譚子祎 曾佳如 李萌

摘要：采用超聲波-鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取黑胡椒（Piper nigrum L.）精油，利用響應(yīng)面法確定了最佳的液料比、超聲時間、NaCl濃度等提取參數(shù)。結(jié)果表明，超聲波輔助蒸餾法提取黑胡椒精油的最佳條件參數(shù)為液料比17∶1、超聲時間13 min、NaCl濃度2.4%。在此條件下黑胡椒精油的得率為1.79%。對使用此方法獲得的黑胡椒精油進行了抗氧化和抑菌活性檢測，結(jié)果表明提取物具有一定的抗氧化能力，且對ABTS的清除能力遠強于對DPPH的清除能力。同時，提取物對金黃色葡萄球菌和青枯假單胞菌均具有較強的生長抑制功能。

關(guān)鍵詞：黑胡椒（Piper nigrum L.）；精油；超聲波；水蒸氣蒸餾；抗氧化；抑菌

中圖分類號：TQ654.2???????? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）05-0162-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.029??????????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Optimization of ultrasonic-assisted salting-out assisted extraction of essential oil

from Piper nigrum L. and its activity analysis

TAN Zi-yi， ZENG Jia-ru， LI Meng

（College of Life Science and Technology， Central South University of Forestry and Technology， Changsha? 410004， China）

Abstract： The ultrasonic-assisted salting-out assisted steam distillation method was used to extract essential oil from Piper nigrum L.. Response surface methodology was used to determine the optimal extraction parameters such as liquid-solid ratio， ultrasonic time and NaCl concentration. The results showed that the optimal extraction condition of essential oil from Piper nigrum L. by ultrasonic-assisted distillation method was the liquid-solid ratio of 17∶1， ultrasonic time of 13 min， and NaCl concentration of 2.4%. Under this condition， the extraction yield of Piper nigrum L. essential oil was 1.79%. The extracts obtained by this method were tested for antioxidant and antibacterial activities. The results showed that Piper nigrum L. essential oil had a certain antioxidant capacity， and its scavenging ability on ABTS was much stronger than that on DPPH. The extract also showed strong growth inhibition against both Staphylococcus aureus and Pseudomonas solanacearum.

Key words： Piper nigrum L.； essential oils； ultrasound； steam distillation； antioxidant； bacteriostatic

收稿日期：2022-08-15

基金項目：湖南省教育廳重點研究項目（20A521）；湖南省自然科學(xué)基金項目（2021JJ31144）；中南林業(yè)科技大學(xué)校級研究生創(chuàng)新項目

（2022CX02068）

作者簡介：譚子祎（1998-），女，湖南邵陽人，碩士，主要從事生物資源轉(zhuǎn)化與利用研究工作，（電話）17369323060（電子信箱）995909067@qq.com；共同第一作者，曾佳如（2000-），女，湖南長沙人，本科，研究方向為生物工程，（電話）18307388377（電子信箱）563838217@qq.com；

通信作者，李 萌（1980-），男，湖北荊門人，副教授，博士，主要從事生物工程研究工作，（電話）13319516033（電子信箱）

limeng0422@foxmail.com。

譚子祎，曾佳如，李 萌. 超聲波-鹽析輔助蒸餾提取黑胡椒精油方法優(yōu)化及活性分析［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（5）：162-167．

黑胡椒（Piper nigrum L.）是胡椒科（Piperaceae）胡椒屬（Piper）常綠熱帶藤本植物，又名古月、黑川及白川。黑胡椒風(fēng)味辛辣，是國際市場重要的大宗調(diào)味品，被譽為“香料之王”［1］。據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》記載，胡椒具有散寒和消痰的功效，可用于治療因胃寒引起的嘔吐、腹瀉以及食欲不振、多痰及腹痛［2］。

