白酒釀造微生物的生物多樣性歸納分析研究

馬 楠

（西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

白酒釀造過(guò)程中，微生物在酒曲、酒醅、窖泥中參與了淀粉或糖質(zhì)的糖化、發(fā)酵、產(chǎn)酯生香過(guò)程，因此微生物的生態(tài)分布情況、種群結(jié)構(gòu)狀態(tài)和代謝消長(zhǎng)過(guò)程直接影響發(fā)酵結(jié)果。同時(shí)，與風(fēng)味功能有關(guān)的微生物結(jié)構(gòu)決定了白酒的釀造質(zhì)量和香氣類別，是影響白酒香型的關(guān)鍵。深入研究白酒中微生物的多樣性可以更好地對(duì)白酒釀造技術(shù)進(jìn)行創(chuàng)新，提高白酒的釀造品質(zhì)、產(chǎn)量等。

我國(guó)進(jìn)入農(nóng)耕時(shí)代較早，掌握了多種糧食種植技術(shù)。大部分地區(qū)的氣候?yàn)橄挠甓伞Ｏ募镜挠炅枯^為集中且溫度較高、濕度較大，能夠給微生物提供較為適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。每年從6 月6 日到7 月19 日，我國(guó)南方大部分地區(qū)處于梅雨季節(jié)，此時(shí)間段內(nèi)釀酒所用的糧食水果等原料中更容易產(chǎn)生霉菌，氣候、濕度、溫度等自然條件均適合微生物的生長(zhǎng)，有利于人們成功釀造出各類美酒。

現(xiàn)階段，相關(guān)學(xué)者通過(guò)現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)白酒釀造過(guò)程中涉及的微生物情況進(jìn)行了詳細(xì)的研究。陳雪等對(duì)鳳香型白酒中的微生物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該種香型的白酒共含有細(xì)菌182 種，真菌32 種，且乳酸桿菌的種群數(shù)量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；詳細(xì)分析了白酒理化因子與微生物多樣性之間的關(guān)系，研究證明細(xì)菌多樣性和溫度之間呈負(fù)相關(guān)，還原糖和淀粉之間呈正相關(guān)的關(guān)系。崔鳳嬌等對(duì)芝麻香型白酒中的微生物多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵前期，白酒中的優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌，發(fā)酵后期，優(yōu)勢(shì)菌屬變成了乳桿菌，其次才是芽孢桿菌；在酵母方面，伊薩酵母為優(yōu)勢(shì)菌群，其次為假絲酵母和釀酒酵母。

本文以現(xiàn)有研究成果作為基礎(chǔ)，從酒曲、酒醅、窖泥3 個(gè)方面分析多種香型白酒釀造過(guò)程中的微生物多樣性，總結(jié)出微生物多樣性與理化指標(biāo)之間的關(guān)系，并將該關(guān)系應(yīng)用于多種釀酒工藝中，進(jìn)一步提高白酒的產(chǎn)量和品質(zhì)。

1 多香型白酒酒曲微生物多樣性分析

曲最早指的是發(fā)霉的谷物種子，經(jīng)過(guò)不斷地改良逐漸形成了“曲衣”的說(shuō)法，指的是含有霉孢子的糧食曲。酒曲在發(fā)展初期，微生物種類還較為單一，主要以米曲霉為主，其次為酵母菌。漢代后餅曲逐漸流行，餅曲能夠繁殖出的微生物種類更多，使得微生物組成也更加豐富，更具多樣性，此時(shí)酒曲中酵母菌也逐漸增多。后來(lái)釀酒者在酒曲中加入了一些草本植物使得各菌群的維生素營(yíng)養(yǎng)更充分，生成也更為旺盛，也就逐漸形成了現(xiàn)階段邊糖化邊發(fā)酵的復(fù)式發(fā)酵工藝。

微生物對(duì)脂肪和蛋白質(zhì)分解及其自身代謝而產(chǎn)生的分解物會(huì)影響酒曲中微生物的多樣性。與高等生物相比，微生物的地域分布特征不明顯，但是更容易隨著氣流運(yùn)動(dòng)。因此酒曲中微生物大多數(shù)來(lái)源于釀造環(huán)境、保溫蘆葦?shù)?，或者是由各種釀造原料帶入的，主要以細(xì)菌和酵母菌為主。

從濃香型、醬香型、清香型3 種香型白酒的釀造過(guò)程出發(fā)，總結(jié)酒曲中微生物的變化情況。經(jīng)過(guò)歸納研究分析，三者釀造環(huán)境中的微生物種類大致相同，但由于制曲工藝和釀造原料的不同，酒曲中的微生物種類存在細(xì)微差異。

