新鮮瓜蔞不同部位總黃酮的含量測定

趙啟華 杜成興 潘年瓊 霍昕 楊迺嘉

摘 要：通過測定新鮮瓜蔞不同部位總黃酮的含量，測得其中總黃酮含量最高的部位，為瓜蔞的綜合開發(fā)利用提供參考依據(jù)。新鮮瓜蔞分離成不同部位后，經(jīng)過正交試驗方法篩選，得到最佳提取方法。運用最佳提取方法，以蘆丁為對照品，10%ALCl3為顯色劑，在279nm處，采用紫外分光光度法測定新鮮瓜蔞不同部位的總黃酮含量。結(jié)果顯示，最佳提取方法為：60%乙醇回流提取2次，每次2h。蘆丁在0.002012mg/mL～0.064384mg/mL之間呈良好的線性關(guān)系（Y=9.2611X+0.2822，R=0.9991），回收率在95%～105%之間，RSD小于2.0%。新鮮瓜蔞不同部位總黃酮含量從高到低為：新鮮瓜蔞汁﹥新鮮瓜蔞皮﹥新鮮瓜蔞子﹥新鮮瓜蔞瓤，新鮮瓜蔞汁中總黃酮含量最高。

關(guān)鍵詞：瓜蔞;總黃酮;含量測定;紫外分光光度法

中圖分類號：R24 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2020）12-0118-04

瓜蔞屬于多年生攀緣型草本植物，來源于葫蘆科植物栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxim）或雙邊栝樓（Trich-osanthes rosthornii Harms）的干燥且成熟的帶果梗全果[1]。從瓜蔞的來源來看，栝樓屬為葫蘆科中一個比較大的屬，全球共有80來種[2]。瓜蔞主要分布地區(qū)有安徽、山東、河南和河北等，已引種到全國各地，主要集中在貴州和福建、四川等地?，F(xiàn)代研究表明，瓜蔞的化學(xué)成分包括油脂及有機酸脂類成分、氨基酸及核苷酸類成分、三萜類成分、甾醇類及其衍生物、生物堿和含氮衍生物、多糖類成分、醛類成分、醇類成分、黃酮及其苷類衍生物、苯丙素類、蛋白質(zhì)及多肽類成分，還有少量的其他成分比如微量元素等[3-13]。瓜蔞及其制劑常用于治療心血管疾病，臨床上還能夠治療吐痰黃稠和消渴等病癥，可提高人體的免疫力，也有抗菌抗氧化、抗腫瘤作用[14-19]。天然黃酮類化合物具有調(diào)節(jié)骨代謝、預(yù)防骨質(zhì)疏松、抗氧化和抗炎等多種作用[20-25]。另外，它可擴張冠狀動脈，提高抗缺氧能力，還能抑制血小板聚集。本實驗以蘆丁為對照品，10%ALCL3為顯色劑，在279nm波長處測定新鮮瓜蔞不同部位總黃酮的含量，擬定總黃酮含量順序，為瓜蔞種質(zhì)資源的進一步開發(fā)和綜合利用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀器

TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），LIBRORAEL-160型萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），TG332A型十萬分之一分析天平（日本島津）。其他試驗儀器均由貴州省科暉制藥廠企業(yè)技術(shù)中心提供。

1.2 材料

蘆丁對照品（批號：100080-200306，中國藥品生物制品檢定所），瓜蔞藥材采購于貴州省息烽縣并經(jīng)貴州大學(xué)關(guān)萍教授鑒定為葫蘆科植物雙邊栝樓（Trichosanthes rosthornii Harms）的新鮮成熟果實。水為蒸餾水，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 新鮮瓜蔞的分離

選取新鮮瓜蔞6個，分離篩選后得到瓜蔞的不同部位，包括瓜蔞皮、瓜蔞瓤、瓜蔞汁和瓜蔞子，分別稱重，記錄數(shù)據(jù)，見表1。

2.2 單因素篩選

2.2.1 提取方法的選擇

選取新鮮瓜蔞皮為參照，精密稱取新鮮瓜蔞皮3份，每份1.0g，分別加入100mL 70%乙醇溶液，分別用超聲提取、回流提取和索式提取的方法提取1h，過濾，精密量取2mL濾液加入到25mL容量瓶中，用70%乙醇溶液定容至刻度，加入10%ALCl3溶液1mL，搖勻后靜置15min，使用紫外分光光度計法在279nm波長處測定吸光度，考察提取方法對總黃酮收率的影響，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明三種提取方法下的總黃酮收率有差異，其中回流提取的總黃酮收率最高，應(yīng)進行方法選擇。

2.2.2 乙醇濃度的選擇

精密稱取新鮮瓜蔞皮3份，每份1.0g，分別加入50%、60%、70%的乙醇溶液100mL，加熱回流提取1h，精密量取2mL樣品溶液加入到25mL容量瓶中，分別加對應(yīng)的乙醇溶液定容至刻度，加入10%ALCl3溶液1mL，搖勻后靜置15min，使用紫外分光光度計法在279nm波長處測定吸光度，考察乙醇濃度對總黃酮收率的影響，結(jié)果見表3。

結(jié)果表明用不同醇度的乙醇提取瓜蔞皮時總黃酮收率有差異，其中60%乙醇提取的總黃酮收率最高，應(yīng)進行乙醇濃度的選擇。

2.2.3 提取時間的選擇

精密稱取新鮮瓜蔞皮3份，每份1.0g，加入60%乙醇100mL，分別回流1h，1.5h，2h，2.5h，3h，精密量取2mL樣品溶液于25mL容量瓶中，用70%乙醇溶液定容至刻度，加入10%ALCl3溶液1mL，搖勻后靜置15min，使用紫外分光光度計法在279nm波長處測定吸光度，考察提取時間對總黃酮收率的影響，結(jié)果見表4。

