李濤，馮翰杰，楊梅，張軍

（天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300392）

蘋果營養(yǎng)豐富，富含礦物質(zhì)和維生素，是一種低熱量水果，每100克蘋果只產(chǎn)生251.15 kJ熱量，對美容和減肥具有一定的功效[1-3]。蘋果酒以蘋果為主要原料，經(jīng)破碎、軟壓取汁、控溫發(fā)酵、陳釀等工藝釀制而成[4]。蘋果酒營養(yǎng)豐富，除了含有蘋果中的營養(yǎng)物質(zhì)外，還具有低溫發(fā)酵生成的酸類、酯類以及蛋白質(zhì)類等有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)。研究表明，經(jīng)常飲用果酒能軟化血管、降低血脂、促進(jìn)人體新陳代謝和美容等功效[5]。

隨著人們生活水平的提高，對酒類的消費(fèi)需求越來越趨向理性化、個(gè)性化、多樣化，包括蘋果酒在內(nèi)的有特色、營養(yǎng)健康的果酒越來越受到消費(fèi)者的青睞[6]。但由于蘋果酒中含有較多的酚類、蛋白質(zhì)、果膠等物質(zhì)，在運(yùn)輸、加工和貯存過程中容易產(chǎn)生沉淀，酒體渾濁，造成酒品質(zhì)下降[7-8]。為提高蘋果酒的品質(zhì)，使蘋果酒獲得良好風(fēng)味的同時(shí)，能夠保持較長時(shí)間的穩(wěn)定，本試驗(yàn)采用單因素及響應(yīng)面法對蘋果酒的澄清工藝進(jìn)行研究，測定蘋果酒澄清處理前后的酒精度、總酸、總糖、透光率及感官評分，以探討適合蘋果酒澄清的最佳條件[9-10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果，山西紅富士；F15酵母、皂土，法國Laffort公司；果膠酶，河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；亞硫酸，天津科茂化工試劑有限公司；白砂糖，北京糖業(yè)煙酒集團(tuán)有限公司；交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、明膠，實(shí)驗(yàn)室提供；蛋清粉，安徽省亳州市眾意蛋業(yè)有限責(zé)任公司。以上試劑均為食品級。

1.2 儀器與設(shè)備

L系列紫外可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；TD5002A電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；TGL-16C高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.3 澄清劑的配制

皂土溶液：稱取0.5 g皂土，用蒸餾水溶解并定容至50 mL，浸泡12～24 h，使皂土完全膨化，配制成1%的皂土溶液，備用。

PVPP溶液：稱取0.5 g PVPP，用蒸餾水溶解并定容至50 mL，配制成1%的PVPP溶液，備用。

蛋清粉溶液：稱取0.5 g蛋清粉，用蒸餾水溶解并定容至50 mL，配制成1%的蛋清粉溶液，備用。

明膠溶液：稱取1 g明膠，加入100 mL蒸餾水，浸泡24 h后去掉雜質(zhì)，加熱煮沸至明膠全部溶解，配成1%的明膠溶液，降至室溫，備用。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 蘋果酒的釀造

精選原料：挑選無污染、無破損、成熟度好的大果。

破碎取汁：將挑選好的蘋果用清水洗去表面的雜質(zhì)及泥土，控干水分，用榨汁機(jī)進(jìn)行破碎，將自流汁收集并及時(shí)加二氧化硫（40 mg/L），密封處理，防止蘋果汁褐變氧化。

酶解澄清：將收集好的蘋果汁添加 0.02 g/L果膠酶，低溫酶解12～15 h，酶解后分離上清液，用白砂糖調(diào)整糖度為220 g/L。

接種酵母：酵母添加量為0.2 g/L，將稱量好的活性干酵母于37 ℃水浴鍋中活化25 min，加至蘋果汁中并攪拌。

控溫發(fā)酵：將接種酵母的蘋果汁置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)還原糖含量低于4 g/L時(shí)，終止發(fā)酵。

自然澄清：將發(fā)酵結(jié)束的蘋果酒沉淀分離，倒入新罐中滿罐陳釀，進(jìn)行澄清。

1.4.2 蘋果酒最佳澄清波長的確定

取陳釀好的蘋果酒10 mL于離心管中，5 000 r/min離心5 min，以蒸餾水為空白對照，測定300～800 nm波長下蘋果酒的透光率，繪制曲線，確定蘋果酒最佳澄清波長。

1.4.3 不同澄清劑對蘋果酒澄清效果的影響

取25 mL比色管24支，每支加入20 mL蘋果酒，分成4組，每組分別加入不同質(zhì)量濃度的皂土、PVPP、明膠和蛋清粉溶液，放入 15 ℃恒溫箱中澄清3 d，取上清液測其透光率，研究不同澄清劑對蘋果酒澄清效果的影響。

