高粱PLC基因家族全基因組鑒定及其對非生物脅迫的響應(yīng)表達(dá)分析

摘要：磷脂酶C（PLC）是磷酸肌醇代謝中重要的水解酶之一，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、應(yīng)對逆境脅迫和多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要功能。鑒定高粱的PLC基因家族，能夠為磷脂酶C基因功能研究提供理論依據(jù)，有利于篩選出植物抗逆發(fā)育生長的有效基因。基于高粱全基因組數(shù)據(jù)，鑒定得到高粱PLC基因家族，通過生物信息學(xué)方法分析并研究高粱PLC基因家族成員的理化性質(zhì)、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、順式作用元件、共線性關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并用qRT-PCR技術(shù)探究高粱PLC基因家族在不同組織時期、脅迫處理下的表達(dá)模式。結(jié)果表明，共鑒定到11個SbPLC基因，分為2個亞家族，各亞家族內(nèi)的SbPLC具有典型的蛋白基序和基因結(jié)構(gòu)特征，在一定程度上支持分類預(yù)測。此外，這11個SbPLC基因在高粱的6條染色體上不均勻分布并且均富集了生長發(fā)育、激素響應(yīng)相關(guān)的順式元件。通過對SbPLC共線性關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，基因復(fù)制事件可能導(dǎo)致一些SbPLC基因的產(chǎn)生，片段復(fù)制比串聯(lián)重復(fù)更有助于SbPLC基因家族的擴(kuò)展。qRT-PCR結(jié)果顯示，SbPLC基因不同程度地受到非生物脅迫的影響，并且在花器官、種子中的表達(dá)相對活躍。綜上所述，本研究結(jié)果和信息為進(jìn)一步研究高粱PLC基因的生物學(xué)功能和進(jìn)化提供了良好基礎(chǔ)，同時也為高粱的抗逆性分子育種提供了一些候選基因。

關(guān)鍵詞：高粱；磷脂酶C（PLC）；基因家族；非生物脅迫；表達(dá)分析

中圖分類號：S514.03" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）23-0038-11

簡子林，王自力，秦" 暢，等. 高粱PLC基因家族全基因組鑒定及其對非生物脅迫的響應(yīng)表達(dá)分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（23）：38-48.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.23.005

收稿日期：2023-11-26

基金項目：貴州省科技計劃（編號：黔科合支撐［2022］重點026）；貴州省十大工業(yè)（優(yōu)質(zhì)煙酒）產(chǎn)業(yè)振興專項資金（編號：黔財工［2020］198）；貴州省省級綠色高產(chǎn)高效建設(shè)項目（編號：S2023-002）。

作者簡介：簡子林（2001—），男，貴州貴陽人，碩士，從事高粱遺傳育種方面的研究。E-mail：1395488225@qq.com。

通信作者：任明見，教授，博士生導(dǎo)師，從事小麥、高粱等作物的遺傳育種與配套栽培技術(shù)、品質(zhì)分析、抗病性鑒定及分子生物學(xué)方面的研究。E-mail：rmj72@163.com。

磷脂是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要成分，同時也是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)的重要組分［1］。磷脂酶可以將磷脂水解成二?；视停―AG）、磷脂酸（PA）、游離脂肪酸（FFA）等多種次級產(chǎn)物，這些產(chǎn)物將參與細(xì)胞調(diào)節(jié)與新陳代謝并涉及細(xì)胞內(nèi)信號傳遞過程［2］。根據(jù)磷脂水解位點的差異，植物中的磷脂酶可分為磷脂酶A1（PLA1）、磷脂酶A2（PLA2）、磷脂酶D（PLD）和磷脂酶C（PLC）［3］。這些不同類型的磷脂酶在反應(yīng)條件和底物選擇上存在差異，但它們在植物生長發(fā)育和應(yīng)對非生物脅迫的過程中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。特別是PLC在植物中被認(rèn)為是重要的磷脂水解酶，對膜脂的重塑、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要影響。根據(jù)底物特異性范圍的不同，植物PLC可分為磷脂酰肌醇特異性PLC（PI-PLC）、非特異PLC（NPC）2個類型［1，4］，這些不同類型的PLC在植物生物學(xué)中扮演著獨特且重要的角色。

