祝波 楊玉濤 楊梅 馬武開(kāi) 姚血明 黃穎 寧喬怡 蔣光芬 王璐 高雪琴

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽(yáng) 550025;2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴陽(yáng) 550003)

風(fēng)濕病是指由于各種原因而引起骨、關(guān)節(jié)和周圍的軟組織，如肌肉、腱、滑膜和筋膜，疼痛較多的疾病[1]。本文主要對(duì)代謝組學(xué)的質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)在于風(fēng)濕性免疫系統(tǒng)疾病(如骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性骨關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性下肢紅斑狼瘡、強(qiáng)直性柱炎)代謝標(biāo)志物的篩選的研究進(jìn)行歸納及展望。報(bào)告如下。

1 質(zhì)譜技術(shù)的分類、原理及優(yōu)勢(shì)

質(zhì)譜,通常又被廣泛稱為分子質(zhì)譜法,臨床上常用的方法是有機(jī)質(zhì)譜激光儀器,如液相化學(xué)色譜-質(zhì)子基譜激光聯(lián)用儀(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)子基譜激光聯(lián)用儀(GC-MS)、傅里葉時(shí)間變換激光質(zhì)譜儀(FT-MS)以及輔助基質(zhì)激光輔助質(zhì)譜激光用于解吸太空飛行器的時(shí)間變換質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMS)等四大質(zhì)譜類。它主要功能是將分析樣品中的分子轉(zhuǎn)化成各種帶電中性離子,并通過(guò)利用樣品相應(yīng)的離子電場(chǎng)、磁場(chǎng)原理來(lái)準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)中性離子鍵與m/z鍵的分離,從而準(zhǔn)確檢測(cè)每種中性離子的帶電峰值和強(qiáng)度也是進(jìn)行離子物質(zhì)化學(xué)分析的一種儀器。與其他傳統(tǒng)生化免疫分析方法相比，該方法具有特異性高、靈敏度高、檢測(cè)限低、分析速度快等明顯優(yōu)勢(shì)，使其在臨床微生物標(biāo)記物的檢測(cè)方面極具潛力，篩選作用高效，可應(yīng)用于臨床免疫生物學(xué)、分子生物診斷、臨床生物化學(xué)研究、微生物檢驗(yàn)研究等方面[2]。

2 質(zhì)譜技術(shù)在風(fēng)濕性疾病的相關(guān)應(yīng)用

2.1骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthitis,OA) 骨關(guān)節(jié)炎是以關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病，主要由關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、軟骨外基質(zhì)、軟骨下骨質(zhì)合成及降解的平衡破壞導(dǎo)致的，多見(jiàn)于中老年人[3]。目前對(duì)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病的發(fā)病的分子尚不完全明確，且對(duì)其生物標(biāo)記物的研究的報(bào)道并不是很多。通過(guò) GC-MS 對(duì)骨關(guān)節(jié)炎患者的尿液進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)患者尿液中的三羧酸循環(huán)(TCA)呈上調(diào)趨勢(shì)的原因與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)[4]。余光書(shū)等基于質(zhì)譜技術(shù)分析軟骨細(xì)胞線粒體蛋白質(zhì)及細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究，對(duì)膝關(guān)節(jié)表面置換術(shù)患者的關(guān)節(jié)軟骨組織提取線粒體進(jìn)行分析鑒定，共發(fā)現(xiàn)294個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的蛋白質(zhì)有ATP合酶、超氧化物歧化酶、谷氨酸脫氫酶1等14種蛋白質(zhì)存在于此線粒體并對(duì)軟骨細(xì)胞線粒體中的蛋白質(zhì)作全面的定性觀察[5]。Carlson AK等運(yùn)用高效液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)骨關(guān)節(jié)炎患者及健康人的關(guān)節(jié)滑液進(jìn)行整體代謝組譜分析，確定35種代謝物為骨關(guān)節(jié)炎的潛在生物標(biāo)志物[6]。Zhang在OA患者的關(guān)節(jié)滑液中發(fā)現(xiàn)6種差異代謝分子并證實(shí)谷氨酰胺、 5-脫水葡糖醇以及葡萄糖內(nèi)酯組合可顯著區(qū)分OA患者與健康人群，單-分子葡萄糖內(nèi)酯則可有效區(qū)分OA與RA患者[7]。運(yùn)用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLC/Q-TOF-MS)對(duì)重度骨關(guān)節(jié)炎患者的硬化的軟骨下骨進(jìn)行檢測(cè)分析，其中與軟骨下骨硬化密切相關(guān)為牛磺酸、β-丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸、嘧啶、嘌呤、神經(jīng)鞘脂，而與骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨硬化最為相關(guān)為?；撬帷ⅵ?丙氨酸,并發(fā)現(xiàn)左旋肉堿、?；撬?、甘油磷脂等分子在軟骨下骨硬化的發(fā)病機(jī)制中有著重要的調(diào)節(jié)作用；而β-丙氨酸和左旋肉堿最有可能是軟骨下骨硬化的耗能代謝物[8]。綜上質(zhì)譜技術(shù)在骨性關(guān)節(jié)炎疾病鑒定和對(duì)生物細(xì)胞標(biāo)記物的研究過(guò)程中一直起著至關(guān)重要的指導(dǎo)作用,通過(guò)質(zhì)譜鑒定提取出有重要意義的差異生物標(biāo)記物并對(duì)其分別進(jìn)行該病相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)和代謝因子通路的分析研究,將極大有助于初步了解該相關(guān)疾病的具體發(fā)病變化機(jī)制,對(duì)于早期疾病診斷及初步探尋該病相關(guān)的臨床靶向生物治療方法提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。

