易俊莉 楊新宇 張潔 田麗麗 丁北川 武文清

非結(jié)核分枝桿菌病與結(jié)核病臨床表現(xiàn)相似，如未能及時(shí)準(zhǔn)確鑒定極易造成誤診，且非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)大多對(duì)常見(jiàn)的抗結(jié)核藥品耐藥，只采用常規(guī)抗結(jié)核藥品進(jìn)行治療療效大多不理想。因此，需要操作簡(jiǎn)便、快速、可靠的區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)與NTM的檢測(cè)方法。為此，筆者比較不同原理的3種方法[即：對(duì)硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼(PNB/TCH)生長(zhǎng)試驗(yàn)法、結(jié)核分枝桿菌抗原(MPB64)檢測(cè)法、PCR-熒光探針?lè)╙對(duì)MTBC和NTM的鑒定結(jié)果，分析其臨床應(yīng)用價(jià)值。

資料和方法

一、菌株來(lái)源

11株標(biāo)準(zhǔn)菌株包括MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv及10株 NTM標(biāo)準(zhǔn)株(堪薩斯分枝桿菌、戈登分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、偶然分枝桿菌)均來(lái)源于國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室。238株臨床分離株為北京結(jié)核病控制研究所2019年1—12月門診患者培養(yǎng)陽(yáng)性凍存菌株，經(jīng)涂片抗酸染色均為陽(yáng)性。

二、檢驗(yàn)方法

1.儀器與試劑：中性羅氏培養(yǎng)基及PNB/TCH培養(yǎng)基由河南賽諾特生物技術(shù)有限公司提供。結(jié)核分枝桿菌抗原(MPB64)檢測(cè)試劑盒由杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司提供。PCR-熒光探針?lè)ㄊ褂肦oche LightCycler480儀，試劑盒由成都博奧晶芯生物科技有限公司提供。微陣列基因芯片試劑盒、核酸提取儀、芯片雜交儀、芯片掃描儀由北京博奧生物有限公司提供。

2.菌株復(fù)活：從菌株凍存管中取0.1 ml菌液接種在中性羅氏培養(yǎng)基中，37 ℃孵育2～4周，每周觀察生長(zhǎng)情況，直至長(zhǎng)出可視菌落。

3.PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)：按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[1]進(jìn)行。取中性羅氏培養(yǎng)基中復(fù)活的單個(gè)菌落加入無(wú)菌生理鹽水制成1 mg/ml菌液。將稀釋成10-2mg/ml的菌液各取0.1 ml分別接種于中性羅氏培養(yǎng)基與PNB/TCH培養(yǎng)基上，37 ℃孵育4周，觀察菌落生長(zhǎng)情況。PNB/TCH生長(zhǎng)者判定為NTM，PNB未生長(zhǎng)TCH生長(zhǎng)判定為MTBC，中性羅氏培養(yǎng)基無(wú)生長(zhǎng)時(shí)需重新檢測(cè)。

4.MPB64檢測(cè)法：在試管中加入0.2 ml生理鹽水及中性羅氏培養(yǎng)基中復(fù)活的單個(gè)菌落，加蓋后用渦旋混合器充分混合制成待測(cè)樣本。將100 μl樣本滴入檢測(cè)板的加樣孔內(nèi)，反應(yīng)15 min，觀察結(jié)果。陽(yáng)性：檢測(cè)線(T)及質(zhì)控線(C)都出現(xiàn)紫紅色條帶。陰性：檢測(cè)線(T)處沒(méi)有出現(xiàn)紫紅色條帶，只有質(zhì)控線(C)處出現(xiàn)紫紅色條帶。如質(zhì)控線沒(méi)有顯示條帶時(shí)使用其他檢測(cè)板重新檢測(cè)。陽(yáng)性結(jié)果判定為MTBC，陰性結(jié)果判定為NTM。

5.PCR-熒光探針?lè)ǎ喝≈行粤_氏培養(yǎng)基中復(fù)活的單個(gè)菌落及50 μl核酸提取液加入核酸提取管中，放入核酸提取儀震蕩5 min，95 ℃水浴5 min，3000×g離心1 min。取2 μl核酸樣本加入18 μl擴(kuò)增反應(yīng)液管后放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。設(shè)置PCR擴(kuò)增程序：37 ℃ 5 min、94 ℃ 3 min后，94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，50 ℃ 10 s。檢測(cè)通道同時(shí)選擇羧基熒光素(FAN)和六氯熒光素(HEX)通道，熒光采集點(diǎn)選擇60 ℃ 30 s。樣本擴(kuò)增曲線呈S型，且循環(huán)閾值(Ct值)<40判定為陽(yáng)性，擴(kuò)增曲線不呈S型或Ct值≥40(或無(wú)任何數(shù)值)判定為陰性。FAM通道陽(yáng)性，HEX通道陽(yáng)性或陰性，判定為MTBC。FAM通陰性，HEX通道陽(yáng)性，判定為NTM。FAM通道陰性，HEX通道陰性判定為分枝桿菌核酸檢測(cè)陰性。