一般而言，典型的植物PI-PLC在結(jié)構(gòu)上至少包含2個結(jié)構(gòu)域，即催化性的PI-PLC-X結(jié)構(gòu)域和PI-PLC-Y結(jié)構(gòu)域［5］。這2個結(jié)構(gòu)域可以共同形成1個扭曲的磷酸三糖異構(gòu)酶（TIM）桶狀結(jié)構(gòu)，其中包含活性位點殘基［6］。因此，PI-PLC的X/Y結(jié)構(gòu)域具有較高保守性。此外，PI-PLC還具有1個C端的C2結(jié)構(gòu)域和1個N端的EF手型結(jié)構(gòu)域［6］。EF手型結(jié)構(gòu)通常由4個螺旋-環(huán)-螺旋折疊組成，這也是鈣結(jié)合蛋白的顯著特征［7］。然而，植物中 PI-PLC 的EF手型（EF-hand）結(jié)構(gòu)并不完整［8］，研究發(fā)現(xiàn)，某些植物中保守的N末端結(jié)構(gòu)域可能代表催化活性所需的EF手型結(jié)構(gòu)域，但并不是脂質(zhì)結(jié)合所必需的［9］。在本研究中，高粱PLC基因家族成員僅有1個包含EF結(jié)構(gòu)域的蛋白，但其功能尚不明確。據(jù)報道，植物PI-PLC除了含有PI-PLC-X結(jié)構(gòu)域、PI-PLC-Y結(jié)構(gòu)域外，還都包含C2結(jié)構(gòu)域，這是PLC發(fā)揮功能所必需的重要組成部分［10］。盡管人們已對某些植物中的PI-PLC結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，但仍然沒有對NPC結(jié)構(gòu)的研究?，F(xiàn)有研究顯示，所有的NPC都含有1個磷酸酯酶（phosphoesterase）結(jié)構(gòu)域，這是磷脂酶功能所必需的［11-13］。

植物PLC家族成員在植物的生長、發(fā)育和脅迫反應(yīng)等各種生物過程中發(fā)揮著重要作用。在擬南芥中，AtNPC4的表達(dá)是由高濃度NaCl誘導(dǎo)的，敲除AtNPC4基因的植株對鹽的敏感性增強(qiáng)，且AtNPC3、AtNPC4在根發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用［4］。AtPLC2參與生長素的生物合成和信號傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)擬南芥雄性、雌性胚胎的發(fā)育［14］。此外，PLC基因在多種非生物脅迫下表現(xiàn)出響應(yīng)差異。擬南芥AtPI-PLC成員都可以在高鹽度、寒冷等各種非生物脅迫下被誘導(dǎo)［15］。在其他植物中，OsPLC1可引發(fā)應(yīng)激誘導(dǎo)的Ca2+調(diào)節(jié)耐鹽性的信號，揭示了在鹽脅迫響應(yīng)期間由PLC介導(dǎo)的磷酸肌醇與Ca2+之間的聯(lián)系［16］。ZmPI-PLC3a、ZmPI-PLC3b的表達(dá)量經(jīng)冷處理后上調(diào)，經(jīng)Cu2+處理后下調(diào)。ZmNPC4、ZmNPC5的表達(dá)量在滲透處理下下調(diào)，但高鹽度可迅速誘導(dǎo)其表達(dá)［17］。大多數(shù)PLC成員的表達(dá)量在非生物脅迫（鹽、寒冷）下及不同發(fā)育階段表現(xiàn)出顯著差異，具有在一定階段、處理下重疊表達(dá)的特點。上述結(jié)果表明，不同PLC成員在植物生長發(fā)育階段和逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。

高粱（Sorghum bicolor L.）是我國五大糧食作物之一，被廣泛應(yīng)用于釀造、畜牧、制糖等多個產(chǎn)業(yè)［18］。近年來，復(fù)雜多變的鹽、堿、干旱等外部環(huán)境因素嚴(yán)重限制了高粱產(chǎn)量和品質(zhì)［19］。因此，本研究對高粱PLC基因家族進(jìn)行全面分析，研究結(jié)果可為SbPLC在高粱生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮的作用奠定理論基礎(chǔ)，并為高粱的抗逆育種提供新的思路。

1" 材料與方法

1.1" 植物材料

本研究所用材料為高粱品種 BTx623，于2023年從國家小麥改良中心貴州分中心收集。將BTx623種子置于24 ℃、光—暗周期14 h—10 h、相對濕度為75%的人工氣候箱中培養(yǎng)，待植株生長至3葉1心期后取樣，然后進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.2" 基因家族成員的鑒定

