周秀娟 竇永明 張金磊 池春櫻 張強(qiáng)

摘 要：隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對(duì)食品的要求逐漸提高，食品微生物檢測(cè)技術(shù)的高精度性和準(zhǔn)確性顯得尤為重要。本文將具體介紹幾種重要的食品微生物檢測(cè)技術(shù)和質(zhì)量控制的重要性，為相關(guān)機(jī)構(gòu)及技術(shù)人員提供理論支撐和借鑒，為人們的飲食安全和生命健康保駕護(hù)航。

關(guān)鍵詞：食品檢驗(yàn);微生物檢測(cè)技術(shù);食品質(zhì)量把控

The Importance of Food Microbiological Detection Technology and its Quality Control

ZHOU Xiujuan， DOU Yongming， ZHANG Jinlei， CHI Chunying， ZHANG Qiang

（Daewoo （Jilin） Inspection and Testing Co.， Ltd.， Yanji 133000， China）

Abstract： With the development of China’s economy， people’s requirements for food gradually improve， and the high precision and accuracy of food microbial detection technology are particularly important.This article will specifically introduce the importance of several important food microbial testing technologies and quality control， provide theoretical support and reference for relevant institutions and technical personnel， and escort people’s food safety and life and health.

Keywords： food inspection; microbial detection technology; food quality control

食源性微生物是引起食品安全問(wèn)題的最突出問(wèn)題之一，隨著食品流通的全球化，病原微生物的廣泛適應(yīng)性，食品安全問(wèn)題受到人們的廣泛關(guān)注。食品問(wèn)題關(guān)乎整個(gè)食品行業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展，更關(guān)系到人們的生命健康，因此加強(qiáng)食品微生物的檢測(cè)技術(shù)能力是刻不容緩的。食品微生物檢測(cè)技術(shù)在行業(yè)中的積極運(yùn)用以及質(zhì)量控制是保證食品質(zhì)量的關(guān)鍵方式，同時(shí)也規(guī)范了相關(guān)部門(mén)的檢驗(yàn)過(guò)程。

1 相關(guān)規(guī)定介紹

1.1 食品安全規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)國(guó)際衛(wèi)生組織、我國(guó)食品安全法、農(nóng)業(yè)部等相關(guān)法律法規(guī)規(guī)定，衡量食品安全的標(biāo)準(zhǔn)主要概括為6個(gè)方面。①食品中重金屬、農(nóng)藥殘留、病原性微生物等對(duì)人體健康會(huì)造成危害的物質(zhì)殘留量。②食品添加劑的適用范圍及用量和品種。③食品安全相關(guān)質(zhì)量要求。④食品銷(xiāo)售市場(chǎng)的要求，包括添加劑成分標(biāo)注、生產(chǎn)日期、保質(zhì)期、食用說(shuō)明、產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)代號(hào)及食品生產(chǎn)許可證編號(hào)等標(biāo)識(shí)要求。⑤特殊功能性食品、保健品、嬰幼兒食品的特殊要求和檢驗(yàn)合格許可證。⑥食品在生產(chǎn)、銷(xiāo)售過(guò)程中的質(zhì)量需符合當(dāng)前食品規(guī)定的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 食源性致病菌

食源性致病菌指的是能通過(guò)一定途徑進(jìn)入人體內(nèi)寄生、繁殖，并會(huì)引發(fā)疾病的病原微生物，常會(huì)引起腹瀉、食物中毒、腸道傳染病等食源性疾病。常見(jiàn)的致病菌包括沙門(mén)氏菌、李斯特菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、大腸桿菌O157、志賀菌和金黃色葡萄球菌等，感染途徑呈現(xiàn)多樣性，可通過(guò)口腔途徑或存在腌制食品中以及一些變質(zhì)腐敗的食物中，常見(jiàn)于蛋、奶、肉類(lèi)食物中，食用后引起人的腹痛、腹瀉、嘔吐和食物中毒，嚴(yán)重者會(huì)引起休克和腦組織感染。

2 食品微生物的檢測(cè)技術(shù)

2.1 傳統(tǒng)微生物檢測(cè)技術(shù)

傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)技術(shù)主要是以分離培養(yǎng)為主，通過(guò)形態(tài)觀察、染色和生化鑒定來(lái)辨別目標(biāo)菌株，包括顯微鏡觀察檢測(cè)、生化試驗(yàn)（如糖酵解或淀粉水解試驗(yàn)）、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)和檸檬酸鹽試驗(yàn)等方法。這些方法的原理以微生物的唯一碳源或氮源或生成特殊物質(zhì)為出發(fā)點(diǎn)，進(jìn)行鑒定和分離，只是通過(guò)簡(jiǎn)單的形態(tài)觀察進(jìn)行區(qū)分，方法成本較低，但同時(shí)效率也較低，準(zhǔn)確率也得不到良好保證。

2.2 基因探針檢測(cè)法

分子雜交技術(shù)是基因探針技術(shù)，該技術(shù)圍繞DNA雙鏈堿基互補(bǔ)原則展開(kāi)試驗(yàn)，將帶有特定標(biāo)記的DNA探針通過(guò)退火的方式與目標(biāo)樣本的DNA片段結(jié)合，隨后檢測(cè)探針上的特定標(biāo)記物，從而達(dá)到檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有目標(biāo)樣品的目的。該方法能夠廣泛應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域，具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、穩(wěn)定性較高的特點(diǎn)，受影響因素較少。目前該技術(shù)還有待改進(jìn)的地方是探針標(biāo)記物在一定程度上對(duì)人體具有一定的輻射性，其后續(xù)的處理途徑較困難，對(duì)技術(shù)人員的操作要求較高，同時(shí)目前探針的價(jià)格還不夠低廉，檢測(cè)的成本也較高，無(wú)法做到大批次檢測(cè)。

檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌含量的實(shí)際應(yīng)用為取一定量的樣品加入滅菌的生理鹽水中，隨后接種于含NaCl的肉湯中，在36 ℃的條件下培養(yǎng)24 h，將菌液涂布于平板上，保持原條件繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，挑取疑似金黃色葡萄球菌的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色及血漿凝固酶試驗(yàn)，運(yùn)用Accuprobe探針進(jìn)行檢測(cè)，在檢測(cè)樣品前，需進(jìn)行探針特異性的檢測(cè)，先用探針檢測(cè)已知的金黃色葡萄球菌和非金黃色葡萄球菌。預(yù)實(shí)驗(yàn)后，從平板中挑取待測(cè)菌落置于探針管內(nèi)，在37 ℃條件下進(jìn)行5 min的孵育，隨后向管內(nèi)加入雜交緩沖液和選擇試劑，在60 ℃條件下進(jìn)行15 min的孵育。將管內(nèi)的液體充分混勻，繼續(xù)孵育5 min，隨后在室溫冷卻5 min，經(jīng)發(fā)光儀檢測(cè)特殊標(biāo)記熒光物質(zhì)，通過(guò)陰性和陽(yáng)性對(duì)照判定樣品食品中是否含有金黃色葡萄球菌，也可通過(guò)相對(duì)光單位判定菌液濃度。

2.3 表面等離子體共振技術(shù)檢測(cè)

生物傳感器是一種對(duì)生物物質(zhì)敏感同時(shí)可以將液體濃度轉(zhuǎn)化為電信號(hào)的裝置。第一個(gè)生物傳感器是由烏普蒂科研發(fā)的葡萄糖傳感器。生物傳感器已應(yīng)用在食品安全檢測(cè)中，該裝置運(yùn)用的原理是電磁波在金屬表面?zhèn)鞑?huì)產(chǎn)生表面等離子體，當(dāng)平行于表面的偏振光以表面等離子體共振角入射在界面上時(shí)，反射光會(huì)被削弱，而這種微弱的變化可以被傳感器裝置捕捉，因此可將樣品固定于金屬表面，從而產(chǎn)生不同的表面等離子響應(yīng)，根據(jù)不同響應(yīng)來(lái)檢測(cè)不同樣品。

