徐方飚， 趙 哲， 謝 抗， 王新志

(1.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450000；2.廣東藥科大學中醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006；3.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

再灌注損傷存在于心腦血管、肝腎臟、子宮移植等疾病變化過程中[1-4]，是缺血后恢復血流，使得相關組織細胞在再灌注過程中進一步受到的損傷[5]。在心血管疾病中，由于再灌注后改變了血管內皮細胞結構，使得血管消除阻塞后仍不能完全實現組織血液灌注，嚴重時可表現為心肌功能障礙、血流微循環(huán)障礙等危及生命的病理現象。在腦缺血再灌注中，大量免疫細胞會在損傷部位聚集，并在短時間內大量釋放細胞分裂素和氧自由基等物質，能夠直接損傷內皮細胞，從而造成內皮結構和功能的損傷[6]，肝臟中再灌注損傷病理機制根據目前研究主要在無氧代謝、氧化應激等方面[7]，腎臟中病理機制如內皮細胞損傷、炎癥反應等[8]。中藥對于減輕缺血再灌注損傷是全面的，含括減少自由基、控制炎癥反應等等多方面[9-10]。

中藥在再灌注損傷中的病理機制已有一定的基礎，涉及通路[11]、抗氧化、抗神經細胞凋亡[12]、藥代動力學[13]等方面。本研究旨在通過現有知識結構及數據庫構建缺血再灌注損傷機制核心靶點與中藥成分及中藥的網絡關系，利用數學思維幫助基礎實驗及臨床上中藥選擇，補充中醫(yī)基礎理論的現代醫(yī)學證據以及開拓新藥研發(fā)思路。

1 材料與方法

1.1 再灌注損傷靶點獲取 通過檢索文本挖掘數據庫、Genecards數據庫(https://www.genecards.org/)、Disgenet數據庫(https://www.disgenet.org/)，以“reperfusion injury”為檢索詞，獲取再灌注損傷相關靶點，并作取交集處理，作為關鍵靶點。取交集的做法能夠一定程度的緩解不同數據庫信息不對等的狀況，并對獲得關鍵靶點輸入Unipot數據庫(https://www.uniprot.org)由Gene symbol轉換成蛋白名稱。

1.2 蛋白互作網絡構建及篩選核心靶點 將關鍵靶點輸入STRING數據庫(https://string-db.org)中，蛋白種類設置為智人(Homosapiens)，證據評分(minimum required interaction score)選取最高評分0.9分，獲取蛋白相互作用關系。將獲取的蛋白互作網絡(protein protein interaction network，PPI)輸入Cytoscape 3.7.2軟件中可視化呈現及拓撲分析后獲取核心靶點。

1.3 構建“化合物-核心靶點”網絡 檢索TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，收集與核心靶點相關的化合物，并以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug likeness，DL)≥0.18篩選化合物后[14-16]，導入Cytoscape 3.7.2軟件中構建“化合物-核心靶點”網絡，同時保存化合物對應中藥及化合物分子結構。

1.4 構建“核心靶點-化合物-中藥”網絡 通過Cytoscape 3.7.2軟件中的Merge插件融合“核心靶點-化合物”和“化合物-中藥”網絡，最終可視化“核心靶點-化合物-中藥”網絡。

1.5 核心靶點與化合物對接驗證 在RCSB PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)中檢索并下載核心靶點3D結構，利用Autodock 4.2.6軟件進行分子對接，進一步評估核心靶點與化合物之間的聯系[17]。

1.6 數據挖掘 參照“十二五”規(guī)劃教材《中藥學》[18]及2020年版《中國藥典》，獲取核心靶點對應中藥的性味歸經，利用Origin 2019b繪圖軟件繪制柱狀圖、散點圖和條形圖。