本研究從Ensembl Plants網(wǎng)站（http：//plants.ensembl.org/index.html）下載高粱全基因組數(shù)據(jù)；在pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）中下載PLC家族特征的隱馬爾科夫模型（PI-PLC-X、PI-PLC-Y），作為本地HMM搜索的查詢序列，設(shè)置E值lt;0.01，初步鑒定得到高粱PLC成員。為了鑒定可能通過HMM搜索而缺失的SbPLC蛋白，利用模式植物擬南芥、水稻中PLC家族成員的公開ID，從NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中提取相應(yīng)的蛋白序列，與高粱全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行BLASTP比對以去除冗余。結(jié)合2種方式鑒定得到的PLC蛋白序列，用pfam-search（http：//pfam.xfam.org/search#tabview=tab1）與Smart（http：//smart.embl.de/）對PLC序列進(jìn)行驗證，最終保留含有PLC特征結(jié)構(gòu)域的基因家族成員。

1.3" 理化性質(zhì)分析

將SbPLC的蛋白序列提交至ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/），預(yù)測總平均親水性、相對分子量和等電點及氨基酸數(shù)目等理化性質(zhì)，并用WolF PSORT Prediction（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測亞細(xì)胞的位置。

1.4" 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

用MEGA 11軟件的clustalW功能對篩選得到的高粱PLC基因家族成員及上述根據(jù)擬南芥、水稻PLC家族成員公開ID提取的序列進(jìn)行氨基酸多序列比對，采用鄰近法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。最后通過EvolView（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件對系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行美化。

1.5" 染色體定位、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

從Ensembl Plants網(wǎng)站（http：//plants.ensembl.org/index.html）下載高粱基因組結(jié)構(gòu)注釋信息GFF3文件，用TBtools軟件的Gene Location Visualize from GTF/GFF功能繪制基因在染色體上的位置、基因結(jié)構(gòu)［20］。用MEME（http：//meme.sdsc.edu/meme4_3_0/intro.html）對高粱PLC基因家族的保守基序進(jìn)行分析。

1.6" 順式作用元件分析

為了確定可能參與SbPLC轉(zhuǎn)錄調(diào)控的順式元件，用PlantCARE［PlantCARE，adatabase of plant promoters and their cis-acting regulatory elements（ugent.be）］在SbPLC上游2 000 bp的啟動子區(qū)域?qū)赡茼憫?yīng)逆境脅迫和激素作用的順式作用元件進(jìn)行分析預(yù)測。這些順勢作用元件可通過TBtools軟件的Basic Biosequence View功能來實現(xiàn)可視化。

1.7" 共線性分析

從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫（http：//plants.ensembl.org/index.html）中下載水稻、擬南芥的全基因組序列和基因注釋文件，用TBtools分析PLC基因家族在高粱種內(nèi)和不同物種間的共線性區(qū)段及其基因復(fù)制事件，分別鑒定得到高粱與擬南芥、水稻之間的共連基因?qū)Γ约案吡晃锓N內(nèi)的同源基因，結(jié)果通過Advanced Circos功能實現(xiàn)可視化。

1.8" 高粱PLC時空表達(dá)模式分析

為了研究高粱PLC家族成員在不同組織下的時空表達(dá)差異，從已公布的高粱參考基因組數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)RNA-seq數(shù)據(jù)。所有高粱PLC基因的表達(dá)水平通過FPKM（fragmentsper kilobase of exon model per milion mapped fragments）方法表示。SbPLC基因的時空表達(dá)熱圖利用ClusyVis網(wǎng)站的ClustVis：a web tool for visualizing clustering of multivariate data （BETA） （ut.ee）進(jìn)行分析繪制。

1.9" 非生物脅迫和激素處理下高粱幼苗表達(dá)模式分析

為了理解SbPLC在不同脅迫下的表達(dá)模式，以高粱BTx623作為試驗材料，在24 °C、光—暗周期為14 h—10 h、相對濕度為75%的人工氣候箱中培養(yǎng)，待植株生長至3葉1心期時，分別用 100 μmol/L ABA、200 mmol/L NaCl在4 ℃條件下處理BTx623幼苗，并分別于0、3、12、24 h取樣（每個時間節(jié)點設(shè)立3次生物學(xué)重復(fù)）。用液氮速凍然后保存在 -80 ℃ 冰箱中，用于RNA的提取，所用引物見表1。通過qRT-PCR技術(shù)驗證部分SbPLC在不同脅迫處理和激素作用下的表達(dá)水平，試驗數(shù)據(jù)通過2-ΔΔCT法（其中：C表示循環(huán)數(shù)；T表示閾值）計算相對表達(dá)量［21］，使用Graphpad Prism 9.5繪制成圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 高粱PLC基因家族成員的鑒定與理化性質(zhì)的分析