利用該方法可以檢測(cè)食品中埃希氏大腸桿菌、李斯特氏菌、沙門(mén)氏菌等菌種，如利用光學(xué)式生物傳感器檢測(cè)李斯特菌，將李斯特菌和抗體進(jìn)行共同孵育，隨后采用高速離心方法去除結(jié)合不緊密或未結(jié)合的抗體，當(dāng)這些未結(jié)合的抗體流經(jīng)修飾過(guò)的傳感芯片表面時(shí)，產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)與菌液細(xì)胞濃度成反比，這種方法可以實(shí)現(xiàn)樣品有限情況下的微生物快速檢測(cè)。

2.4 ATP生物發(fā)光技術(shù)

ATP生物發(fā)光技術(shù)的原理是將細(xì)胞破碎，使ATP分子釋放出來(lái)，在熒光素和熒光素酶的共同作用下，ATP分子釋放出高能磷酸鍵，從而產(chǎn)生熒光，通關(guān)檢測(cè)熒光強(qiáng)度進(jìn)而間接反映微生物細(xì)胞濃度，這種方法具有靈敏、方便操作等優(yōu)點(diǎn)，但其局限在于測(cè)量范圍有限，無(wú)法達(dá)到檢測(cè)單一目標(biāo)菌種。

利用ATP生物發(fā)光法檢測(cè)食品微生物總數(shù)。取樣品接種至大腸桿菌斜面培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)6～12 h，隨后10 000 r/min，離心1 min，保留沉淀，將沉淀用磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行沖洗，在進(jìn)行檢測(cè)前將菌液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)S后將待測(cè)菌液加入比色皿中，向比色皿底部垂直加入2滴細(xì)菌細(xì)胞ATP釋放試劑，充分混勻，微量光度計(jì)將自行測(cè)量熒光值強(qiáng)度，通過(guò)熒光值強(qiáng)度反應(yīng)菌液的濃度[1]。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

酶聯(lián)免疫法是最先由瑞典學(xué)者和荷蘭學(xué)者提出，用免疫技術(shù)檢測(cè)液體中微量物質(zhì)的固相免疫方法。該方法的基本原理是將抗原或抗體與某種酶進(jìn)行連接，形成同時(shí)擁有免疫活性和酶活性的酶標(biāo)抗原或抗體，使待測(cè)物和酶標(biāo)抗原或抗體按一定步驟，與固相載體表面的抗原或抗體反應(yīng)，用PBS沖洗形成的抗原抗體復(fù)合物，將其與其他物質(zhì)洗滌分開(kāi)，最后加入顯色底物讓其與酶反應(yīng)顯色，根據(jù)底物顏色深淺進(jìn)行定量定性分析。該方法能夠很好地應(yīng)用在食品安全檢驗(yàn)中，準(zhǔn)確性、靈敏度能夠達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，但其有較高的假陽(yáng)性和假陰性機(jī)率的局限性。

利用酶聯(lián)吸附檢測(cè)食品中的志賀氏菌，將已確定的菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在搖床中培養(yǎng)18 h，隨后在3 000 r/min條件下離心30 min，用無(wú)菌生理鹽水洗滌后得到菌懸液，100 ℃滅活得到抗原，與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)兔抗雞IgG，37 ℃孵育2 h，加入無(wú)菌水稀釋過(guò)的待測(cè)食品，37 ℃孵育1 h，洗板，加入TMB顯色液，顯色反應(yīng)10 min后加入H2SO4終止反應(yīng)，在450 nm處進(jìn)行吸光值檢測(cè)。

2.6 PCR法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）于1985年由Mullis發(fā)明，以DNA半保留復(fù)制為基礎(chǔ)，DNA雙鏈在高溫下變形解旋成單鏈，隨后在耐高溫的DNA聚合酶、4種脫氧核糖核酸堿基共同作用下，以堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成體外復(fù)制延伸目的片段的過(guò)程。該方法可利用已知的目的菌株進(jìn)行相關(guān)引物的設(shè)計(jì)，隨后進(jìn)行目標(biāo)DNA片段的擴(kuò)增，最后通過(guò)電泳檢測(cè)是否含有目的菌株的待測(cè)基因，該方法快速、準(zhǔn)確，應(yīng)用極為廣泛[2]。

