒng)計(jì)早期凋亡、晚期凋亡的細(xì)胞比例。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HEL細(xì)胞的周期分布

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以5×104個(gè)·mL-1接種于6 孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液2 mL，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后給藥處理，每孔加入200 μL 巖藻黃質(zhì)，使其終濃度分別為10、20、30 μg·mL-1，對(duì)照組加入100 μL 1640 培養(yǎng)基，藥物作用24 h 后，500×g離心10 min，PBS 洗滌2次，然后加入5 mL 70%乙醇于-20℃固定18 h 以上，再于500×g離心10 min 得到固定后的細(xì)胞沉淀，用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞2次，最后加入0.5 mL RNaseA/PI 染料，在室溫放置20 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)個(gè)組細(xì)胞周期分布情況[14-15]。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HEL細(xì)胞線粒體膜電位

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以5×104個(gè)·mL-1接種于12 孔板中，每孔加入1 mL細(xì)胞懸液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后給藥處理，每孔加入100 μL 巖藻黃質(zhì)，使其終濃度分別為10、20、30 μg·mL-1，對(duì)照組加入100 μL 1640 培養(yǎng)基藥物作用24 h 后，于500×g離心10 min，然后向每管分別加入0.5 mL 新鮮制備的JC-1 工作液，重懸后放入37℃CO2培養(yǎng)箱中靜置15 min，再于500×g離心10 min，吸取上清液后加入2 mL緩沖液重懸再次離心，重復(fù)1次，最后加入0.5 mL 緩沖液于細(xì)胞沉淀，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞線粒體膜電位變化情況[16-18]。

1.9 RT-qPCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以5×104個(gè)·mL-1接種于6 孔板中，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后給藥處理，每孔加入200 μL 巖藻黃質(zhì)，使其終濃度分別為10、20、30 μg·mL-1，對(duì)照組加入200 μL 1640 培養(yǎng)基，藥物作用24 h 后，500×g離心10 min 得到細(xì)胞沉淀[19]。利用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)提取的RNA 量，用25 μL DEPC 水溶解，用NanoDrop 測(cè)定RNA 濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(日本TaKaRa 公司)進(jìn)行cDNA合成。反轉(zhuǎn)錄體系:PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time) 4.0 μL、Rnase Free dH2O 4.0 μL，于37℃反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 s[20]。PCR 反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性30 s；95℃5 s，60℃ 30 s，72℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。RTqPCR 所用擴(kuò)增引物序列如表1所示。

表1 用于RT-qPCR 分析的引物序列Table1 The primer sequences of RT-qPCR

1.10 Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以5×104個(gè)·mL-1接種于6 孔板中，每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后給藥處理，每孔加入巖藻黃質(zhì)200 μL，使其終濃度分別為10、20、30 μg·mL-1，對(duì)照組加入200 μL 1640 培養(yǎng)基，藥物作用24 h 后，500×g離心10 min 得到細(xì)胞沉淀。每管細(xì)胞加入150 μL RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，隨后12 000 r·min-1離心30 min，保留上清液，并采用Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。在12%聚丙烯酰胺凝膠上分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(poly vinylidene fluoride，PVDF)膜上，隨后用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，用1∶1 000 比例稀釋的一抗于4℃條件孵育12 h，次日用TBST 洗滌PVDF膜，用抗兔的二抗于室溫孵育PVDF 膜2 h，接著用TBST 洗凈抗體，加入發(fā)光液1 min 后用成像儀曝光顯影并觀察[21-23]。

1.11 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 14.0 軟件中的ANOVA 模塊對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，各組試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞存活率的影響

由圖1可知，不同濃度的巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞生長(zhǎng)均有抑制作用，當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度為10 μg·mL-1時(shí)，HEL細(xì)胞的存活率為78.12%，當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度為20 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率下降至60.18%；隨著巖藻黃質(zhì)濃度的增加，HEL細(xì)胞的存活率不斷下降，呈劑量依賴性，當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度為30 μg·mL-1時(shí)，HEL細(xì)胞的存活率急劇下降為20.82%，各處理之間差異極顯著。經(jīng)計(jì)算巖藻黃質(zhì)處理HEL細(xì)胞24 h 所對(duì)應(yīng)的半抑制濃度(50% inhibiting concentration，IC50)為22.78 μg·mL-1。