基于生物信息學(xué)方法，得到11個SbPLC基因。根據(jù)不同類型的保守結(jié)構(gòu)域，將SbPLC分為SbPI-PLC和SbNPC等2類。其中：SbPI-PLC包含6個成員，分別命名為SbPI-PLC1、SbPI-PLC2、SbPI-PLC3、SbPI-PLC4、SbPI-PLC5和SbPI-PLC6。這些編碼蛋白的氨基酸數(shù)量介于484～678個之間，相對分子量介于54.0～77.7 ku之間，等電點在5.28～7.13之間，不穩(wěn)定系數(shù)在42.02～48.36之間。SbNPC包含5個成員，分別命名為SbNPC1、SbNPC2、SbNPC3、SbNPC4和SbNPC5。這些編碼蛋白的氨基酸數(shù)量介于510～602個之間，相對分子量介于56.7～65.9 ku之間，等電點在5.76～9.41之間，不穩(wěn)定系數(shù)在39.73～53.47之間。所有SbPLC的平均親水性值都小于0，表明SbPLC家族成員都被預(yù)測為親水性蛋白。根據(jù)WolF PSORT Prediction預(yù)測的亞細(xì)胞定位，SbPI-PLC1、SbPI-PLC3、SbPI-PLC6、SbNPC1和SbNPC3定位在葉綠體中，SbPI-PLC4和SbNPC4定位在線粒體中，其他SbPLC都定位在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中（表2）。SbPLC能夠響應(yīng)多種非生物脅迫和激素作用，可能與SbPLC作用于多種細(xì)胞器及細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)有關(guān)。此外，不同SbPLC成員具有不同的理化性質(zhì)，推測SbPLC可能參與了復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

2.2" SbPLC染色體定位與基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)基因組注釋文件繪制SbPLC染色體定位圖，結(jié)果（圖1）顯示，除了4號、6號、7號和10號染色體外，SbPLC的11個家族成員較均勻地分布在高粱的6條染色體兩端。其中，SbNPC1、SbNPC2和SbPI-PLC2定位于1號染色體，SbNPC3和SbNPC4定位于3號染色體，SbNPC5、SbPI-PLC5和SbPI-PLC6定位于5號染色體兩端，SbPI-PLC1、SbPI-PLC3和SbPI-PLC4分別定位于2號、8號和9號染色體上。為了獲得有關(guān)高粱PLC家族成員進(jìn)化特征的線索，對SbPLC的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2）表明，SbPLC之間存在較大的結(jié)構(gòu)差異，可能對應(yīng)于SbPLC相關(guān)成員之間的功能多樣性。SbNPC分支通常包含1～3個編碼區(qū)域（CDS），而SbPI-PLC分支大部分基因均包含8個以上的編碼區(qū)域（CDS），在每個分支中都存在相似的CDS、UTR模式。

2.3" SbPLC系統(tǒng)進(jìn)化樹分析與保守基序分析

為了深入了解植物PLC的進(jìn)化歷程，并確定高粱中PLC的多樣性是否在植物間保守，筆者對幾種不同植物的NPC蛋白序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)

果見圖3。通過NJ方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，將9個水稻OsPLC家族成員、15個擬南芥AtPLC家族成員及11個高粱SbPLC家族成員分為2個亞家族，即PI-PLC和NPC，與之前的CDS/UTR結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相符。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，SbPLC不同家族成員間具有很高的同源性，特別是SbPI-PLC1和SbPI-PLC6及SbPI-PLC3和SbPI-PLC5形成了獨立的小分支。此外，SbPI-PLC2與OsPI-PLC2、SbPI-PLC4與OsPI-PLC4、SbNPC3與OsNPC5、SbNPC1與OsNPC1、SbNPC4與OsNPC2、SbNPC2與OsNPC4、SbNPC5與OsNPC3也形成了獨立的分支。上述結(jié)果表明，高粱與水稻之間在NPC亞家族中具有非常高的同源性，推測它們可能具有相似的進(jìn)化路徑。