2.2痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(gouty arthritis,GA) 痛風(fēng)是由于嘌呤代謝紊亂，尿酸鹽在關(guān)節(jié)囊、囊、軟骨、骨、腎皮下等組織內(nèi)沉積而引起的一種疾病，容易發(fā)生疾病和炎癥，多見(jiàn)于跖趾關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)等，多見(jiàn)于中老年男性。運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)尋找差異性標(biāo)志物，并分析標(biāo)志物的相關(guān)代謝通路，去探究痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制。運(yùn)用UHPLC-Q-TOF / MS技術(shù)并結(jié)合多變量分析方法對(duì)AGA模型大鼠的血漿的生物標(biāo)志物進(jìn)行分析，確定AGA的內(nèi)源性代謝物，探尋AGA的發(fā)病機(jī)制，為疾病的預(yù)防，檢測(cè)和診斷提供可靠的依據(jù)[9]。陳嬌等運(yùn)用GC-MS的代謝組學(xué)方法對(duì)痛風(fēng)患者的血清代謝進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)病人的血清代謝譜與健康人的血清譜存在差異[10]。而于棟華等使用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜方法對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的腎臟進(jìn)行代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)牛磺酸和亞?；撬岽x，乙醛酸和二羧酸代謝與腎臟代謝有關(guān)，且?；撬岷筒菟崾瞧渖婕暗膬?nèi)源性生物標(biāo)志物[11]。張寧等利用超高液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-TOF-MS)研究了總皂苷對(duì)急性疼痛的干預(yù)作用，確定了風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的7種潛在生物標(biāo)志物包括麥角鈣化醇、軟骨素、甘油磷酰膽堿、乙二 酸、廿二碳六烯酸、牛磺酸和甲羥戊酸[12]。

2.3系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE) SLE是一種典型的自身免疫性結(jié)締組織疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床癥狀多樣，給SLE的診斷和監(jiān)測(cè)帶來(lái)挑戰(zhàn)，代謝組學(xué)作為后基因新興的組學(xué)技術(shù)，為尋找新的生物標(biāo)志物提供新策略和新思路。采用2-DE和MS檢測(cè)小鼠HL-60細(xì)胞的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)早期用熱休克蛋白60和α-烯醇化酶等6種細(xì)胞質(zhì)和核蛋白激活B細(xì)胞自身抗原相應(yīng)的SLE自身抗體數(shù)量也會(huì)增加，這為SLE患者的發(fā)病機(jī)制提供了一定的依據(jù)[13]。王燕妮等運(yùn)用質(zhì)譜方法發(fā)現(xiàn)鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸蛋白激酶可能是新的系統(tǒng)性紅斑狼瘡候選抗原[14]。俞穎等通過(guò)液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血漿樣本進(jìn)行代謝指紋圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SLE的患者與健康者代謝指紋存在明顯差異，并發(fā)現(xiàn)SLE的血清當(dāng)中的氨基酸、磷脂和卜啉呈高上調(diào)的趨勢(shì)[15]。Yan R采用GC-MS發(fā)現(xiàn)SLE患者糞便代謝產(chǎn)物與系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動(dòng)指標(biāo)密切相關(guān)[16]。ZhangQ采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)SLE患者和健康對(duì)照者(HCS)的血清進(jìn)行代謝譜分析，該研究表明血清代謝譜在SLE患者和HCS患者中是不同的，L-焦谷氨酸升高是SLE的一個(gè)有希望的雙模式標(biāo)志物[17]。