2.1 濃香型白酒酒曲微生物分析

對(duì)現(xiàn)階段最為大眾所熟悉的濃香型白酒——瀘州老窖的酒曲微生物進(jìn)行研究。常用的方法有克隆文庫(kù)方法單獨(dú)分析成品酒曲微生物組成，也可以與其他方法相結(jié)合研究酒曲不同位置細(xì)菌和真菌組成的差異。與傳統(tǒng)的研究方法相比，克隆文庫(kù)可以獲得更加豐富的多樣性信息。

據(jù)研究報(bào)道，將瀘州老窖同一批次質(zhì)量不同的3 種高溫大曲，根據(jù)顏色由深到淺分別記為F1、F2、F3。該酒廠夏天濃香型白酒生產(chǎn)堆積的時(shí)間是32 h 左右，在堆積過(guò)程中跟蹤取樣。取樣時(shí)從兩端及中間取樣并混勻，并記錄取樣時(shí)的溫度。觀察樣品酒曲在發(fā)酵過(guò)程中各微生物的消長(zhǎng)變化情況如下：

樣品酒的酒曲中根霉較多，曲霉次之，優(yōu)質(zhì)曲中紅曲霉也相對(duì)較多。這是因?yàn)闉o州老窖的酒曲配置溫度最高不超過(guò)55 ℃，因此霉菌和酵母菌存活率較高，酒曲中兩種菌屬的含量也就相對(duì)較高。

2.2 醬香型白酒酒曲微生物分析

醬香型白酒主要選取醬香高溫大曲進(jìn)行研究。研究方法與濃香型白酒相同。酒曲在發(fā)酵過(guò)程中微生物變化情況如下：

醬香高溫大曲中除了存在根霉、曲霉兩種霉菌以外，還存在少部分耐高溫霉菌，細(xì)菌數(shù)量占優(yōu)勢(shì)，大致有97.6%，霉菌占據(jù)2.3%，而酵母菌不容易被檢測(cè)出來(lái)。

這是因?yàn)楦邷刂魄侵谱麽u香型白酒的主要技藝，在其酒曲制作過(guò)程中微生物生長(zhǎng)會(huì)釋放大量的熱量，導(dǎo)致曲塊的溫度能夠達(dá)到60 ℃以上，而大多數(shù)霉菌和酵母菌在如此高的溫度下都難以存活，因此醬香高溫大曲中霉菌和酵母菌的含量極少。

2.3 清香型白酒酒曲微生物分析

汾酒是清香型白酒的代表，因此以汾酒為例分析清香型白酒在釀造過(guò)程中酒曲微生物的變化情況，相關(guān)研究結(jié)果如下：

汾酒酒曲中的細(xì)菌分布情況與瀘州老窖較為相似，均含有較多的乳酸菌、醋酸菌及芽孢桿菌。汾酒的酒曲配置溫度最高不超過(guò)50 ℃，因此霉菌和酵母菌存活率較高，酒曲中兩種菌屬的含量也就相對(duì)較高。大曲樣品中細(xì)菌和芽孢桿菌的數(shù)量較高，其中芽孢桿菌的數(shù)量較高，該種大曲的“穿衣”效果較為明顯。大曲的“穿衣”一般是微生物尤其是霉菌生長(zhǎng)好壞的外在表現(xiàn)特征，由于霉菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中可產(chǎn)生糖化酶、液化酶、蛋白酶、纖維素酶等多種酶類，所以霉菌的生長(zhǎng)繁殖狀況對(duì)各種酶活力有很大的影響。

此外由于白酒酒曲大部分是靠天然接種培制的，往往也會(huì)存在一些不利于釀造的微生物，如上述3 種研究對(duì)象中均檢測(cè)出了一些犁頭霉，根據(jù)多年釀造經(jīng)驗(yàn)可以判斷該類霉菌會(huì)對(duì)酒的釀造質(zhì)量產(chǎn)生一定的負(fù)面影響，例如：如果汾酒的酒曲中含有較多的犁頭霉就會(huì)產(chǎn)生微弱苦味。

3 多香型白酒酒醅微生物多樣性分析

酒醅的微生物區(qū)系較為復(fù)雜，是釀酒過(guò)程中研究微生物多樣性的重要對(duì)象。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，微生物代謝形成的不同酶菌會(huì)引起一系列的生化反應(yīng)，使得白酒形成不同風(fēng)味，因此本文對(duì)不同風(fēng)味白酒糟醅中的微生物進(jìn)行分析。