黑胡椒粒中精油含量為1%～3%，其活性成分主要包括萜烯類物質(zhì)［3］，如胡椒堿、3-蒈烯、石竹烯等，這些成分具有一定的抗氧化［4］和抑菌［5］活性，作為天然防腐劑和抗氧化劑有巨大的應(yīng)用潛力，可應(yīng)用于食品工業(yè)中。傳統(tǒng)的胡椒精油萃取方法有水蒸氣蒸餾［6-8］、溶劑萃?。?］、同時蒸餾萃?。?0］等。但目前的工藝收率偏低，操作繁瑣，且溶劑殘留對精油品質(zhì)有負面影響。因此，如何提高精油得率和降低有機溶劑殘留量成為了亟待解決的問題，開發(fā)高效、簡潔、綠色環(huán)保的萃取工藝具有至關(guān)重要的意義。近年來，對植物精油提取的應(yīng)用研究十分活躍，各種新的提取方法層出不窮，如微波輔助蒸餾［11］、超聲輔助蒸餾［12，13］、酶輔助水蒸氣蒸餾［14］、鹽析輔助蒸餾［15-18］等。席小輝等［15］使用鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻（Myristica fragrans Houtt.）精油，最大得率可達13.27%，與水蒸氣蒸餾法相比，得率提高了3.42%。對鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取的肉豆蔻精油理化性質(zhì)、化學(xué)組成及熱力學(xué)性質(zhì)進行測定后，發(fā)現(xiàn)新方法對肉豆蔻精油品質(zhì)無影響。本研究嘗試將超聲波-鹽析輔助水蒸氣蒸餾法應(yīng)用于黑胡椒精油的提取，優(yōu)化提取過程中的相關(guān)參數(shù)，提高黑胡椒精油的提取效率。同時對本方法獲得的提取物進行抗氧化和抑菌活性測定，為全面開發(fā)利用黑胡椒精油提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

材料與試劑：黑胡椒（越南產(chǎn)）；氯化鈉（NaCl），分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），分析純，福州飛凈生物科技有限公司；2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS），分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；青枯假單胞菌（Pseudomonas solanacearum 335855）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus 186335），購自北納生物-河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心。

儀器與設(shè)備：GR110DA型高壓滅菌鍋，廣州合眾生物科技股份有限公司；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；SW-CJ-1D型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZHWY-100B型搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；DH-420型細菌培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司；Cytation 5型多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑胡椒精油的提取 參考2020版《中華人民共和國藥典》通則2204揮發(fā)油測定法［2］和哈立洋等［19］、張圓圓等［20］的方法從黑胡椒中提取精油。取黑胡椒顆粒在55 ℃烘箱中干燥，粉碎，過40目篩。準確稱取20.00 g黑胡椒粉末于圓底燒瓶中，添加NaCl溶液后進行超聲處理。使用揮發(fā)油提取器，水蒸氣蒸餾2 h，上層精油常溫下采集，用無水硫酸鈉吸干水分得到最終提取物，計算得率。提取物密封后保存于4 ℃。

黑胡椒精油得率=[提取精油質(zhì)量胡椒粉末質(zhì)量×100%]?? （1）

1.2.2 單因素試驗 采用“1.2.1”中的提取方法，維持NaCl濃度6%、液料比10∶1不變，分別研究超聲時間為0、15、30、45、60 min時對黑胡椒精油得率的影響；維持超聲時間30 min、液料比10∶1不變，分別研究NaCl濃度0、3%、6%、9%、12%時對黑胡椒精油得率的影響；維持超聲時間30 min、NaCl濃度6%不變，分別研究液料比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1時對黑胡椒精油得率的影響?？疾旄髟囼炓蛩貙诤肪偷寐实挠绊?，進而確認響應(yīng)面分析的試驗因素及水平。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析 為獲得黑胡椒精油的最佳提取條件，基于Box-Behnken試驗設(shè)計原理，以提取的黑胡椒精油得率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計關(guān)于超聲時間（A）、NaCl濃度（B）和液料比（C）的三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗，響應(yīng)面試驗因素及水平見表1。

1.2.4 黑胡椒精油抗氧化活性測定

1）DPPH自由基清除能力測定。清除DPPH自由基的能力測定參照Compton等［21］的方法，略有改動。在96孔板中加入198 μL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，再加入所需濃度的待測樣品2 μL，靜置反應(yīng)?? 30 min，反應(yīng)全程遮光處理，檢測樣品在517 nm處的吸光度。以維生素C（0.5 mg/mL）作為陽性對照，無水乙醇作為空白對照。

DPPH清除率=[（1-A1A0）×100%]?????????? ????? ?????（2）

式中，A0代表空白對照吸光度；A1代表所測樣品溶液吸光度。

2）ABTS自由基清除能力測定。用Fu等［22］的方法測定黑胡椒精油對ABTS自由基的清除能力。將0.4 mL ABTS溶液（7.4 mmol/L）與0.4 mL 過硫酸鉀溶液（2.6 mmol/L）混合，在黑暗條件下反應(yīng)12 h，加適量無水乙醇稀釋后，于734 nm處檢測吸光度，使其吸光度在0.68～0.72。在96孔板中加入98 μL上述ABTS工作液，加入所需濃度的待測樣品2 μL，靜置反應(yīng)6 min，反應(yīng)全程遮光處理，檢測吸收度。以維生素C（0.5 mg/mL）作為陽性對照，無水乙醇作為空白對照。