1.4.4 溫度對蘋果酒澄清效果的影響

取25 mL比色管6支，每支加入20 mL蘋果酒和1 g/L皂土溶液，放至溫度為5、10、15、20、25、30 ℃的環(huán)境中澄清，3 d后取上清液測其透光率，研究溫度對蘋果酒澄清效果的影響。

1.4.5 澄清時(shí)間對蘋果酒澄清效果的影響

取25 mL比色管6支，每支加入20 mL蘋果酒和1 g/L皂土溶液，在10 ℃條件下，分別靜置12、24、36、48、60、72 h后取上清液測其透光率，研究澄清時(shí)間對蘋果酒澄清效果的影響。

1.4.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)，選擇皂土為最佳澄清劑進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，以皂土添加量（A）、澄清溫度（B）、澄清時(shí)間（C）3個(gè)因素為自變量，透光率為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Behnken中心組合的方法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，構(gòu)建二次回歸方程數(shù)學(xué)模型，對蘋果酒澄清工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用 Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)與分析，使用Excel 2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 理化指標(biāo)檢測

蘋果酒中糖度、酸度、酒精度的測定和感官評價(jià)方法參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果酒透光率最佳檢測波長的確定

由圖1可知，隨著檢測波長的不斷增加，蘋果酒的透光率也隨之增加，當(dāng)波長為640 nm時(shí)，透光率達(dá)到最大值，為 99.9%，之后隨波長的不斷增加，透光率基本保持不變。因此，確定檢測蘋果酒透光率的最佳波長為640 nm。

圖1 蘋果酒透光率曲線

2.2 澄清劑對蘋果酒澄清效果的影響

由圖2可知，4種澄清劑對蘋果酒均有澄清效果，其透光率值均大于未經(jīng)澄清處理的蘋果酒原酒（T＝79.8%）。在相同試驗(yàn)條件下，皂土澄清效果優(yōu)于其他3種澄清劑。從圖2 a可以看出，隨著皂土添加量的增加，蘋果酒透光率呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)皂土添加量為1.0 g/L時(shí)，透光率達(dá)到最大值，為99.7%，當(dāng)用量超過1.0 g/L時(shí)，透光率反而有所下降。這時(shí)酒體中產(chǎn)生了白色絮狀物，這是由于皂土吸水膨脹后形成的膠體懸浮液帶負(fù)電，與酒體中帶正電的蛋白質(zhì)、單寧和金屬離子等物質(zhì)相互吸引，產(chǎn)生絮狀沉淀，使酒體得以澄清，當(dāng)皂土添加量大于1.0 g/L時(shí)，蘋果酒中帶正電的物質(zhì)被全部吸附，過量的皂士又會形成新的絮狀物，使蘋果酒的透光率逐漸降低[11]。從圖2 b、2 c、2 d可以看出，PVPP、明膠、蛋清粉3種澄清劑對蘋果酒均有一定的澄清作用，隨著澄清劑用量的增加。其透光率值也隨之增加，但透光率均小于皂土澄清的蘋果酒透光率，當(dāng)透光率達(dá)到最大值之后，隨著澄清劑添加量的增加，透光率值逐漸降低，這主要是由于不同澄清劑的作用機(jī)理不同而導(dǎo)致[12-13]。因此，在本試驗(yàn)條件下，蘋果酒的最佳澄清劑為皂土，其最適添加量為1.0 g/L，后續(xù)選擇0.9、1.0、1.1 g/L三個(gè)水平做響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。

圖2 澄清劑對蘋果酒透光率的影響

2.3 溫度對蘋果酒澄清效果的影響

由圖3可知，當(dāng)溫度在5～10 ℃時(shí)，隨著溫度的升高蘋果酒透光率也逐漸增加，當(dāng)溫度達(dá)到10 ℃時(shí)，透光率達(dá)到最大值，為99.9%。之后，隨著溫度的升高，透光率逐漸降低，說明高溫不利于皂土的澄清。因此，選擇5、10、15 ℃三個(gè)溫度水平做響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。

圖3 溫度對蘋果酒澄清效果的影響

2.4 澄清時(shí)間對蘋果酒澄清效果的影響

由圖4可知，隨著澄清時(shí)間的增加，蘋果酒透光率也隨之增大，當(dāng)澄清時(shí)間為36 h時(shí)，透光率達(dá)到最大值，為 99.8%。之后，隨著澄清時(shí)間的增加，透光率值基本保持不變。因此，蘋果酒最佳澄清時(shí)間為36 h，選擇36、42、48 h三個(gè)水平做響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。

圖4 澄清時(shí)間對蘋果酒澄清效果的影響

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果[14]

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以皂土添加量（A）、澄清溫度（B）、澄清時(shí)間（C）為自變量，透光率（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，對蘋果酒澄清工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定蘋果酒澄清工藝的最佳條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2所示，方差分析及相關(guān)系數(shù)見表3、表4。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2試驗(yàn)結(jié)果及分析進(jìn)行多元回歸分析，得到二次多項(xiàng)模型回歸方程：