為了進(jìn)一步研究SbPLC的特征區(qū)域，筆者使用MEME在線網(wǎng)站在SbPLC中鑒定出10個保守基序（圖4），發(fā)現(xiàn)同一分支的成員在結(jié)構(gòu)域方面呈現(xiàn)相似的結(jié)構(gòu)和長度。在PI-PLC分支中，成員具有保守基序1、2、3、4、5、6、8、10，分別注釋為 PI-PLC-X、PI-PLC-Y和Ca2+與磷脂結(jié)合C2結(jié)構(gòu)域。而在NPC分支中，成員具有保守基序3、5、7、8和9，被注釋為磷酸酯酶結(jié)構(gòu)域。保守基序分析結(jié)果表明，SbPLC具有高度保守性。

2.4" SbPLC順式作用元件分析

為了理解SbPLC的表達(dá)調(diào)控模式及潛在功

能，筆者對SbPLC上游2 000 bp的啟動子區(qū)域進(jìn)行分析，并預(yù)測了順式作用元件。圖5顯示，從SbPLC中共鑒定得到17種順式作用元件，分別為厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)、光響應(yīng)、脫落酸響應(yīng)、水楊酸響應(yīng)、缺氧特異性響應(yīng)、種子特異性調(diào)節(jié)、胚乳表達(dá)、分生組織表達(dá)、生長素響應(yīng)、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控、防御和應(yīng)激響應(yīng)、 晝夜節(jié)律控制調(diào)節(jié)、低溫響應(yīng)、創(chuàng)面響應(yīng)、干

旱響應(yīng)、茉莉酸甲酯響應(yīng)、赤霉素響應(yīng)元件。這些順式作用元件預(yù)示著SbPLC在高粱的生殖生長發(fā)育階段可能扮演重要角色。大量非生物脅迫響應(yīng)元件及生長激素類元件的存在也可能在高粱的生長發(fā)育階段、逆境脅迫應(yīng)對中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而，順式作用元件的類型、數(shù)量與亞家族成員的分布之間沒有明顯的相關(guān)性，同一亞家族的不同成員可能呈現(xiàn)不同的反應(yīng)模式。

2.5" SbPLC共線性分析

基因組復(fù)制事件一直被認(rèn)為是新穎性進(jìn)化的起源。在進(jìn)化過程中，基因的串聯(lián)復(fù)制和大片段重復(fù)往往會引發(fā)基因家族的形成。因此，筆者基于對高粱基因組的注釋和序列比對結(jié)果，分析了SbPLC共線性區(qū)段和基因復(fù)制事件。分析結(jié)果用TBtools進(jìn)行可視化展示，結(jié)果如圖6所示，在SbPLC中的11個家族成員中，并未發(fā)現(xiàn)基因的串聯(lián)復(fù)制，但發(fā)現(xiàn)了5對共線性關(guān)系，全部發(fā)生在PI-PLC分支中。在NPC分支中未發(fā)現(xiàn)基因的串聯(lián)復(fù)制和共線性區(qū)段，推測SbNPC基因可能是獨立進(jìn)化的。綜上，在高粱中基因的串聯(lián)復(fù)制并不是導(dǎo)致PLC基因擴(kuò)張和進(jìn)化的主要原因，而更大范圍的片段重復(fù)才起著關(guān)鍵作用。為進(jìn)一步了解SbPLC的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，筆者還對高粱與擬南芥和水稻等其他2種植物進(jìn)行了共線性分析，結(jié)果（圖7）顯示，高粱與擬南芥間存在6對共線性關(guān)系，而與水稻存在13對共線性關(guān)系，表明高粱與水稻間具有更相近的親緣關(guān)系和更相似的進(jìn)化路徑。此外，PLC基因的演化應(yīng)該發(fā)生在單子葉植物和雙子葉植物分化之前。