2 結果

2.1 再灌注損傷靶點篩選 經過Genecards數據庫和Disgenet數據庫檢索、比對后，共獲得85個關鍵靶點，見圖1。

2.2 蛋白互作網絡構建及核心靶點篩選 為了明確85個關鍵靶點中的核心靶點，利用STRING數據庫獲取關鍵靶點的PPI網絡，并導入Cytoscape 3.7.2軟件可視化后利用Cytohubba 0.1插件對網絡拓撲分析，以獲取度值不小于中位數2倍，即度值不小于18的靶點為核心靶點。共獲得6個核心靶點，按度值從大到小依次為STAT3(度值26)、JUN(度值24)、TNF(度值24)、RELA(度值19)、IL1B(度值19)、IL6(度值18)，見圖2。圖中關鍵靶點蛋白互作網絡黃色節(jié)點為核心靶點蛋白互作網絡，節(jié)點顏色越紅則靶點度值越高。

2.3 “化合物-核心靶點”網絡構建 通過對TCMSP數據庫的全面檢索，共得到41個經口服利用度和類藥性篩選后的化合物與6個核心靶點相對應，將對應關系導入Cytoscape 3.7.2軟件構建“化合物-核心靶點”網絡，見圖3。圖中核心靶點為菱形，化合物為六邊形節(jié)點，節(jié)點大小以該節(jié)點度值為標準，即度值越大，節(jié)點越大。

2.4 構建“核心靶點-化合物-中藥”網絡 為了更好的了解中藥與成分與靶點之間的聯系，利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“核心靶點-化合物-中藥”網絡圖，見圖4。由于中藥數量較大，不便于觀察，節(jié)選中藥度值不小于4的中藥進行網絡構建。6個靶點度值代表所對應的成分個數，依次為轉錄因子p65(RELA，度值26)、腫瘤壞死因子(TNF，度值19)、轉錄因子AP-1(JUN，度值14)、白介素6(IL6，度值12)、白介素1β(IL1B，度值7)、信號轉導子和轉錄激活子3(STAT3，度值4)。度值排名前5的成分為β-谷甾醇(MOL000358，度值246)、槲皮素(MOL000098，度值193)、山柰酚(MOL000422，度值136)、木犀草素(MOL000006，度值97)、異鼠李素(MOL000354，度值41)，41個化合物信息見表1。中藥度值不小于5的有45個，條形圖見圖5。

表1 化合物信息及度值

2.5 分子對接結果 通過TCMSP數據庫獲取41個成分結構，利用RCSB PDB數據庫獲取STAT3、TNF、JUN、IL1B、RELA、IL6分子結構，pymol 2.3.1去除水分子和自身配體，AutoDockTools-1.5.6軟件進行分子對接。小分子化合物與蛋白之間相互作用的強度可用結合力(Affinity)表示，Affinity值越低，結合力越強[19]。若結合力<0 kcal/mol，表明配體分子能與受體蛋白進行自發(fā)的結合[20]。結合力熱圖見圖6，圖中顏色越紅則結合力越強。聚類歸整后，STAT3與41個成分整體結合力較高，IL1B與RELA較為相似，IL6與TNF較為相似，故這兩組聚類在一起，JUN則整體最低。為了更好地展現各靶點分子結構，在這6個靶點中選取各自結合力最強的，展示其結合構象的2D與3D展示圖像，見圖7。構象2D圖中，鏈接的紅色虛線為疏水作用，綠色虛線氫鍵作用，字母代表結合位點的氨基酸，氫鍵作用力與氨基酸殘基之間的疏水作用力是結合穩(wěn)定的主要存在。

2.6 中藥性味歸經頻數統(tǒng)計 共收集381味中藥，大部分中藥均有入肝經的功效，苦、寒藥居多，見圖8～9。中醫(yī)在治療時的理念是整體論治，而本研究對象為再灌注損傷，其可以出現在全身多個部位，同時本次統(tǒng)計結果包含所有十二正經，符合疾病本身病理特性，符合中醫(yī)整體論治的理念。歸三焦經的兩味中藥分別是香附與梔子，同時，這2味中藥的度值分別為5、3，成分中與香附有聯系的為MOL000006、MOL000098、MOL000354、MOL000358、MOL000422，與梔子有聯系的為MOL000098、MOL000358、MOL000422。所含成分根據TCMSP數據庫可調控除STAT3外的5個核心靶點，但通過分子對接顯示，它們與STAT3靶點的結合力較好，不排除結合的可能性，有待進一步驗證。

