電針“委中”穴對腰多裂肌損傷大鼠MC、HGF及相關(guān)因子影響*

李欣怡，許 玥，魯 曼，張佳怡，陳 潔，陳 莉，徐 菁，白玉琢，陳玉佩，張 莉△，劉 通

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2.中國中醫(yī)藥出版社，北京 100027；3.北京市昌平區(qū)南口醫(yī)院，北京 102202； 4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510095)

多裂肌是脊柱最內(nèi)側(cè)的椎旁肌,對抗脊柱過度旋轉(zhuǎn)及滑動，維持脊柱穩(wěn)定性影響腰痛。多裂肌損傷后局部微環(huán)境發(fā)生一系列變化，間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchyal Stem Cells,MSCs)可通過肌源性分化外機(jī)制——旁分泌作用促進(jìn)骨骼肌再生修復(fù)。肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)是MSCs旁分泌因子之一，作用于組織修復(fù)與再生。肥大細(xì)胞(Mast cell，MC)廣泛分布于機(jī)體各個部位，受組織微環(huán)境影響終止分化，參與調(diào)節(jié)天然及適應(yīng)性免疫反應(yīng)[1]。然旁分泌因子HGF與MC的關(guān)系尚不明確。本研究擬復(fù)制大鼠多裂肌損傷模型，甲苯胺藍(lán)法染色觀察多裂肌周圍肥大細(xì)胞變化，ELISA法檢測多裂肌HGF及相關(guān)蛋白HGFA、c-Met受體的表達(dá)情況。從而觀察造模后干預(yù)手段電針對損傷的多裂肌修復(fù)的影響，研究旁分泌HGF在多裂肌損傷修復(fù)過程中的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠56只，體質(zhì)量(300±20)g，由北京維通利華實驗動物中心提供，許可證號SCXK(京)2016-0006。隨機(jī)分籠飼養(yǎng)，自由飲食水，明暗周期12 h，環(huán)境溫度24 ℃，濕度40%～50%，于動物房適應(yīng)10 d飼養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 布比卡因鹽酸鹽(美國Sigma公司，80-477-DK);10%水合氯醛(北京歐北生物科技有限公司，780379);4%多聚甲醛溶液(北京雷根生物技術(shù)有限公司，90090525);甲苯胺藍(lán)染色液(北京索萊寶科技有限公司，201900520)；大鼠肝細(xì)胞生長因子HGF酶聯(lián)免疫試劑盒96T(上海酶聯(lián)生物科技有限公司);大鼠肝細(xì)胞生長因子激活物HGFA酶聯(lián)免疫試劑盒96T(上海酶聯(lián)生物科技有限公司);大鼠原癌基因c-Met蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒96T(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，m1362210)。

1.2.2 主要儀器 半自動化石蠟切片機(jī)(德國萊卡儀器有限公司，RM2245);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司);全自動組織脫水機(jī)(德國徠卡儀器有限公司，ASP300S);正置智能型顯微鏡及采集系統(tǒng)(奧林巴斯中國有限公司，BX53);韓式電針儀(北京思盛達(dá)醫(yī)療器械中心，HANS200A);標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司，Multiskan MK3)；自動洗板機(jī)(北京拓普分析儀器有限公司，DEM-3)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司，SKP-02.600)；離心機(jī)(美國sigma公司，3K18)。

1.3 分組與模型制備

56只大鼠采用完全隨機(jī)法將其分空白組、模型組、電針組。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，背部備皮后選擇L4～5水平脊柱雙側(cè)4點，使用一次性注射器緊貼脊柱進(jìn)針，針達(dá)骨面回抽無血即注射，每點注射0.5%的布比卡因溶液100 μL，共400 μL，旋轉(zhuǎn)針頭拔出，操作過程保持無菌,模型制作完成。