2.6" SbPLC對高粱生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)的功能分析

鑒定SbPLC在組織和器官中的表達(dá)水平和空間特性，可為深入揭示其在植物生長發(fā)育中的作用提供有效手段。筆者利用RNA-Seq數(shù)據(jù)庫分析了SbPLC在不同組織中的表達(dá)模式，并通過ClusyVis制作成熱圖。RNA-Seq數(shù)據(jù)庫包括9個樣本，分別為花藥、胚乳、植物胚胎、授粉后5 d的種子、授粉后10 d的種子、雌蕊、葉片、新興花序、早期花序。11個SbPLC基因在所有樣本組織中展現(xiàn)出不同的表達(dá)模式（圖8）。例如，SbPI-PLC2、SbPI-PLC5、SbNPC2、SbNPC5在花藥、早期花序、新興花序和胚乳中表現(xiàn)出特異性；SbPI-PLC1和SbPI-PLC3在花序中顯著表達(dá)；SbPI-PLC4和SbNPC1在葉片中的相對表達(dá)量高于其他組織；SbNPC3和SbNPC4在植物胚胎中的相對表達(dá)量相對較高；SbPI-PLC6在花藥中表現(xiàn)為低表達(dá)。上述結(jié)果表明，在高粱的不同組織和發(fā)育階段， SbPLC發(fā)揮了重要作用， 主要

在花器官、種子中活躍表達(dá)，可能與胚乳、種皮區(qū)域是已知的主要脂質(zhì)儲存和代謝位點有關(guān)。

為了進(jìn)一步闡明SbPLC可能存在的潛在功能，本試驗研究了其在脅迫、激素處理下的表達(dá)變化。通過qRT-PCR分析，本試驗對高粱樣品進(jìn)行了不同的脅迫處理，包括20%PEG-8000、100 μmol/L ABA、200 mmol/L NaCl和4 ℃。首先，通過對系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和啟動子區(qū)順式作用元件的分析，從不同的亞家族中選取8個SbPLC家族成員。結(jié)果（圖9）顯示，在不同的脅迫處理和激素作用下，這8個SbPLC表達(dá)出現(xiàn)差異。除了SbNPC2、SbNPC3和SbNPC5外，其余SbPLC基因在 200 mmol/L NaCl處理下被不同程度地抑制表達(dá)，其相對表達(dá)量隨時間的增加而逐漸降低，在處理后24 h其相對表達(dá)量達(dá)到最低水平。SbNPC3和SbPLC5分別在處理后12、24 h顯著表達(dá)，而SbNPC2在處理后3 h時達(dá)到較低的表達(dá)水平，其在處理后12、24 h的表達(dá)特征與其余SbPLC基因的表達(dá)特征不一致。冷處理幾乎立即誘導(dǎo)了所有SbPLC基因表達(dá)，除SbNPC3、SbNPC5外，SbPLC基因的相對表達(dá)量在處理后12 h達(dá)到峰值，同時SbNPC3、SbNPC5的相對表達(dá)量也受到顯著誘導(dǎo)，但其表達(dá)量隨時間的推移分別呈下降、上升趨勢，其中SbNPC1幾乎不受影響。 在 100 μmol/L ABA處理，SbPI-PLC2、SbNPC2、SbNPC3

和SbNPC5在處理24 h內(nèi)被誘導(dǎo)，其中SbPI-PLC2、SbNPC3在ABA處理3 h時表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平，而SbNPC2、SbNPC5的相對表達(dá)量則在ABA處理12 h時達(dá)到峰值。SbPI-PLC1、SbPI-PLC6、SbNPC1也在ABA作用下被誘導(dǎo)，并在處理24 h時達(dá)到較高的表達(dá)水平。相比之下，SbPI-PLC3沒有顯示出顯著的表達(dá)差異。綜上所述，SbPLC可能在應(yīng)對各種非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。