利用PCR法檢測(cè)食品中的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌即耐熱菌，該菌株在16S rDNA的V2和V4區(qū)有一段特殊區(qū)域，可利用該區(qū)域的特殊基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增該區(qū)域特定大小的片段。取適量菌株懸浮液與離心管中，加入TE液、SDS和蛋白酶K，充分混勻后，將混合液在37 ℃條件下孵育1 h，再加入5 mol/L NaCl、CATB/NaCl溶液，充分混勻后，65 ℃熱水浴10 min，加入等體積氯仿4 ℃離心5 min，保留沉淀;加入0.6倍體積的異丙酮，室溫靜置一段時(shí)間后收集DNA絮狀沉淀，再次加入TE液溶解絮狀DNA，以提取的DNA液為模板，隨后進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和PCR特異性檢測(cè)。取一定量的樣品，經(jīng)無(wú)菌水適度稀釋后，經(jīng)針筒式過(guò)濾器和濾膜過(guò)濾后，置于無(wú)菌培養(yǎng)液中，在pH值為4.0條件下，70 ℃水浴10 min，隨后冷卻至45 ℃振蕩培養(yǎng)6～

12 h，12 000 r/min離心10 min，保留沉淀，向沉淀中加入無(wú)菌蒸餾水，使其溶解，90 ℃水浴5 min，靜置冷卻至室溫，8 000 r/min離心5 min，用上清液作為PCR模板，隨后進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，最后用凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)和判斷。

2.7 噬菌體檢測(cè)技術(shù)

噬菌體是一種專(zhuān)性感染細(xì)菌的病毒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單由遺傳物質(zhì)核酸和蛋白質(zhì)外衣組成，通過(guò)蛋白質(zhì)外衣與細(xì)菌表面的受體特異性結(jié)合進(jìn)而將遺傳物質(zhì)注入宿主菌體內(nèi)，在宿主菌體內(nèi)完成遺傳物質(zhì)的復(fù)制、翻譯，進(jìn)行遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)外衣的組裝，最終釋放，可通過(guò)噬菌體感染細(xì)菌產(chǎn)生噬菌斑，實(shí)現(xiàn)微生物的檢測(cè)。噬菌體具有繁殖快、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、專(zhuān)一性強(qiáng)等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品微生物的快速檢測(cè)中。

利用烈性噬菌體檢測(cè)副溶血性弧菌噬菌（Vibrio Parahaemolyticu），將待測(cè)樣品通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾后加入到LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入V.parahaemolyticus ATCC 17802，混合物于37 ℃搖床培育過(guò)夜，隨后進(jìn)行5 000 r/min離心10 min，取上清梯度稀釋后涂布于平板上，37 ℃培養(yǎng)10 h，挑取可疑的單菌落與V.parahaemolyticus ATCC 17802菌液中，加入適當(dāng)稀釋的T4噬菌體稀釋液，涂布于平板上，37 ℃孵育，隨后對(duì)形成的噬菌斑進(jìn)行計(jì)數(shù)，用以評(píng)估食品中目的菌株的數(shù)量。

2.8 電阻抗法檢測(cè)

電阻抗法檢測(cè)是較早應(yīng)用于微生物檢測(cè)的區(qū)別于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的物理學(xué)方法，該方法運(yùn)用的原理是微生物在新陳代謝過(guò)程中會(huì)將培養(yǎng)基中的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)等電惰性物質(zhì)轉(zhuǎn)化為電活性物質(zhì)，隨著微生物的增長(zhǎng)，代謝活性加強(qiáng)，產(chǎn)生的電導(dǎo)率曲線與微生物生長(zhǎng)曲線經(jīng)歷的過(guò)程是一致的，建立二者的關(guān)系，同時(shí)不同的微生物造成培養(yǎng)基的電阻率也是不同的，但該方法需要將菌株接種在特殊的培養(yǎng)基中才能產(chǎn)生電反應(yīng)。

2.9 流式細(xì)胞儀測(cè)量技術(shù)

流式細(xì)胞儀是一種基于細(xì)胞技術(shù)的微生物檢測(cè)方法，通過(guò)激光束對(duì)細(xì)胞顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的定量和定性分析，該方法能夠快速準(zhǔn)確的自動(dòng)化分析檢測(cè)食品中的微生物，但該技術(shù)的操作要求較高，并且該設(shè)備昂貴，成本較高，同時(shí)后續(xù)的分析技術(shù)較煩瑣[3]。