2.4類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis ,RA) RA是一種慢性非化膿性炎癥疾病，屬于自身免疫性疾病，常好發(fā)于手關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、趾骨間關(guān)節(jié)[18]。目前，診斷RA主要靠臨床免疫學(xué)檢查及相關(guān)的影像學(xué)的手段，而疾病的發(fā)生往往最開(kāi)始是功能及分子標(biāo)志物的改變，繼而才是形態(tài)學(xué)的改變。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)RA的研究尋找參與發(fā)病機(jī)制的生物標(biāo)志物，這為臨床上診斷RA有著重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用MALDI-TOF- MS技術(shù)對(duì)于RA濕熱瘀阻證、非濕熱瘀阻證及健康志愿者的血清進(jìn)行檢測(cè)，篩選出其特異的生物學(xué)標(biāo)志物并研究了發(fā)病機(jī)制[19]。Ran Noh等采用MALDI-TOF-MS技術(shù)，對(duì)RA患者血清及關(guān)節(jié)液進(jìn)行分析，推測(cè)STEAP4和ZNF658可作為RA的特異性蛋白質(zhì)，有一定的診斷意義[20]。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候基因表達(dá)譜的研究發(fā)現(xiàn)：3-氧-丙酸、L-脯氨酸、尿素、5-氧-脯氨酸、核糖醇、纖維醇為在熱證中呈高表達(dá)，L-亮氨酸在寒證中呈高表達(dá)[21]。利用代組學(xué)方法對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎兔血漿代謝物進(jìn)行影響，發(fā)現(xiàn)有尿苷、肌酸酐呈上升趨勢(shì)，壬二酸和苯甲酰氨基酯呈下降趨勢(shì)[22]。用串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)活動(dòng)期RA患者血漿中DMARD代謝物濃度，發(fā)現(xiàn)攜帶rs1476413SNP、TT或CT等位基因的患者的血漿多谷氨酸代謝產(chǎn)物顯著升高，相應(yīng)的疾病活動(dòng)性評(píng)分也相應(yīng)升高[23]。采用iTRAQ聯(lián)合Nano LC-MS/MS技術(shù)篩選出早期RA患者的差異的蛋白，并分析了差異蛋白主要的細(xì)胞定位、分子功能及參與的生物學(xué)過(guò)程、主要信號(hào)通路，再進(jìn)一步分析這些差異蛋白相關(guān)通路，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白與早期RA的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[24]。運(yùn)用GC-MS技術(shù)研究了蛇葡萄(AA)提取物對(duì)大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎的代謝影響，發(fā)現(xiàn)了AA治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的20個(gè)特異性生物標(biāo)志物和3個(gè)相關(guān)代謝途徑，為代謝組學(xué)生物標(biāo)志物在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的確認(rèn)和驗(yàn)證提供了新的視角[25]。Blaschke S等采用凝膠電泳(2D-DGE)分離和質(zhì)譜(MS)研究法并Western blot分析驗(yàn)證法首次確定和驗(yàn)證了結(jié)合珠蛋白-α1、-α2、，維生素D結(jié)合蛋白和載脂蛋白C-Ⅲ作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎預(yù)測(cè)依那西普藥物療效的潛在生物標(biāo)志物[26]。