3" 討論

測序技術(shù)和生物分析工具的改進(jìn)能更好地反映物種的演化史，為植物基因家族的鑒定和其相關(guān)功能的挖掘提供途徑，有助于改進(jìn)其種植方法、管理方法、育種過程。本研究利用生物信息學(xué)分析技術(shù)，共從高粱中鑒定到11個PLC基因家族成員，這11個基因在高粱中是通過大范圍的片段重復(fù)事件產(chǎn)生的，基因的串聯(lián)復(fù)制并不是引起PLC基因擴(kuò)張和進(jìn)化的主要原因。在SbPI-PLC分支中鑒定得到5對共線性關(guān)系，而在SbNPC分支中未鑒定得到基因串聯(lián)復(fù)制及共線性區(qū)段，分析SbPLC中的NPC分支發(fā)現(xiàn)可能具有獨立的進(jìn)化模式。在后續(xù)的研究中，NPC基因也表現(xiàn)出了更強(qiáng)的對復(fù)雜多變環(huán)境的適應(yīng)能力和較為不同的表達(dá)特征。而SbPLC基本特征在氨基酸數(shù)量、分子量、等電點等理化性質(zhì)上存在較大差異，但總平均親水性值都小于0，皆被預(yù)測為親水性蛋白。另外，由于編碼區(qū)（CDS）不同的分布特征，SbPLC基因結(jié)構(gòu)也被發(fā)現(xiàn)有較不同的進(jìn)化模式，SbNPC分支通常包含1～3個CDS，而SbPI-PLC分支的大部分基因均包含8個以上的CDS，每個分支存在各自相似的CDS和UTR模式。在系統(tǒng)發(fā)育分析中，筆者通過構(gòu)建擬南芥、水稻和高粱PLC基因家族進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)PLC基因家族明顯被聚類為2個分支（PI-PLC及NPC），而其中水稻、高粱PLC基因普遍形成獨立的小分支，表明它們有更高的同源性。通過研究PLC基因高粱與擬南芥、水稻的共線性關(guān)系發(fā)現(xiàn)，水稻與高粱之間存在更多的共連基因?qū)Α＝Y(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小麥、水稻中的PLC基因具有較高的同源性。進(jìn)一步的染色體定位分析結(jié)果顯示，11個SbPLC基因在6條染色體上的定位較為規(guī)律，基本都靠近染色體的末端區(qū)域。在4、6、7、10號染色體上未發(fā)現(xiàn)SbPLC基因，可能是高粱進(jìn)化過程中基因復(fù)制事件的結(jié)果。

目前，PLC基因在不同組織中的表達(dá)模式已在擬南芥、水稻、大豆等不同的植物中被描述。筆者利用RNA-Seq數(shù)據(jù)庫分析SbPLC在不同組織中的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，SbPI-PLC2、SbPI-PLC5、SbNPC2、SbNPC5分別在花藥、早期花序、新興花序及胚乳中有較高的表達(dá)水平。已有的研究結(jié)果表明，AtPLC1、AtPLC7在莖中的表達(dá)水平高于其他器官，AtPLC3在葉、莖中的表達(dá)水平高于在花、根中的表達(dá)水平。OsPLC2、OsPLC3在穗發(fā)育階段顯著表達(dá)，而OsNPC4在種子發(fā)育階段顯著表達(dá)。高粱PLC基因的表達(dá)模式不同，說明這些基因可能參與了高粱不同階段或器官的發(fā)育。

非生物脅迫可誘導(dǎo)植物一系列反應(yīng)模式，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以及功能特異性的表達(dá)和激活。磷脂酶基因在應(yīng)對環(huán)境脅迫中發(fā)揮著重要調(diào)控作用［22-34］。由于其重要性，PLC基因家族在高粱中還未得到深入研究。在本研究中，qRT-PCR結(jié)果顯示，SbPLC基因?qū)Ω珊?、鹽和冷脅迫及脫落酸處理有不同程度的響應(yīng)。在這幾種非生物脅迫處理中，SbPLC基因?qū)涿{迫更為敏感，特別是SbNPC5在冷脅迫下的表達(dá)水平增加了近11倍。本研究結(jié)果表明，SbPLC基因的表達(dá)在1個或多個非生物脅迫下發(fā)生了變化，表明它們可能在響應(yīng)環(huán)境不利條件中發(fā)揮了重要作用。

越來越多的研究結(jié)果表明，PLC是植物中發(fā)揮重要作用的基因家族，其表達(dá)水平的抑制或上升取決于刺激的性質(zhì)及其時空特征。筆者通過生物信息學(xué)方法分析了高粱中PLC家族參與控制細(xì)胞生理功能的相關(guān)證據(jù)，并通過qRT-PCR技術(shù)驗證了SbPLC調(diào)節(jié)影響細(xì)胞代謝響應(yīng)非生物脅迫和激素感知，研究結(jié)果可為SbPLC與其他植物磷脂酶一起作為參與細(xì)胞信號傳遞的關(guān)鍵因素提供一定的支持。然而，需要進(jìn)一步的研究來闡明PLC基因家族作用的分子性質(zhì)及與細(xì)胞中其他信號系統(tǒng)的相互作用，以豐富PLC基因家族在高粱生長和發(fā)育過程中的作用。

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