圖1 巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of fucoxanthin on the proliferation of HEL cells

圖2 巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響Fig.2 Effect of fucoxanthin on apoptosis morphology of HEL cells

2.2 巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞形態(tài)的影響

Hoechst 染色觀察巖藻黃質(zhì)誘導(dǎo)的HEL細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)果顯示，對(duì)照組的細(xì)胞核界限清晰，呈圓形或橢圓形，有均勻熒光，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞膜完整(圖2-A)；隨著巖藻黃質(zhì)濃度升高，HEL細(xì)胞染色質(zhì)分布不均勻，部分細(xì)胞的細(xì)胞核縮小，染色質(zhì)凝集，呈顆粒團(tuán)狀分布，有的細(xì)胞中形成多個(gè)球形顆粒，同時(shí)可見已破碎的核等凋亡特征，且凋亡細(xì)胞比例隨著巖藻黃質(zhì)濃度的增加而增多，當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度為30 μg·mL-1時(shí)，HEL細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖2-B、C、D)。

2.3 巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞早期和晚期凋亡的影響

由圖3可知，對(duì)照組HEL細(xì)胞凋亡率為7.39%，當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度為10 μg·mL-1時(shí)，HEL細(xì)胞的凋亡率為12.28%(早期凋亡為2.96%，晚期凋亡為6.04%)；當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度為20 μg·mL-1時(shí)，HEL細(xì)胞的凋亡率為48.67% (早期凋亡為24.79%，晚期凋亡為23.88%)；隨著巖藻黃質(zhì)濃度的增加，HEL細(xì)胞的凋亡率不斷增大，當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度為30 μg·mL-1時(shí)，HEL細(xì)胞的凋亡率急劇增加至84.58% (早期凋亡為16.74%，晚期凋亡為67.84%)。巖藻黃質(zhì)能明顯增加細(xì)胞的早期和晚期凋亡比例，表明巖藻黃質(zhì)促進(jìn)了HEL細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步證實(shí)了MTT 法測(cè)定細(xì)胞增殖的抑制結(jié)果。

2.4 巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞周期分布的影響

為探究巖藻黃質(zhì)如何影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，利用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)周期分布情況，結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照組相比，隨著巖藻黃質(zhì)濃度的增加，G0/G1期的HEL細(xì)胞比例顯著增加，S期和G2/M期的HEL細(xì)胞比例顯著減少，當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度為30 μg·mL-1時(shí)，G2/M期的HEL細(xì)胞比例為0，S期的HEL細(xì)胞比例為38.26%，說明巖藻黃質(zhì)使細(xì)胞阻滯在G0/G1期，這可能是其抑制細(xì)胞增長(zhǎng)和細(xì)胞分裂的重要原因。

2.5 巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞的線粒體膜電位的影響

由圖5-A可知，在對(duì)照組的細(xì)胞群中的FITC和PE 通道均能觀察到JC-1 熒光，95.30% HEL細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，3.54% HEL細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。由圖5-B～D可知，隨著巖藻黃質(zhì)濃度的增加，呈紅色熒光的細(xì)胞數(shù)量逐漸降低，呈綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，表明巖藻黃質(zhì)可誘導(dǎo)HEL細(xì)胞線粒體膜電位降低。

圖3 巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of fucoxanthin on apoptosis of HEL cells

2.6 巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響

由圖6可知，巖藻黃質(zhì)處理引起促凋亡基因Bax和Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量顯著或極顯著升高，抑凋亡基因Bcl-2和Bcl-xL的相對(duì)表達(dá)量則出現(xiàn)明顯下調(diào)。由圖7可知，Bcl-2/Bax的比值也隨著巖藻黃質(zhì)濃度的增加不斷減小，細(xì)胞不斷發(fā)生凋亡，這與流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果一致。