6.微陣列基因芯片檢測(cè)：核酸提取方法同PCR-熒光探針?lè)?。將提取? μl模版DNA加入至18 μl反應(yīng)體系中，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取6 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、9 μl雜交緩沖液制成雜交反應(yīng)混合物，從蓋片的加樣孔加入，50 ℃雜交2 h。雜交結(jié)束后用十二烷基硫酸鈉洗液和檸檬酸鈉洗液沖洗干凈，用晶芯MTB檢測(cè)芯片系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果判讀。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以“率(%)”表示。以微陣列基因芯片鑒定結(jié)果為參照，計(jì)算PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)法、MPB64檢測(cè)法、PCR-熒光探針?lè)▽?duì)MTBC的檢測(cè)效能，計(jì)算公式：敏感度(%)=真陽(yáng)性株數(shù)/(真陽(yáng)性株數(shù)+假陰性株數(shù))×100%；特異度(%)=真陰性株數(shù)/(真陰性株數(shù)+假陽(yáng)性株數(shù))×100%；符合率(%)=(真陽(yáng)性株數(shù)+真陰性株數(shù))/總株數(shù)×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(%)=真陽(yáng)性株數(shù)/(真陽(yáng)性株數(shù)+假陽(yáng)性株數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值(%)=真陰性株數(shù)/(真陰性株數(shù)+假陰性株數(shù))×100%。采用Kappa值進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，Kappa值≥0.75時(shí)表示一致性較好。

結(jié) 果

一、標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測(cè)結(jié)果

10株NTM標(biāo)準(zhǔn)菌株及MTB標(biāo)準(zhǔn)株經(jīng)PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)法、MPB64檢測(cè)法、PCR-熒光探針?lè)ň_判定。238株臨床分離株中，PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)法檢出207株(87.0%)MTBC、31株(13.0%)NTM；MPB64檢測(cè)法檢出203株(85.3%)MTBC，35株(14.7%)NTM；PCR-熒光探針?lè)z出206株(86.6%)MTBC，32株(13.4%)NTM。有4株菌應(yīng)用PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)法、MPB64檢測(cè)法、PCR-熒光探針?lè)z測(cè)結(jié)果不一致，其中3株MPB64檢測(cè)結(jié)果為NTM菌株，PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)和PCR-熒光探針?lè)z測(cè)結(jié)果為MTBC，后經(jīng)微陣列基因芯片鑒定確認(rèn)為MTB；1株菌PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)法檢測(cè)結(jié)果為MTBC，MPB64檢測(cè)和PCR-熒光探針?lè)z測(cè)結(jié)果為NTM，后經(jīng)微陣列基因芯片鑒定確認(rèn)為堪薩斯分枝桿菌。

二、檢測(cè)效能分析

以微陣列基因芯片法鑒定結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)法檢測(cè)MTBC的敏感度為100.0%(206/206)、特異度為96.9%(31/32)；MPB64檢測(cè)法檢測(cè)MTBC的敏感度為98.5%(203/206)、特異度為100.0%(32/32)；PCR-熒光探針?lè)z測(cè)MTBC的敏感度為100.0%(206/206)、特異度為100.0%(32/32)；Kappa值分別為0.98、0.95、1.00(表1)。

三、方法可實(shí)施性分析

PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)法、MPB64檢測(cè)法、PCR-熒光探針?lè)z測(cè)周期分別為28 d、0.5 h、0.5 d，檢測(cè)平均成本分別為20、40、60元。PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)法和MPB64檢測(cè)法需要得到培養(yǎng)物才能進(jìn)行檢測(cè)。PCR-熒光探針?lè)ㄐ枰獙?shí)驗(yàn)室及操作人員具有專業(yè)的核酸檢測(cè)能力(表2)。

表1 以微陣列基因芯片法為參照標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)3種檢驗(yàn)方法檢測(cè)MTBC的效能

表2 PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)法、MPB64檢測(cè)法、PCR-熒光探針?lè)蓪?shí)施性比較

討 論

本研究以微陣列基因芯片法鑒定結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，分析比較了三種不同原理的MTBC和NTM鑒定方法的檢測(cè)效能及可實(shí)施性。PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)法是最傳統(tǒng)的鑒定MTBC的方法，其是利用MTBC在含有PNB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受到抑制，大多數(shù)NTM對(duì)一定濃度的PNB有耐藥性的原理，從而鑒別MTBC與NTM。MPB64檢測(cè)法檢測(cè)對(duì)象為培養(yǎng)物中的結(jié)核分枝桿菌抗原MPB64(又稱MPT64)，是MTBC分泌的一種特異性分泌蛋白，而NTM不分泌。PCR-熒光探針?lè)ú捎秒p重PCR技術(shù)和Taqman探針技術(shù)相結(jié)合的原理，對(duì)樣本中提取的分枝桿菌核酸進(jìn)行定性檢測(cè)。