ABTS清除率=[（1-A2A0）×100%] ? （3）

式中，A0代表空白對照吸光度；A2代表所測樣品溶液吸光度。

1.2.5 黑胡椒精油抗菌活性研究

1）抑菌圈的測定。采用瓊脂打孔法［23］。將2 mL菌懸液（經(jīng)稀釋平板計數(shù)法測得濃度約為6.65×106 CFU/mL）加入已滅菌且溫度適宜（40～50 ℃）的????? 200 mL LB瓊脂培養(yǎng)基中，搖晃均勻。在無菌操作臺進行倒平板并等待凝固后，用1 mL槍頭（直徑為8 mm）均勻打孔，每板3～5孔。將精油樣品加入瓊脂孔中，每一小孔加20 μL，放入37 ℃培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)24 h。以不添加提取物的溶劑作為空白對照。在培養(yǎng)完成后，對抑菌圈進行觀察，并記錄抑菌圈大小，用交叉法測量抑菌圈直徑。

2）最小抑菌濃度（MIC）的測定。參考試管倍比稀釋法［24］測定最小抑菌濃度。黑胡椒精油濃度梯度設(shè)為100、50、25、12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5 μg/mL和空白。在不同濃度的精油樣品中加入已校正濃度的菌液0.05 mL，混勻，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，比較試驗組與對照組渾濁度，取液體相對澄清且未見細菌生長的最低濃度記為MIC值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均通過3個生物學(xué)重復(fù)測定得出。采用SPSS 25軟件進行單因素方差統(tǒng)計分析，采用Design-Expert 10.0.1軟件優(yōu)化黑胡椒精油提取的相關(guān)因素作出響應(yīng)面，采用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑胡椒精油提取單因素影響分析

2.1.1 超聲時間對黑胡椒精油得率的影響 由圖1可知，在超聲時間小于15 min時，黑胡椒精油得率逐漸升高，表明超聲可能有加快黑胡椒精油在溶劑界面上的擴散速度的作用［25］，此時黑胡椒精油的得率最高。隨著時間的延長，提取所得的黑胡椒精油得率逐漸下降，可能是在超聲處理過程中產(chǎn)生的熱量和空穴效應(yīng)等都會一定程度上破壞黑胡椒精油結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致得率下降［13］。因此，選擇0、15、30 min作為進一步試驗超聲時間的水平。

2.1.2 NaCl濃度對黑胡椒精油得率的影響 由圖2可知，在蒸餾過程中，隨著溶液中NaCl濃度的增加，黑胡椒精油得率也在逐漸增加。當NaCl濃度為3%時，獲得的黑胡椒精油得率最高。隨著處理濃度加大，提取所得的黑胡椒精油得率逐漸下降?？赡苁怯捎跓o機鹽可通過鹽析促進水分與揮發(fā)性物質(zhì)分離，無機鹽濃度過高易使溶液有爆沸的趨勢，從而造成黑胡椒中揮發(fā)物流失［18］。因此將進一步試驗NaCl濃度的水平確定為0、3%、6%。

2.1.3 液料比對黑胡椒精油得率的影響 由圖3可知，在液料比逐漸增大的情況下，精油得率的變化趨勢是先增加后降低。當液料比為15∶1時，得率最高，達到1.56%。當液料比過小也就是黑胡椒粉末中去離子水過少時，粉末局部受熱，揮發(fā)油難以釋放，從而可能導(dǎo)致得率降低。當液料比逐漸增大時，滲透進細胞的水分也隨之增加，細胞在壓力作用下易破裂，使黑胡椒精油得率有所上升。但當液料比過大時，精油在水中的溶解度變大，導(dǎo)致部分精油損失在介質(zhì)中，而且液面過厚可能影響超聲波的吸收。因此，確定進一步試驗液料比的水平為10∶1、15∶1、20∶1。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果 基于單因素試驗，以超聲時間（A）、NaCl濃度（B）、液料比（C）3個因素作為自變量，以黑胡椒精油得率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，各組試驗結(jié)果如表2所示。

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 通過Design Expert 10.0.1軟件對表2數(shù)據(jù)進行分析擬合，得到黑胡椒精油得率（Y）關(guān)于超聲時間（A）、NaCl濃度（B）和液料比（C）的二次回歸方程為：

Y=0.73+8.00×10-3A+0.11B+0.09C-4.44×10-4AB+6.67×10-5AC-3.50×10-3BC-2.94×10-5A2-8.75×10-3B2-2.35×10-3C2。

由方差分析（表3）可得，P=0.003 4<0.01，說明該回歸模型極顯著，且失擬項P=0.055 6>0.05不顯著，表明該模型可用于預(yù)測黑胡椒精油提取情況?；貧w方程中極顯著項有一次項液料比（C）及二次項A2、B2和C2；交互項BC也是顯著的，這些都說明響應(yīng)面優(yōu)化法中所選擇的3個因素對黑胡椒精油得率均有一定影響。3個因素對提取的黑胡椒精油得率的影響顯著程度排序為液料比（C） > 超聲時間（A） > NaCl濃度（B）。