2.7 巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

利用Western blot 法同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白的表達(dá)。由圖8、圖9可知，巖藻黃質(zhì)處理HEL細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Bax、Caspase-3 蛋白水平極顯著上調(diào)(P＜0.01)，Bcl-xL、Bcl-2 蛋白水平下調(diào)，但Bcl-xL 蛋白的表達(dá)未發(fā)生明顯變化(P＞0.05)。以上結(jié)果表明，巖藻黃質(zhì)通過上調(diào)促凋亡基因和蛋白的表達(dá)，下調(diào)抑凋亡基因和蛋白的表達(dá)，最終引起了HEL細(xì)胞的凋亡。

3 討論

圖4 巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞周期的影響Fig.4 Effect of fucoxanthin on HEL cell cycle

天然產(chǎn)物長(zhǎng)期以來被廣泛用于治療癌癥，是抗癌藥物的重要來源，在預(yù)防和治療腫瘤中的重要性日益明顯。巖藻黃質(zhì)已成為潛在的抗癌藥物，在各種細(xì)胞系中表現(xiàn)出良好的抗癌活性，研究報(bào)道巖藻黃質(zhì)能誘導(dǎo)HL-60、MCF-7和Caco-2 細(xì)胞凋亡[4]。本試驗(yàn)以體外培養(yǎng)的人紅白血病HEL細(xì)胞為對(duì)象，發(fā)現(xiàn)巖藻黃質(zhì)能誘導(dǎo)人紅白血病HEL細(xì)胞凋亡。不同濃度的巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，隨著巖藻黃質(zhì)濃度的增加，HEL細(xì)胞的存活率不斷下降，且染色質(zhì)固縮細(xì)胞數(shù)目明顯增多，呈劑量依賴性，高濃度巖藻黃質(zhì)作用下HEL細(xì)胞數(shù)目也明顯減少。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，而細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)會(huì)有一系列的形態(tài)學(xué)特征改變，其中質(zhì)膜的改變是早期凋亡的特征之一。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，胞膜磷脂酰絲氨酸從胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，暴露于細(xì)胞外表面。AnnexinⅤ是一個(gè)Ca2+依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，它與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，可以結(jié)合細(xì)胞外暴露的磷脂酰絲氨酸[24]。PI 不能滲透具有完整細(xì)胞膜的活細(xì)胞，但可以滲透凋亡細(xì)胞和受損細(xì)胞的細(xì)胞膜。因此，PI 可以滲透細(xì)胞膜，將處于細(xì)胞凋亡中期或晚期的細(xì)胞染色。為了進(jìn)一步確定巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL活力影響是否與凋亡誘導(dǎo)相關(guān)，本研究使用Annexin Ⅴ/PI 標(biāo)記細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡細(xì)胞的百分比，結(jié)果表明，隨著巖藻黃質(zhì)濃度的增加，HEL細(xì)胞的凋亡率不斷增加，當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度為30 μg·mL-1時(shí)，HEL細(xì)胞的凋亡率急劇增高，表明巖藻黃質(zhì)能增加細(xì)胞的早期和晚期凋亡比例。Tumura 等[25]研究表明，巖藻黃質(zhì)可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，25 μmol·L-1巖藻黃質(zhì)處理結(jié)腸癌細(xì)胞48 h，早凋細(xì)胞和晚凋細(xì)胞比例分別為13%和52%，與本研究結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著巖藻黃質(zhì)濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞呈劑量依賴性增加，S期和G2/M期的細(xì)胞呈劑量依賴性減少，說明巖藻黃質(zhì)導(dǎo)致HEL細(xì)胞不能復(fù)制受損的DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期周期阻滯。Foo 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，從角毛藻中提取的巖藻黃質(zhì)能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，作用72 h 后，G0/G1期細(xì)胞比例為47.04%，低于本試驗(yàn)G0/G1期的細(xì)胞比例，這可能與提取的巖藻黃質(zhì)純度有關(guān)。線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件，JC-1是一種檢測(cè)線粒體膜電位的理想熒光探針[28]。本研究中，隨著巖藻黃質(zhì)濃度的增加，線粒體膜電位不斷下降，與對(duì)照組相比，當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度為30 μg·mL-1時(shí)，線粒體膜電位下降了50.3個(gè)百分點(diǎn)。Liu 等[29]也發(fā)現(xiàn)巖藻黃質(zhì)可以誘導(dǎo)人惡性膠質(zhì)瘤的凋亡，當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度為50 μmol·L-1時(shí)，線粒體膜電位顯著下降。Garg 等[30]研究發(fā)現(xiàn)巖藻黃質(zhì)具有很強(qiáng)的抗癌活性，對(duì)照組和處理組的細(xì)胞表型驅(qū)動(dòng)的分子對(duì)接表明，1 μmol·L-1巖藻黃質(zhì)可導(dǎo)致與細(xì)胞增殖、存活和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的標(biāo)志性蛋白減少，巖藻黃質(zhì)處理HEL細(xì)胞24 h 所對(duì)應(yīng)的IC50為0.03 μmol·L-1，表明其對(duì)HEL細(xì)胞抑制效果高于對(duì)MCF-7、A549和SKOV3腫瘤細(xì)胞的抑制效果。