現(xiàn)階段，利用DGGE 指紋圖譜可以比較直觀的觀察微生物菌落的變化，常結(jié)合圖像分析軟件，計(jì)算微生物群落的多樣性指數(shù)及聚類分析。利用DGGE 研究酒醅微生物群落組成的變化，分析與微生物生長(zhǎng)環(huán)境理化因子以及白酒質(zhì)量相關(guān)的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)變化的關(guān)系，對(duì)于揭示白酒的釀造機(jī)理有十分重要的意義。

3.1 濃香型白酒酒醅微生物分析

通過(guò)現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)對(duì)濃香型白酒酒糟中的真核和原核生物進(jìn)行研究。分析微生物生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化和分布情況后得出如下結(jié)論：大多數(shù)細(xì)菌都在上層酒醅中，只有酵母菌在底層的酒醅中，且霉菌在酒醅中含量較少。

白酒發(fā)酵初期，酵母菌、堿性厭氧細(xì)菌和霉菌的菌群數(shù)量會(huì)大幅度增加。隨著發(fā)酵的不斷深入，各類菌群數(shù)量均有所降低。發(fā)酵中期，細(xì)菌、酵母會(huì)逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌群。發(fā)酵后期，酵母菌種總量減少，直至不能被檢測(cè)出來(lái)，數(shù)量接近于零。而芽孢桿菌會(huì)逐漸增多。

通過(guò)對(duì)微生物16S rRNA 序列的同源性進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)糟醅中的原核生物主要是古細(xì)菌，如真菌、甲烷囊菌以及甲烷螺桿菌等。

有文獻(xiàn)對(duì)現(xiàn)階段最為大眾所熟悉的濃香型白酒——瀘州老窖進(jìn)行研究。白酒窖內(nèi)中層中心和周圍的糟醅，在發(fā)酵過(guò)程中各細(xì)菌的消長(zhǎng)變化情況如下：剛?cè)虢褧r(shí)期，微生物的多樣性較高，發(fā)酵7 d后細(xì)菌種類減少，且嗜酸乳桿菌成為優(yōu)勢(shì)菌群。發(fā)酵一個(gè)月時(shí)，散囊菌屬與曲霉菌屬代替了嗜酸乳桿菌成為優(yōu)勢(shì)菌群，實(shí)驗(yàn)前被認(rèn)為大量存在的酵母屬僅在發(fā)酵一周后的糟醅中層邊緣處微量存在，這表明了酵母屬在瀘州老窖的釀造過(guò)程中不是主要菌屬，這是因?yàn)闉o州老窖在釀造過(guò)程中使用了回酒蒸餾技術(shù)，給嗜酸乳桿菌的大量產(chǎn)生提供了時(shí)機(jī)。

不同的釀造環(huán)境所產(chǎn)生的微生物也略有差異，與上文瀘州老窖相似的濃香型酒——習(xí)酒和全興酒的酒糟中也以乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌群，而宜賓多糧酒的酒糟中優(yōu)勢(shì)菌則有所不同，主要是以芽孢桿菌為主。此外全興酒的優(yōu)勢(shì)菌群除了與瀘州老窖相同的曲霉菌屬、伊薩酵母菌群以外還有酵母菌屬、犁頭菌屬以及復(fù)膜孢子酵母菌屬。這是由于全興酒多釀造于盛夏，所以在發(fā)酵初期檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)菌多數(shù)為未培養(yǎng)菌以及通常分布于土壤中的魏斯氏菌屬。

3.2 醬香型白酒酒醅微生物分析

醬香型白酒與濃香型白酒存在一定差異，醬香型白酒的酒醅表現(xiàn)在兩個(gè)方面，分別為窖內(nèi)發(fā)酵酒醅和高溫堆積酒醅。醬香型白酒異于其他香型白酒的釀造工藝，使得酒醅中的微生物區(qū)系較為特殊，這也在一定程度上給微生物多樣性的研究增加了難度。

醬香型白酒的高溫制曲工藝導(dǎo)致大量酵母菌死亡。酒醅堆積的過(guò)程中，微生物又被網(wǎng)羅其中，再次增加了微生物的多樣性。

據(jù)研究報(bào)道，醬香型白酒在酒醅堆積過(guò)程中，酵母菌的數(shù)量會(huì)快速升高，細(xì)菌的數(shù)量隨之降低，且隨著堆積輪次的增多酒醅中的總菌群數(shù)量會(huì)逐漸降低。在窖內(nèi)發(fā)酵過(guò)程中，各類細(xì)菌和酵母菌都會(huì)不斷減少。發(fā)酵后期，乳酸菌會(huì)逐漸減少，直至無(wú)法被檢測(cè)出來(lái)。醬香型白酒的制曲溫度一般在50 ℃左右，酒醅中的細(xì)菌也以中溫嗜熱菌為主，多為芽孢桿菌屬，還有少量葡萄球菌屬，酵母菌主要為假絲酵母、裂殖酵母屬。