1.4 干預(yù)方法

各電針組造模24 h后開始干預(yù)，將大鼠固定在操作臺上，暴露背部和后肢，參照大鼠解剖圖[2]和最新國家標(biāo)準(zhǔn)穴位圖[3]，于大鼠膝關(guān)節(jié)背面正中取雙側(cè)干預(yù)。針刺前75%乙醇消毒，選用0.25 mm×13 mm華佗牌一次性針灸針垂直刺入委中穴表面皮膚約5 mm，針刺后連接韓式電針儀HANS-200A，2/100 Hz的疏密波，電流強(qiáng)度1 mA，持續(xù)干預(yù)20 min，1次/d。模型組與電針組同步抓取、固定，模型組不做其他處理。空白組不做任何干預(yù)。3組分別治療后1 d、3 d和7 d同步取材(每時間點各6只)。腹腔麻醉選用10%水合氯醛(350 mg/kg)。大鼠深度麻醉后固定，充分暴露背部。剪開大鼠背部皮膚，以組織剪、鑷子剝離腰部筋膜，于 L4～5兩側(cè)取下大鼠的腰部多裂肌，左側(cè)置于-80 ℃冰箱保存，右側(cè)置4%多聚甲醛溶液用于固定。

1.5 檢測指標(biāo)與方法

1.5.1 甲苯胺藍(lán)染色 觀察腰多裂肌周圍肥大細(xì)胞變化：分別于L4～5水平脊柱右側(cè)取下大鼠腰部多裂肌(包含皮膚、皮下結(jié)締組織)經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，使組織脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，進(jìn)行組織切片的制作，切片厚度為4 pm，切片方向為皮膚和肌肉組織塊縱切面，隨后將各部分進(jìn)行脫蠟、脫氫和染色，采用0.5%甲苯胺藍(lán)染色30 min，自來水沖洗，二甲苯透明，中性樹膠封固。將甲苯胺藍(lán)染色的切片置于自動化智能型正置研究級顯微鏡上進(jìn)行圖像拍攝，拍攝倍數(shù)為400倍。

1.5.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 采用雙抗體夾心ELISA方法檢測HGF、HGFA和c-Met含量，參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腰多裂肌周圍縱切面組織肥大細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

MC甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果示,3組鏡下可見MC，呈圓形、橢卵圓形或不規(guī)則形，核小而圓，染色較深，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)富含嗜堿性紫色顆粒，部分切片可觀察到脫出于細(xì)胞質(zhì)外的嗜堿性顆粒。3組中多裂肌MC細(xì)胞數(shù)量比多裂肌周圍組織少。多裂肌周圍組織切片中，模型組MC數(shù)及脫顆粒較其他兩組明顯。見圖1～3。

圖1 治療1 d后大鼠腰多裂肌及皮下組織MC染色(甲苯胺藍(lán)染色,400×)

圖2 治療3 d后大鼠腰多裂肌及皮下組織MC染色(甲苯胺藍(lán)染色,400×)

圖3 治療7 d后大鼠腰多裂肌及皮下組織MC染色(甲苯胺藍(lán)染色,400×)

2.2 ELISA測量HGF、HGFA和c-Met表達(dá)

2.2.1 3組大鼠腰多裂肌HGF表達(dá)比較 治療后模型組、電針組多裂肌HGF表達(dá)與空白組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較治療1 d、電針組腰多裂肌HGF表達(dá)高于模型組(P<0.01),電針組3 d和7 d多裂肌HGF表達(dá)與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)后多裂肌中HGF比較

2.2.2 3組大鼠腰多裂肌HGFA表達(dá)比較 治療1 d后，模型組多裂肌HGFA表達(dá)高于空白組(P<0.01);電針組多裂肌HGFA 表達(dá)與空白組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);電針組多裂肌HGFA表達(dá)低于模型組(P<0.01)。治療3 d后， 模型組、電針組與空白組3組之間多裂肌HGFA表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療7 d后，模型組多裂肌HGFA表達(dá)低于空白組(P<0.05);電針組多裂肌HGFA表達(dá)高于空白組(P<0.01);電針組多裂肌HGFA表達(dá)高于模型組(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠干預(yù)后多裂肌中HGFA比較