2.2.3 響應(yīng)面自變量間交互作用分析 利用Origin 2018軟件將試驗結(jié)果繪制響應(yīng)面，評價所擬合的響應(yīng)面形狀。超聲時間（A）、NaCl濃度（B）和液料比（C）三者交互作用對響應(yīng)值黑胡椒精油提取得率Y的影響可從各響應(yīng)曲面圖（圖4）直觀看出。因子AC和BC的交互作用曲線陡峭，且可以明顯找出圖像中對應(yīng)的最優(yōu)區(qū)域，表明NaCl濃度與液料比（圖4b）的交互作用對最終精油得率的影響最顯著，超聲時間與液料比（圖4a）、超聲時間與NaCl濃度（圖4c）間交互作用對黑胡椒精油得率影響較小。

2.2.4 最佳工藝的確定及驗證 經(jīng)Design Expert軟件分析預(yù)測，最佳提取條件為超聲時間12.738 min、NaCl濃度2.394%和液料比17.188∶1，該條件下黑胡椒精油提取得率達1.89%。考慮到實際操作的便捷性，將優(yōu)化后的參數(shù)修正為超聲時間13 min、NaCl濃度2.4%和液料比17∶1。根據(jù)改進的試驗條件提取精油來驗證，實際得到的黑胡椒精油得率為1.79%，與理論結(jié)果的相對誤差為5.29%，與回歸模型基本一致。通過對比試驗（表4）發(fā)現(xiàn)，基于超聲波-鹽析輔助水蒸氣蒸餾的精油得率較水蒸氣蒸餾法有明顯提高。與之類似的還有，利用超聲波-微波協(xié)同輔助萃取白胡椒精油，得率為3.80%，顯著高于水蒸氣蒸餾法所得（3.10%）［13］。利用超聲波-鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取葛縷子（Carum carvi L.）精油，可將得率提高1.24%［26］。

表4 不同提取方法對精油得率的影響

[提取方法??????? 精油得率//%?? 水蒸氣蒸餾???? 1.28±0.03?????? 超聲波-鹽析輔助水蒸氣蒸餾??????? 1.79±0.09?????? ]

2.3 黑胡椒精油的抗氧化活性分析

對使用本方法提取獲得的黑胡椒精油進行抗氧化活性分析（圖5），結(jié)果表明，提取物對DPPH自由基和ABTS自由基都具有一定的清除能力。隨著黑胡椒精油濃度的增加，DPPH及ABTS自由基清除率均逐漸上升，黑胡椒精油對ABTS自由基有非常顯著的清除效果，在2.50 mg/mL時清除率已超過50%，未稀釋的黑胡椒精油原液對ABTS自由基的清除能力可與維生素C相當，但對DPPH自由基的清除能力較低。

2.4 黑胡椒精油的抑菌能力分析

抑菌能力結(jié)果（圖6）表明，黑胡椒精油對金黃色葡萄球菌和青枯假單胞菌的抑菌圈直徑分別為14.7 mm和11.5 mm，均表現(xiàn)出中度敏感。

黑胡椒精油對金黃色葡萄球菌和青枯假單胞菌的最小抑菌濃度分別為1.562 5、12.500 0 μg/mL。抑菌圈和最小抑菌濃度測定結(jié)果均表明，黑胡椒精油對不同菌種具有不同的抑菌活性。與青枯假單胞菌相比，在相同條件下黑胡椒精油對金黃色葡萄球菌有更強的抑菌活性。

3 小結(jié)

本研究經(jīng)單因素試驗和響應(yīng)面分析，建立了一種超聲波-鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取黑胡椒精油的方法，主要結(jié)論如下。

1）經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化分析，基于超聲波-鹽析輔助水蒸氣蒸餾法，黑胡椒精油的最佳提取條件為液料比17∶1、超聲時間13 min、NaCl濃度2.4%，此時黑胡椒精油的得率為1.79%，比水蒸氣蒸餾法提高了0.51個百分點。

2）黑胡椒精油對DPPH和ABTS均具有清除能力，對ABTS自由基清除效果十分顯著，在2.50 mg/mL時清除率已超過50%，對ABTS的清除能力遠強于對DPPH的清除能力。

3）黑胡椒精油對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（青枯假單胞菌）均有一定的抑菌效果，抑菌圈直徑分別為14.7 mm和11.5 mm，表現(xiàn)出中度敏感。

本研究為黑胡椒提取精油提供了新的研究思路，同時也為全面開發(fā)利用黑胡椒相關(guān)產(chǎn)品提供了研究依據(jù)。

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