在醬香型白酒冬季生產(chǎn)過(guò)程中，堆積的酒醅內(nèi)部或表層處會(huì)出現(xiàn)星白色或微黃色的團(tuán)狀物，一般帶“霉味”，且酒醅干燥，下窖時(shí)酒精味較濃。這種現(xiàn)象稱為“腰線”。有研究采用稀釋涂布法對(duì)不同腰線酒醅樣品的酵母與霉菌進(jìn)行分離，培養(yǎng)基稀釋度分別為10、10、10，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。3 d 后按平板計(jì)數(shù)法對(duì)酵母菌計(jì)數(shù),并對(duì)不同形態(tài)菌株進(jìn)行分離與純化。7 d 后，按同樣方法對(duì)霉菌菌落計(jì)數(shù)與分離。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在該過(guò)程中細(xì)菌數(shù)量和種類的比例有所下降，而酵母菌數(shù)量和種類的比例不斷增多。窖內(nèi)發(fā)酵初期細(xì)菌的總量下降，酒醅的中上層酵母菌減少。發(fā)酵中期，細(xì)菌數(shù)量會(huì)有小幅度的回升，下層的酵母菌數(shù)量會(huì)迅速增多，隨后又緩慢降低。霉菌的數(shù)量在發(fā)酵初期慢慢減少，中期時(shí)會(huì)有所回升，之后基本保持穩(wěn)定。

3.3 鳳香型及清香型白酒酒醅微生物分析

汾酒為清香型白酒的代表，其生產(chǎn)過(guò)程實(shí)質(zhì)為霉菌、酵母菌、細(xì)菌互相作用的結(jié)果。通過(guò)模擬汾酒的發(fā)酵過(guò)程發(fā)現(xiàn)其主要功能菌為細(xì)菌和酵母菌。乳酸乙酯是清香白酒的主要香氣成分，其比例略低于乙酸乙酯。夏季溫度升高時(shí)，釀酒環(huán)境中乳酸菌數(shù)量迅速增加，乳酸菌代謝產(chǎn)物——乳酸，經(jīng)過(guò)酯化作用合成乳酸乙酯，導(dǎo)致乳酸乙酯和乙酸乙酯的比例失衡。

另外據(jù)有關(guān)報(bào)道，汾酒酒醅大米查、二米查中的菌群數(shù)量在發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)了二次生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)過(guò)程不完全一致。發(fā)酵初期時(shí)，大米查中的乳酸菌數(shù)量比二米查要多，還存在較少的霉菌，發(fā)酵至中期時(shí)，二米查的酵母數(shù)量多于大米查，發(fā)酵后期時(shí)大米查逐漸增多的微生物主要為細(xì)菌，而二米查中除了細(xì)菌變多以外酵母菌數(shù)量也逐漸上升。

在發(fā)酵過(guò)程中，微生物種群的變化情況鳳型與清香型大致相同，存在差異的地方是鳳香型白酒的酒醅中含有較多的放線菌，尤其是在發(fā)酵的中期和末期，糟醅中的數(shù)量最多。

4 白酒窖泥微生物多樣性分析

來(lái)自操作環(huán)境、窖泥、酒曲等處的各種微生物在酒糟和窖泥中演變、遷徙、能量變換，形成了窖池的微生物區(qū)系。各區(qū)系達(dá)到平衡，意味著固態(tài)階段發(fā)酵完成。

通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)窖池中微生物的多樣性和釀造環(huán)境的微生態(tài)有很大關(guān)系，微生物的多樣性是窖池中微生態(tài)系統(tǒng)的一部分。釀酒物質(zhì)的能量代謝與微生物的消長(zhǎng)共同促進(jìn)窖池的生態(tài)演變，因此分析釀酒窖池中微生物的多樣性，能夠給微生物工業(yè)應(yīng)用提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。