2.2.3 3組大鼠腰多裂肌c-Met表達(dá)比較 治療1 d后，模型組多裂肌c-Met表達(dá)低于空白組(P<0.05);電針組多裂肌c-Met表達(dá)低于空白組(P<0.01);電針組多裂肌c-Met表達(dá)與模型組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療3 d后，模型組多裂肌c-Met表達(dá)與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；電針組多裂肌c-Met表達(dá)均高于空白組、模型組(P<0.01)。治療7 d后，模型組多裂肌c-Met表達(dá)低于空白組(P<0.05);電針組多裂肌c-Met表達(dá)低于空白組(P<0.05);電針組多裂肌c-Met表達(dá)與模型組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠干預(yù)后多裂肌中c-Met比較

3 討論

多裂肌與腰椎緊密連接,腰部深層多裂肌萎縮和功能失調(diào)影響脊柱穩(wěn)定性, 是慢性腰痛(chronic Low Back Pain, cLBP) 的發(fā)生、進(jìn)展及復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素[4]。研究發(fā)現(xiàn)慢性腰痛患者深層多裂肌表面肌電信號時頻異常[5],腰部多裂肌對L4～5節(jié)段穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)高達(dá)2/3。前期大量研究發(fā)現(xiàn)電針“委中”穴可促相關(guān)炎癥因子IL-10、生長因子VEGF、IGF、bFGF、Myod和自噬相關(guān)因子p-Akt、mTOR等表達(dá)[6-10]，進(jìn)而實現(xiàn)多裂肌再生修復(fù)。但電針“委中”穴的旁分泌效應(yīng)研究較少?！拔小毖ㄎ挥谧闾柊螂捉?jīng)循行上，具有疏經(jīng)活絡(luò)、涼血解毒的作用，電針通過控制干預(yù)條件，觀察“委中”穴遠(yuǎn)端腰部變化，闡釋針刺對腰痛治療的部分機(jī)理。故本研究電針“委中”穴干預(yù)損傷多裂肌大鼠模型，觀察多裂肌HGF旁分泌因子及相關(guān)細(xì)胞、因子的動態(tài)變化。

肥大細(xì)胞(MC)是組織損傷微環(huán)境的關(guān)鍵組成部分，從炎癥反應(yīng)到重塑細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)[11]，參與所有步驟的組織修復(fù)。其中干細(xì)胞旁分泌因子——肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)對于組織損傷后修復(fù)再生至關(guān)重要[12]。

針刺對細(xì)胞外環(huán)境的改變是針刺效應(yīng)產(chǎn)生的基礎(chǔ)。研究證明電針直接刺激神經(jīng)感受器啟動信號,肥大細(xì)胞伴隨脫顆粒[13]。肥大細(xì)胞(Mast cell，MC)廣泛分布于全身結(jié)締組織，尤以接受外來刺激較多部位的皮下、黏膜下等處居多[14]。吳美玲針刺大鼠“百會”“三陰交”“合谷”穴區(qū)，發(fā)現(xiàn)MC呈匯聚狀態(tài)分布并伴隨脫顆粒現(xiàn)象發(fā)生，脫出的物質(zhì)聚集在周圍且數(shù)量明顯增多[15]。研究發(fā)現(xiàn)局部病灶MC聚集與疾病的發(fā)生程度成正相關(guān)，針灸可影響循經(jīng)部位MC脫顆粒現(xiàn)象[16]。本研究通過電針”委中”穴觀察多裂肌及周圍組織肥大細(xì)胞變化,發(fā)現(xiàn)模型組肥大細(xì)胞及脫顆粒改變較其他兩組明顯，提示電針有抑制多裂肌損傷的可能。

HGF以無活性沉寂形式駐留在細(xì)胞外基質(zhì)[17]，通過對不同細(xì)胞類型施加旁分泌作用影響微環(huán)境，實現(xiàn)組織保護(hù)、修復(fù)和再生。張安寧等發(fā)現(xiàn)電針骨骼肌鈍挫傷大鼠健側(cè)“足三里”及患側(cè)阿是穴對應(yīng)的健側(cè)處，HGF蛋白表達(dá)量隨時間升高，認(rèn)為 HGF在電針干預(yù)骨骼肌損傷模型的早期已大量分泌[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，腰多裂肌損傷大鼠治療后1 d電針組HGF表達(dá)量高于模型組。電針組整體趨勢均高于模型組，肯定了電針干預(yù)腰部多裂肌損傷大鼠后，HGF對骨胳肌修復(fù)的作用，且干預(yù)早期效果顯著。