本次研究中，PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)法檢測(cè)MTBC 的敏感度為100.0%，特異度為96.9%。其中，1株菌PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)法檢測(cè)結(jié)果為MTBC，MPB64檢測(cè)法和PCR-熒光探針?lè)z測(cè)結(jié)果為NTM，經(jīng)微陣列基因芯片法最終菌種鑒定為堪薩斯分枝桿菌，說(shuō)明PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)法作為MTBC與NTM鑒別試驗(yàn)存在局限性，部分NTM可能被錯(cuò)誤歸類為MTBC，與李國(guó)利等[2]的報(bào)道一致。吳龍章等[3]分析認(rèn)為，需要光學(xué)照射才能產(chǎn)生色素的光產(chǎn)色性分枝桿菌菌群(如堪薩斯分枝桿菌)在實(shí)驗(yàn)室中未經(jīng)光學(xué)照射易誤判為MTBC，從而導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤。當(dāng)比例法藥敏試驗(yàn)顯示多種藥品耐藥而PNB顯示敏感，且對(duì)照管生長(zhǎng)的菌落為細(xì)小菌落或產(chǎn)色時(shí)，應(yīng)高度懷疑為NTM，為避免結(jié)果差錯(cuò)，建議采用其他方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

MPB64檢測(cè)法檢測(cè)MTBC的敏感度為98.5%，特異度為100.0%。其中，有3株假陰性結(jié)果，即MPB64檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)果為NTM，PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)法、PCR-熒光探針?lè)z測(cè)結(jié)果為MTBC，經(jīng)微陣列基因芯片法最終菌種鑒定為MTBC，該現(xiàn)象此前也有報(bào)道。分析其主要原因，可能為MTB中的MPB64編碼基因突變，如63 bp缺失，造成出現(xiàn)檢測(cè)假陰性結(jié)果[4-7]。MPB64檢測(cè)法除了可以利用固體培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行檢測(cè)，也可以采用抗酸桿菌培養(yǎng)物的懸濁液或者培養(yǎng)液直接作為樣本使用。因此，適用于BACTEC MIGIT 960培養(yǎng)陽(yáng)性后藥物敏感性試驗(yàn)前的菌種初步鑒定，可縮短檢測(cè)周期。但對(duì)生長(zhǎng)指數(shù)較低的樣本，應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，以避免假陰性產(chǎn)生[8-9]。液體培養(yǎng)法MTB涂片鏡檢多呈索狀排列，NTM多呈團(tuán)塊狀排列或散在分布，因此，當(dāng)MPB64檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)果與涂片鏡檢形態(tài)結(jié)果不一致時(shí)，建議采用其他方法進(jìn)一步確認(rèn)。

PCR-熒光探針?lè)ň哂休^高的敏感度和特異度?！禬S 288—2017肺結(jié)核診斷》[10]也已將分枝桿菌核酸檢測(cè)納入結(jié)核病病原學(xué)檢查范疇。核酸擴(kuò)增法可以利用臨床痰標(biāo)本直接進(jìn)行檢測(cè)，作為痰涂片和培養(yǎng)的補(bǔ)充，對(duì)結(jié)核病病原學(xué)快速檢測(cè)具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[11]。同時(shí)，因無(wú)需使用陽(yáng)性培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)，可大幅縮短檢測(cè)周期，為患者早期診斷和制定化療方案提供依據(jù)。

在各實(shí)驗(yàn)室技術(shù)可實(shí)施性方面，PCR-熒光探針?lè)z測(cè)耗時(shí)短，總檢測(cè)時(shí)間僅需要0.5 d，但操作較為復(fù)雜，需要實(shí)驗(yàn)室及操作人員具有專業(yè)的核酸檢測(cè)能力，且前期設(shè)備儀器投入較大，造成檢測(cè)成本相對(duì)較高,在基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用尚需時(shí)日。MPB64檢測(cè)法操作更為簡(jiǎn)便，只需在生物安全柜內(nèi)將樣本滴入加樣孔后15 min即可觀察結(jié)果，總檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)30 min。同時(shí)，該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)輔助設(shè)備要求相對(duì)不高，試劑盒可常溫保存，費(fèi)用合理，更適用于標(biāo)本量較多且檢測(cè)條件有限的基層實(shí)驗(yàn)室。PNB/TCH生長(zhǎng)試驗(yàn)法具有操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低的優(yōu)勢(shì)，但培養(yǎng)判定所需時(shí)間較長(zhǎng)(28 d)，在快速鑒別診斷中并無(wú)優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，三種方法均可用于MTBC與NTM的鑒定，各具優(yōu)勢(shì)。PCR-熒光探針?lè)舾卸群吞禺惗雀?，檢測(cè)結(jié)果較其他兩種方法更為準(zhǔn)確可靠，適合具有核酸檢測(cè)能力的實(shí)驗(yàn)室使用。MPB64檢測(cè)法操作簡(jiǎn)便、快速、價(jià)格低廉，更適合標(biāo)本量大且檢測(cè)能力有限的基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行初步鑒定使用。