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3可知，該模型P＜0.000 1＜0.01極顯著，失擬項(xiàng)P＝0.731 8＞0.05不顯著，說明該模型擬合度較好，模型回歸方程能很好地預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果[15]。一次項(xiàng)A、B的P值分別為0.000 2、0.000 5，均小于0.01，說明因素A、B對蘋果酒透光率的影響極顯著；交互項(xiàng)AB的P值為0.002 7＜0.01，說明因素AB對蘋果酒透光率的影響極顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2的P值均小于 0.000 1＜0.01，說明因素A2、B2、C2對蘋果酒透光率的影響極顯著；一次項(xiàng)C和交互項(xiàng)AC、BC的P值均大于0.05，說明因素C、AC、BC對蘋果酒透光率的影響不顯著。因此，對蘋果酒透光率的影響因素由高到低依次為：皂土添加量＞澄清溫度＞澄清時(shí)間。

表3 回歸模型的方差分析

由表4可知，R2＝0.992 2，R2adj＝0.982 1，說明該模型的擬合度較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，能解釋98.21%的變化；R2pred＝0.959 2，說明該模型預(yù)測性較好。變異系數(shù)CV為0.10%，小于5%，表明方程有良好的重現(xiàn)性。信噪比為30.390，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 4，說明模型可信度非常高。因此，可利用此模型對蘋果酒澄清工藝進(jìn)行預(yù)測和分析。

表4 方差相關(guān)系數(shù)

2.5.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面自變量的響應(yīng)值及自變量之間的關(guān)系能夠通過三維圖和等高線進(jìn)行預(yù)測和檢驗(yàn)[16]。如圖5 a所示，AB的等高線呈橢圓形，交互作用極顯著，說明皂土添加量與澄清溫度對蘋果酒的透光率影響很大，隨著皂土添加量與澄清溫度的增加，蘋果酒的透光率也逐漸增大，當(dāng)增大到一定程度后，透光率又開始減小，說明過高或過低的溫度或皂土添加量對蘋果酒的透光率都有影響。如圖5 b、5 c所示，BC、AC的等高線呈近似橢圓形和圓形，說明澄清溫度與澄清時(shí)間、皂土添加量與澄清時(shí)間之間有交互作用，但是交互作用不顯著。

圖5 各因素交互作用對蘋果酒澄清效果的影響

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)回歸模型預(yù)測分析得到蘋果酒澄清工藝最佳條件為：皂土添加量1.02 g/L、澄清溫度9.58 ℃、澄清時(shí)間 42.18 h，蘋果酒透光率預(yù)測值為99.693%。為方便操作，將最佳澄清工藝條件調(diào)整為：皂土添加量1.02 g/L、澄清溫度9.6 ℃、澄清時(shí)間42.2 h。在此工藝條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到蘋果酒透光率實(shí)際值為（99.7±0.1）%，實(shí)際值與預(yù)測值相差不大，說明該工藝可行。

2.6 蘋果酒澄清處理前后各理化指標(biāo)及感官評價(jià)

2.6.1 澄清處理前后蘋果酒各理化指標(biāo)變化

由表5可知，經(jīng)澄清處理的蘋果酒各理化指標(biāo)跟原酒相比，差異不顯著，但透光率跟感官評分明顯高于原酒，差異極顯著。澄清處理后的蘋果酒感官評分及透光率較高，主要是由于皂土吸附了酒體中帶正電的蛋白質(zhì)、單寧和金屬離子等物質(zhì)，產(chǎn)生了絮狀沉淀，透光率大大提高，使酒體得以澄清，從而提高了感官評分[11]。

表5 蘋果酒澄清處理前后各理化指標(biāo)的變化

2.6.2 澄清處理前后蘋果酒感官評分雷達(dá)圖

由圖6可知，經(jīng)澄清處理的蘋果酒各項(xiàng)感官評分均高于原酒，酒體跟原料特性（果香）得分相差最高。經(jīng)皂土澄清處理的蘋果酒酒體澄清透明，果香濃郁，呈秸稈黃色，口感圓潤復(fù)雜，酸甜平衡，典型性強(qiáng)；未經(jīng)澄清處理的蘋果酒酒體渾濁，香氣較淡，口感略粗糙。

圖6 蘋果酒原酒及最佳澄清工藝處理后的蘋果酒感官評分雷達(dá)圖

3 結(jié)論

通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)對蘋果酒澄清工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)方法構(gòu)建二次回歸方程數(shù)學(xué)模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定蘋果酒最佳澄清劑為皂土，最佳澄清條件為：皂土添加量1.02 g/L、澄清溫度9.6 ℃、澄清時(shí)間42.2 h。在此條件下，蘋果酒透光率為 99.7%，跟未澄清處理的原酒相比，透光率提高了 24.9%，感官評分較高，為90分，且澄清處理后的蘋果酒跟原酒相比，總糖、總酸及酒精度基本不變。