2.5強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylits,AS) AS是主要影響骶髂關(guān)節(jié)、脊柱和四肢大關(guān)節(jié)的慢性炎性疾病，以髖關(guān)節(jié)受累為主，嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致畸型。運(yùn)用該技術(shù)尋找高靈敏和特異的AS生物標(biāo)志物,為臨床上早期診療AS提供幫助。研究發(fā)現(xiàn)AS患者與健康者的代謝產(chǎn)物存在差異及不同性別之間也有一定的差別，發(fā)現(xiàn)脂類和烷烴為AS糞便的主要特征，大部分與AS患者的疾病有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)了葡萄糖酸和α-l-半乳呋喃糖苷在AS患者腸道中的含量增加，推測(cè)與AS患者血糖升高有關(guān)[27]。Jing利用MS發(fā)現(xiàn)AS患者血清中結(jié)合珠蛋白前體表達(dá)上調(diào)，其抗原決定因子與HLA-B2705 (HLA-B27亞組)相關(guān)，推測(cè)AS的發(fā)病機(jī)制也可能與結(jié)合珠蛋白的前提有關(guān)[28]。Gao等采用氣相色譜/質(zhì)譜(GC-MS)和液相色譜/質(zhì)譜(LC-MS)技術(shù)和代謝組學(xué)方法對(duì)AS患者血漿代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)患者血漿中脯氨酸、葡萄糖、磷酸鹽、尿素、甘油、苯丙氨酸、同型半胱氨酸濃度升高，磷酸、色氨酸二肽-苯丙氨酸濃度降低[29]。而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)艾灸能改善AS小鼠的整體健康模型，可降低其爪子厚度和組織中IL-1β、PGE水平、IL-6和TNF-α在AS小鼠中的表達(dá)及發(fā)現(xiàn)艾灸對(duì)TCA循環(huán)、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、腸道菌群代謝和嘌呤代謝表達(dá)有逆轉(zhuǎn)作用，能夠進(jìn)一步了解艾灸治療AS的機(jī)制[30]。

2.6干燥綜合征(Sjogren,s syndrome,SS) SS皮炎屬于一種自身機(jī)體免疫系統(tǒng)疾病，以直接侵犯外分泌腺組織為主，常見(jiàn)的表現(xiàn)在發(fā)熱口干，腮腺下部腫大，眼睛酸澀痛等多種臨床表現(xiàn)，有時(shí)也甚至可直接累及多個(gè)神經(jīng)器官。Kageyama G等用GC-MS分析原發(fā)性干燥綜合征(PSS)患者與健康者(HCS)的唾液，發(fā)現(xiàn)PSS患者唾液代謝物多樣性降低，甘氨酸、酪氨酸、尿酸和巖藻糖的含量相對(duì)減少，據(jù)此推測(cè)引起唾液腺破壞的原因有可能是由于慢性涎腺炎引起的[31]。

綜上所述，代謝組學(xué)的質(zhì)譜技術(shù)憑借其特有的優(yōu)勢(shì)，在風(fēng)濕性常見(jiàn)疾病的生物標(biāo)志物的研究當(dāng)中具有很重要的意義，通過(guò)對(duì)其相關(guān)的生物標(biāo)志物研究可以發(fā)現(xiàn)參與其發(fā)病機(jī)制的微生物，對(duì)疾病的早期診斷、預(yù)測(cè)及治療提供了相關(guān)依據(jù)。

3 展 望

患者血清本身抗體的形成是風(fēng)濕病的主要表現(xiàn)，特異抗體和具有標(biāo)志性的生物標(biāo)識(shí)對(duì)疾病診斷起著舉足輕重的作用。雖然質(zhì)譜技術(shù)目前還處于發(fā)展的階段，但質(zhì)譜技術(shù)是一種新的技術(shù)手段，對(duì)尋找潛在生物標(biāo)志物有著重要意義，它可以顯示疾病發(fā)生的機(jī)制，用于早期疾病診斷，實(shí)現(xiàn)靶向性治療，此外還可以用來(lái)評(píng)估治療效果和判斷預(yù)后。該技術(shù)將在未來(lái)臨床診斷中發(fā)揮重要作用，具有巨大的發(fā)展空間和前景。未來(lái)隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展成熟，將會(huì)在風(fēng)濕免疫學(xué)疾病中廣泛開(kāi)展研究，必將帶動(dòng)風(fēng)濕病學(xué)新的發(fā)展。