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)食品中的霉菌和酵母菌，待測(cè)的樣品經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾和離心去除雜質(zhì)，用無(wú)菌的生理鹽水進(jìn)行樣品的稀釋?zhuān)S后加入菌體提取液，將細(xì)菌進(jìn)行分離提取加入菌體保護(hù)液，隨后將混合菌液進(jìn)行過(guò)濾離心，棄去上清液，向沉淀中加入沉淀保護(hù)液，將提取液加入到流式細(xì)胞儀的樣品管中，進(jìn)行檢測(cè)，后續(xù)可進(jìn)行菌液的平板計(jì)數(shù)。

3 食品安全的質(zhì)量控制

3.1 人員控制

食品安全每一道關(guān)卡都至關(guān)重要，除了在質(zhì)檢方面需加強(qiáng)管理，工作人員更需要提高食品安全意識(shí)，并且對(duì)員工的安全意識(shí)進(jìn)行定期培訓(xùn)和考核，使食品企業(yè)的員工了解市場(chǎng)需要及自身所擔(dān)負(fù)的責(zé)任，提升員工的積極性和責(zé)任意識(shí)，加強(qiáng)工作人員、技術(shù)人員的綜合素養(yǎng)，積極發(fā)揮人員質(zhì)量在整個(gè)食品行業(yè)中的決定性作用[4]。

3.2 儀器控制

在食品質(zhì)量監(jiān)管過(guò)程中，儀器設(shè)備起著輔助的作用，食品企業(yè)也需要自查，在監(jiān)管過(guò)程中設(shè)置必需的儀器，儀器的質(zhì)量是確保食品質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)要求的保障，對(duì)比人工來(lái)說(shuō)具有更高的準(zhǔn)確性和安全性。運(yùn)用在食品生產(chǎn)、檢測(cè)的每一種設(shè)備的耗材都需要嚴(yán)格把控質(zhì)量，這是食品安全合格的首要保證。

3.3 監(jiān)管部門(mén)控制

食品問(wèn)題的出現(xiàn)在一定程度上有監(jiān)管部門(mén)的疏于防控的原因，食品安全體系的建立不夠完善。因此，監(jiān)管部門(mén)應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)市場(chǎng)的食品企業(yè)及時(shí)進(jìn)行監(jiān)管監(jiān)控，建立健全的食品安全預(yù)警體系、評(píng)估體系、交流體系。監(jiān)管部門(mén)質(zhì)量的良好把控對(duì)食品市場(chǎng)體系的穩(wěn)定運(yùn)行有關(guān)鍵作用，從而進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)市場(chǎng)的監(jiān)管[5]。

4 食品微生物檢測(cè)技術(shù)及其質(zhì)量控制的重要性

食品安全在人們的健康生活中起著保駕護(hù)航的作用，不但關(guān)乎人們的身體健康，也影響經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。近年來(lái)，隨著人們的生活品質(zhì)的不斷提高，食品安全也出現(xiàn)了諸多的問(wèn)題，食物中毒、食物過(guò)期、食物質(zhì)量不過(guò)關(guān)等一些問(wèn)題層出不窮，從嬰幼兒奶粉中的三聚氰胺到牛奶中的“水解皮革蛋白”，從食品中的地溝油到豬肉中的“瘦肉精”，一系列食品安全問(wèn)題的出現(xiàn)，使食品問(wèn)題已逐漸上升為社會(huì)問(wèn)題，食品安全問(wèn)題的解決迫在眉睫。

5 結(jié)語(yǔ)

隨著我國(guó)綜合實(shí)力的逐步提升，食品質(zhì)量與安全受到多方面的關(guān)注，嚴(yán)格把關(guān)食品安全，提升食品質(zhì)量相關(guān)檢測(cè)技術(shù)是食品行業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的重要保證。相關(guān)技術(shù)的提升和對(duì)質(zhì)量進(jìn)行把關(guān)，能夠有效保證食品質(zhì)量，是對(duì)消費(fèi)者權(quán)益和健康的負(fù)責(zé)，能夠加速我國(guó)在食品市場(chǎng)國(guó)內(nèi)外貿(mào)易中的發(fā)展。

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