結(jié)果表明當(dāng)提取時間為2h后，瓜蔞皮總黃酮收率不再有明顯提高，反而略有降低，應(yīng)進行提取時間的選擇。

2.3 正交試驗設(shè)計

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，確定工藝的考察因素為乙醇濃度（因素A）、提取方法（因素B）和提取時間（因素C）以及提取次數(shù)（因素D），以新鮮瓜蔞皮總黃酮收率為考慮指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗設(shè)計表，具體因素水平見表5。

新鮮瓜蔞皮總黃酮提取工藝正交試驗結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。由結(jié)果可知，各因素對提取效果的影響程度依次為A>B>C>D，A因素（提取方法）、B因素（乙醇濃度）和C因素（提取時間）均具有統(tǒng)計學(xué)意義。在本實驗考察范圍內(nèi)，新鮮瓜蔞皮總黃酮提取工藝的最優(yōu)組合為A2B2C2D2，故新鮮瓜蔞皮總黃酮的最佳提取方法為：用60%乙醇回流提取2次，每次2h。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 對照品溶液的制備

稱取在105℃干燥至恒重的蘆丁對照品10.06mg置于100mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，超聲5min，搖勻。精密量取上述溶液2mL置于25mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液（蘆丁濃度為0.008048mg/mL）。

2.4.2 供試品的制備

精密稱取新鮮瓜蔞皮1.0g，加入60%乙醇100mL回流提取2次，每次2h，精密量取濾液2mL置于25mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.4.3 測定波長的確定

取對照品溶液和樣品溶液5mL，加入10%ALCl3溶液1mL，搖勻后靜置15min。在200nm～600nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，結(jié)果在279nm處均出現(xiàn)最大吸收峰，故選擇測定波長為279nm。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取蘆丁對照品溶液（0.008048mg/mL）0.5mL，1mL，1.5mL，2mL，2.5mL和3mL置于25mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，加入10%ALCl3溶液1mL，搖勻后靜置15min。以60%乙醇溶液為空白，在波長279nm處測定吸光度，以吸光度A為橫坐標(biāo)，蘆丁濃度C為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得曲線回歸方程：Y=9.2611X+0.2822，R=0.9991，蘆丁在0.002012mg/mL～0.064384mg/mL之間呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗

精密量取同一份對照品溶液5mL，加入10%ALCl3溶液1mL，搖勻后靜置15min，在279nm波長處測定吸光度，連續(xù)測定6次，計算RSD，結(jié)果見表8。

試驗結(jié)果表明RSD為0.75%，說明紫外分光光度計的精密度較好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗

精密量取供試品溶液5mL，加入10%ALCl3溶液1mL，搖勻后靜置15min，在279nm波長處每隔1h測定一次吸光度，計算RSD值，結(jié)果見表9。

結(jié)果表明在1h內(nèi)，其Abs值較為穩(wěn)定，RSD為0.73 %，說明供試品在6h內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

2.4.7 重復(fù)性試驗

精密稱取新鮮瓜蔞皮1g，共記6份，按2.4.2項下方法處理后，加入10%ALCl3溶液1mL，搖勻后靜置15min，在279nm波長處測定吸光度值，計算RSD，結(jié)果見表10。

結(jié)果顯示RSD為1.96%，說明該方法有較好的重復(fù)性。

2.4.8 加樣回收率試驗

精密稱取新鮮瓜蔞皮0.5g，共9份，分別加入一定體積的蘆丁對照品溶液，按2.4.2項下方法制備供試品溶液，加入10%ALCl3溶液1mL，搖勻后靜置15min，于279nm波長處測定吸光度，計算總黃酮收率，結(jié)果見表11。

結(jié)果表明加樣回收率在95%～105%，RSD%小于2.0%，說明使用三氯化鋁顯色法測定瓜蔞總黃酮的檢測方法是可行的。

2.5 新鮮瓜蔞各部位溶液的制備

分別精密稱取新鮮瓜蔞各部位1g，加入60%乙醇100mL回流提取2次，每次2h，過濾，取濾液2mL于25mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，加入10%ALCl3溶液1mL，搖勻后靜置15min，于279nm波長處測定吸光度，計算總黃酮收率，結(jié)果見表12。

結(jié)果表明：新鮮瓜蔞各部分所含總黃酮含量從大到小依次為：新鮮瓜蔞汁﹥新鮮瓜蔞皮﹥新鮮瓜蔞瓤﹥新鮮瓜蔞籽。

3 結(jié)論與討論

本實驗采用三氯化鋁顯色法對新鮮瓜蔞不同部位的總黃酮進行含量測定，結(jié)果表明：新鮮瓜蔞的各部分中，新鮮瓜蔞籽中總黃酮含量最低，新鮮瓜蔞汁中總黃酮含量最高;新鮮瓜蔞各部分所含總黃酮含量從大到小依次為：新鮮瓜蔞汁﹥新鮮瓜蔞皮﹥新鮮瓜蔞瓤﹥新鮮瓜蔞籽。

在新鮮瓜蔞的分離過程中，對瓜蔞瓤和瓜蔞汁的分離，未能完全去除瓜蔞瓤中殘留的瓜蔞汁，只能初步過濾分離，對實驗數(shù)據(jù)會有一定影響，但影響不大。目前對瓜蔞總黃酮的鑒別實驗中，除了蘆丁作為對照，也有槲皮素作為對照的，沒有指定成分，需要實驗者自行選擇。筆者希望通過對新鮮瓜蔞不同部位總黃酮含量比較研究，為以后新鮮瓜蔞的開發(fā)利用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

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