窖泥是釀造白酒過(guò)程中微生物的棲息環(huán)境，其中不同種類的微生物會(huì)不斷演替代謝，在發(fā)酵的整個(gè)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)非常明顯的多態(tài)性。窖泥中的環(huán)境也較為特殊，其乙醇含量較高，pH 值和氧含量較低，導(dǎo)致了微生物群落結(jié)構(gòu)也更具多樣性。窖泥是各功能菌的繁殖載體，直接與白酒香味的形成相關(guān)。張應(yīng)剛等分別檢測(cè)瀘州老窖5 年、30 年、100年、300 年窖泥中的微生物后，結(jié)果表明，5 年窖齡的窖泥中優(yōu)勢(shì)菌屬分別為根霉屬、孢子菌屬；100年窖齡的窖泥中優(yōu)勢(shì)菌屬分別為曲霉屬、假絲酵母屬；300年窖泥中的古細(xì)菌主要是廣域古菌，占總菌數(shù)的9.2 %～16.5 %；30 年的窖泥中廣域古菌占總菌數(shù)的0.6 %，相較于300 年窖泥含量更低。30 年窖泥中的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門，占總數(shù)的90 %以上，厚壁菌門中又以乳酸菌屬為主，約占總數(shù)的92 %以上；而在300 年窖中厚壁菌門也為優(yōu)勢(shì)菌門，占比在43 %以上，也以乳酸菌為主，但是僅占總數(shù)的20 %左右。此外，30 年窖泥中還存在梭菌屬和甲烷共生梭菌屬，分別占總數(shù)的21 %和2.7%。300 年窖泥中也存在以上兩種菌屬，但是占比少，分別為2.5 %和0.36 %。從以上分析可以看出，年限不同的白酒窖泥微生物菌落結(jié)構(gòu)也不同，而對(duì)于不同類型的白酒，窖泥微生物菌落結(jié)構(gòu)也不同，在白酒窖泥微生物多樣性分析中，湯溝白酒退化窖泥、普通窖泥、優(yōu)質(zhì)窖泥中的微生物菌落結(jié)構(gòu)具有典型性。退化窖泥中的優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬；普通窖泥中的優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬、甲烷共生梭菌屬等；優(yōu)質(zhì)窖泥中的優(yōu)勢(shì)菌屬主要為乳桿菌屬、梭狀芽胞桿菌、甲烷共生梭菌屬等。隨著窖泥質(zhì)量的提升，乳酸桿菌屬的質(zhì)量逐漸減少，梭狀芽胞桿菌、類桿菌、甲烷諾桿菌等菌群逐漸增多，這就表明后3 種菌屬能夠在一定程度上提高窖泥質(zhì)量。此外在分析的過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)較高的乳酸含量和有機(jī)磷含量、低pH 值可能為窖泥質(zhì)量發(fā)生退化的主要外因。

5 小結(jié)

在白酒釀造過(guò)程中酵母菌以釀酒酵母、生香酵母等參與發(fā)酵。其中釀酒酵母的產(chǎn)醇能力最強(qiáng)，生香酵母具有強(qiáng)大的糖化、酒化、產(chǎn)酯能力，能夠增加酒醅中的酯類物質(zhì)含量，使白酒呈現(xiàn)出不同的香味。

常見(jiàn)的細(xì)菌有乙酸菌、乳酸菌、丁酸菌、醋酸菌。乳酸菌會(huì)促進(jìn)釀酒原料中的發(fā)酵糖類轉(zhuǎn)化為乳酸，乳酸酯化后形成乳酸乙酯。乳酸乙酯為白酒產(chǎn)生香味的主要物質(zhì)之一，但是若含量過(guò)高也會(huì)使酒體有悶頭的口感。醋酸也是白酒的主要生香物質(zhì)，但是含量過(guò)多會(huì)導(dǎo)致白酒中有刺激性酸味出現(xiàn)。乙酸菌和丁酸菌多分布在窖泥中，是生香物質(zhì)乙酸乙酯和丁酸乙酯的前體。實(shí)際參與釀造的微生物還有很多，總體來(lái)說(shuō)微生物的多樣性越高，則白酒的口感就越為豐富，品質(zhì)也就越高。因此，在釀酒的過(guò)程中需要嚴(yán)格控制以上幾種酵母和細(xì)菌的含量，使白酒的品質(zhì)和口感更佳。

本文對(duì)白酒釀造中微生物的多樣性進(jìn)行了歸納研究，以瀘州老窖、茅臺(tái)、汾酒等不同釀造環(huán)境下的白酒作為分析目標(biāo)，分別闡述不同香型白酒釀酒微生物多樣性的變化情況，總結(jié)出相關(guān)規(guī)律。若這些微生物的相關(guān)研究成果能實(shí)際應(yīng)用于傳統(tǒng)釀酒工藝中，必將能進(jìn)一步提高白酒的釀造品質(zhì)。