3 討論

再灌注損傷可以發(fā)生在全身各個臟器中，造成的連鎖反應給予疾病恢復等各方面一定程度的打擊。目前，對于再灌注損傷的機制研究趨于完善，治療上受限于發(fā)病機制較多，結合患者個人體質原因復雜，西藥的單一成分、單靶點及常規(guī)輸液治療方式起到的治療效果有限。中藥中成分多，多靶點多通路，同時對多種發(fā)病機制的共同干預，治療方式以口服湯藥為主要，并且已有一定的臨床療效及病理基礎研究[21-22]。本研究通過符合中藥多靶點多機制干預特性的網絡藥理學方法，構建靶點到中藥成分之間關系網絡，經過分析統(tǒng)計后，總結出中藥在減少再灌注損傷的用藥規(guī)律。

白果、菊花、葫蘆巴、木蝴蝶和山豆根調控多個再灌注損傷的核心靶點?，F代藥理學對于白果，既銀杏成熟種子的基礎研究較多，發(fā)現其具有抗氧化作用，在神經系統(tǒng)疾病中研究與應用較多，能夠促進腦部供血，改善癡呆患者學習記憶能力，同時能夠減少腦組織損傷，保護神經功能[23]。菊花中多成分[24]、多部位[25]均具有抗氧化作用，張永利等[26]發(fā)現，在抗視網膜缺血再灌注損傷的兔模型中，菊花通過影響SOD、MDA活性，從而達到減少再灌注損傷的功效。就成分而言，多成分已發(fā)現具有抗氧化作用，如槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素[27-30]。

本研究對6個核心靶點及41種成分進行高通量的分子對接模擬，結合能熱圖顯示，它們均有良好對接，并且達到具有一定的結合活性標準。其中STAT3與41種成分整體對接活性較高，但目前關于此靶點的中藥作用機制研究較少，TCMSP數據庫中僅有4種成分、8味中藥證實能夠調節(jié)此靶點，同時STAT3是PPI網絡中度值最高的靶點，提示其可作為潛在有效的治療靶點。STAT3在心臟、大腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎臟和胰腺均有表達，是信號轉導子和轉錄激活子，能夠介導細胞對白介素和一些列生長因子的反應[31]。JUN與41種成分結合整體偏低，考慮與JUN自身蛋白結構有關，其蛋白結構是長條型蛋白，空間交錯較少，這意味著與小分子的結合均在蛋白結構的表面結合。結合力熱圖中，花生四烯酸與6個核心靶點結合力均處于勉強能夠結合的狀態(tài)，與自身復雜結構一定關系。花生四烯酸可調節(jié)多種炎癥因子表達，同時其代謝通路亦影響多種炎性因子水平[32]。任越等[33]利用藥效團模型，基于花生四烯酸代謝通路匹配出適合應用于抑制炎癥風暴的藥物，與本研究中的成分多數重合。

中醫(yī)認為肝藏血，再灌注損傷相關中藥歸肝經居多，基于此，本研究認為藥物代謝與這中間具有一定的聯系。目前有研究表明，藥物代謝與肝藥酶有關，亦可從此角度來探討中藥歸經的物質基礎。此外，歸經頻數統(tǒng)計發(fā)現，大多數中藥亦涉及肺經，肺主治節(jié)，朝百脈，具有宣發(fā)和肅降的作用。肝與肺均對全身氣血運行起到重要調節(jié)作用，再灌注損傷發(fā)生的場所大多處于脈內，氣攝血于脈內，肝臟與肺是人體氣機，提示再灌注損傷中的物質基礎與中醫(yī)中氣概念的存在一定的聯系。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學技術，以再灌注損傷相關靶點作為出發(fā)點，探尋中藥減少再灌注損傷的潛在物質基礎及一般應用規(guī)律，為中醫(yī)理論現代化研究提供了新的切入點，也為進一步基礎研究深入開發(fā)可減少再灌注損傷的天然制劑提供思路，還可為中西醫(yī)結合治療再灌注損傷的用藥提供借鑒。