圖5 巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.5 Effect of fucoxanthin on mitochondrial membrane potential of HEL cells

細(xì)胞凋亡是一種嚴(yán)格受控的細(xì)胞死亡模式，以核固縮、細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜起泡和DNA片段化為特征。凋亡的核心調(diào)控分子是Caspase，這是一個(gè)半胱氨酸蛋白酶家族，分為兩類:與上游促凋亡信號(hào)緊密聯(lián)系的“啟動(dòng)型”和通過剪切、活化激活下的“執(zhí)行型”，從而引起最終負(fù)責(zé)程序性細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)發(fā)生變化。內(nèi)源性和外源性途徑可以激活Caspase，內(nèi)源性途徑主要受到Bcl-2 蛋白家族調(diào)控因子的影響[31]?？沟蛲龅鞍譈cl-2和Bcl-xL 駐留在線粒體外膜中，促凋亡蛋白Bax 可駐留在細(xì)胞質(zhì)中，在接受死亡信號(hào)后易位到線粒體中。本研究中，巖藻黃質(zhì)作用HEL細(xì)胞24 h 后，抗凋亡Bcl-2 基因及蛋白表達(dá)量降低，促凋亡Bax基因及蛋白表達(dá)量上升，與Bcl-xL 形成促凋亡復(fù)合體，釋放細(xì)胞色素C，導(dǎo)致促凋亡Caspase-3 基因和蛋白的激活，促凋亡Caspase-3 總蛋白表達(dá)量增高，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖6 巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響Fig.6 Effect of fucoxanthin on the expression of apoptosis-related genes in HEL cells

圖7 巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞凋亡基因Bcl-2/Bax的影響Fig.7 Effect of fucoxanthin on Bcl-2/Bax of apoptosis genes in HEL cells

圖8 巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.8 Effect of fucoxanthin on the expression of apoptosis-related proteins of HEL cells

圖9 Caspase-3，Bax，Bcl-2和Bcl-xL蛋白的表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析Fig.9 Statistical analysis of Caspase-3，Bax，Bcl-2 and Bcl-xL proteins

4 結(jié)論

巖藻黃質(zhì)作用于人紅白血病HEL細(xì)胞后，降低了細(xì)胞活力，增加了細(xì)胞凋亡率，將細(xì)胞阻滯于G0/G1期，開放線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換通道，降低了線粒體膜電位，通過上調(diào)促凋亡基因、蛋白的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡基因、蛋白的表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果證實(shí)天然生物活性物質(zhì)巖藻黃質(zhì)對(duì)HEL細(xì)胞的體外生長(zhǎng)具有抑制作用，為將巖藻黃質(zhì)開發(fā)為保健食品及特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品提供了理論依據(jù)。