凝血因子XII樣絲氨酸蛋白酶——肝細(xì)胞生長因子激活劑(Hepatocyte growth factor activation，HGFA)以無活性的酶原存在,發(fā)生組織損傷修復(fù)時被凝血酶等蛋白激活, 與Matriptase可剪切單鏈形式的前體HGF(Pro-HGF),使其轉(zhuǎn)變成具有活性的異二聚體形式HGF，發(fā)揮HGF/c-Met信號通路活性[19-21]。本實驗結(jié)果顯示，模型早期腰多裂肌HGFA表達(dá)增多，7 d組出現(xiàn)較空白組表達(dá)減少，提示多裂肌損傷早期HGFA對環(huán)境反應(yīng)敏感故被激活。治療后1 d電針組HGFA表達(dá)低于模型組(P<0.01)，電針組3 d表達(dá)量較模型組增高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，電針組7 d腰多裂肌HGFA表達(dá)量高于模型組(P<0.01)。電針組與模型組比較早期HGFA表達(dá)量少，干預(yù)后3 d開始升高，提示電針干預(yù)后期HGFA發(fā)揮激活HGF的作用,隨時間激活作用越發(fā)顯著。

HGF與特異性受體c-Met結(jié)合而被激活，整合生長、存活和遷移，促進(jìn)組織重塑[22]。研究發(fā)現(xiàn)c-Met滿足闌尾發(fā)育中成肌祖細(xì)胞的遷移, 同時也影響胸骨舌骨肌和后椎后肌再生[23]。常紅梅等發(fā)現(xiàn)HGF變體NK4分子，由于其α鏈C末端丟失了16個氨基酸，導(dǎo)致NK4分子雖競爭性與c -Met結(jié)合，卻不能激活受體[24]。本研究結(jié)果顯示，治療后1 d、7 d模型組c-Met均低于空白組(P<0.05)，提示多裂肌損傷致正常肌細(xì)胞減少，隨之肌細(xì)胞表面受體通道減少，c-Met受體減少。治療后1 d、7 d電針組c-Met表達(dá)低于模型組，治療后3 d電針組高于模型組，提示電針干預(yù)后3 d肌衛(wèi)星細(xì)胞表面的受體通道開放增加，隨之肌衛(wèi)星細(xì)胞表面的c-Met增加；壞死時間延長，多裂肌組織再生，隨之肌衛(wèi)星細(xì)胞減少，部分受體通道開始閉合，c-Met減少[25]。

目前針刺治療腰痛效果得到一定認(rèn)可，針刺作用機(jī)制研究尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植促進(jìn)大鼠損傷模型骨骼肌再生，但細(xì)胞并未分化為骨骼肌纖維[26]。因此通過肌源性分化以外機(jī)制——旁分泌作用，促進(jìn)骨骼肌的再生得到重視。研究發(fā)現(xiàn)旁分泌活性多對心肌[27]、腎[28]、肝[29]和肺[30]的組織損傷具有治療作用，但作為骨骼肌的多裂肌損傷研究較少。本實驗旨在探求電針“委中”穴對于腰多裂肌損傷后修復(fù)的部分機(jī)制，觀察MC、HGF及相關(guān)因子表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針降低多裂肌周圍肥大細(xì)胞數(shù)及脫顆粒數(shù)，有抑制多裂肌損傷可能。肥大細(xì)胞脫顆粒使多裂肌周圍環(huán)境改變，旁分泌因子HGF及肥大細(xì)胞同存于細(xì)胞外基質(zhì)中，因而細(xì)胞外環(huán)境改變引起HGF被HGFA激活，后與c-Met受體結(jié)合，促進(jìn)多裂肌損傷修復(fù)。但HGF的旁分泌作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。本實驗開展為針刺作用機(jī)制研究提供思路。