小檗堿納米粒制備工藝優(yōu)化及其對人參黑斑病的防效

摘要：人參黑斑病對藥用植物人參破壞力極強(qiáng)，小檗堿作為植物源綠色滅菌劑農(nóng)藥，在不影響非目標(biāo)生物的情況下，具有除草、抑菌、殺蟲等農(nóng)用活性，在植物病害防治領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。然而其溶解度低、生物利用度差，從而在人參黑斑病防治方面應(yīng)用受限。為了開辟小檗堿在人參黑斑病防治方面的應(yīng)用途徑，利用離子凝膠法制備小檗堿殼聚糖納米粒（BRCSNP）并進(jìn)行處方工藝優(yōu)化。結(jié)果顯示，該納米制劑呈現(xiàn)出良好的分散穩(wěn)定性，粒徑為（156.8±5.8） nm，載藥量為14.76%。體外釋放試驗(yàn)結(jié)果表明，原藥組于6 h內(nèi)完全釋放而BRCSNP于6 h累計(jì)釋放率為50.32%，小檗堿緩釋效果得以實(shí)現(xiàn)。通過高效液相色譜（HPLC）和葉面滯留量研究考察其在紫外光源下的光解穩(wěn)定性以及葉面黏附性。最后分別采用菌絲生長速率法和離體葉片試驗(yàn)研究了其對人參黑斑病菌的抑制效果，試驗(yàn)結(jié)果表明BRCSNP對人參黑斑病有效好的防治效果。研究結(jié)果為小檗堿在人參黑斑病防治方面的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，降低了人參種植中的化學(xué)農(nóng)藥使用量，促進(jìn)了人參種植業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。

關(guān)鍵詞：植物源農(nóng)藥；人參黑斑病；抑菌活性；納米農(nóng)藥；小檗堿

中圖分類號：S435.675" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）23-0134-06

李余先，王雅儒. 小檗堿納米粒制備工藝優(yōu)化及其對人參黑斑病的防效［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（23）：134-139.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.23.019

收稿日期：2023-11-29

基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃（編號：20220204086YY）。

作者簡介：李余先（1979—），男，吉林德惠人，博士，副教授，從事中藥新藥開發(fā)研究。E-mail：769831847@qq.com。

通信作者：王雅儒，碩士研究生，從事中藥納米制劑研究。E-mail：1033227647@qq.com。

人參黑斑病是一種對藥用植物人參具有較強(qiáng)破壞力的循環(huán)系統(tǒng)疾病，其危害表現(xiàn)為葉片脫落、植株枯萎、人參種子品質(zhì)下降和人參根產(chǎn)量減少［1］。目前，防治人參黑斑病主要利用化學(xué)手段，但農(nóng)藥的頻繁使用不僅會破壞生態(tài)環(huán)境，還會引起人參產(chǎn)品農(nóng)殘超標(biāo)及病菌產(chǎn)生抗藥性等問題［2-3］。為了貫徹可持續(xù)發(fā)展的理念，保證農(nóng)民收入，研制新型綠色滅菌劑意義重大。

植物作為一種天然抗菌物質(zhì)，具有無污染、不易產(chǎn)生耐藥性等獨(dú)特優(yōu)勢，并且可以在不影響非目標(biāo)生物的情況下達(dá)到理想的防治效果［4］，因此，在植物病害防治方面，植物源農(nóng)藥是近年來的研究熱點(diǎn)［5］。王彩霞等通過46科87種中藥植物乙醇提取物的篩選發(fā)現(xiàn)厚樸、麥冬、烏藥、麻葉蟛蜞菊等4種植物提取物對試驗(yàn)菌株表現(xiàn)出明顯的抑菌性［6］。安福濤等發(fā)現(xiàn)丁子香酚與大黃素甲醚對黃瓜白粉病具有較好的防治效果［7］。小檗堿（berberine，簡稱BR）是從黃連根莖中提取的主要活性成分，它屬于異喹啉類生物堿，在臨床上常被用作抗腸道細(xì)菌感染的藥物［8］。近來研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿具有除草、抑菌、殺蟲等農(nóng)用活性，使其在農(nóng)業(yè)上得到廣泛研究與應(yīng)用，而在人參黑斑病的防治方面尚未見報(bào)道［9］。

由于小檗堿溶解度較低、生物利用度較差，使其進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用受限［10］。納米材料具有小尺度、表面以及量子效應(yīng)，在農(nóng)業(yè)上主要用作農(nóng)藥控釋載體，以提高農(nóng)藥的穩(wěn)定性和葉片附著力，提高靶向釋放性、農(nóng)藥分子光解或氧化穩(wěn)定性等［11］。環(huán)境友好型納米農(nóng)藥可降低農(nóng)藥在產(chǎn)品和環(huán)境中的使用量與殘留量，這對保證藥品安全和生態(tài)具有重要意義［12］。

殼聚糖是天然多糖甲殼素脫乙酰的產(chǎn)物，其組成為聚D-氨基葡萄糖，表現(xiàn)出良好的生物可降解性、生物相容性、低毒性等生物學(xué)特性［13］。殼聚糖分子與農(nóng)藥化合物之間的靜電作用能提高農(nóng)藥穩(wěn)定性。其納米粒子介孔結(jié)構(gòu)使農(nóng)藥的釋放速率得到控制，很好地延長了農(nóng)藥的作用時(shí)間［14］。

本研究采用離子交聯(lián)法制備出小檗堿-殼聚糖載藥納米粒（簡稱BRCSNP），對所制得的納米粒進(jìn)行工藝優(yōu)化，采用多種分析技術(shù)對其進(jìn)行表征，同時(shí)研究小檗堿-殼聚糖納米粒對人參鏈格孢的抑菌活性和對人參黑斑病的室內(nèi)防效，為人參黑斑病的生物防治提供理論依據(jù)，減少農(nóng)藥使用量，促進(jìn)人參種植的綠色健康發(fā)展。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 化學(xué)試劑及儀器

試驗(yàn)用化學(xué)試劑主要有：小檗堿（純度≥97%，大連美侖生物技術(shù)公司）、殼聚糖（北京索萊寶科技有限公司）、三聚磷酸鈉（上海麥克林生化科技股份有限公司）、醋酸（南京化學(xué)試劑股份有限公司）；氫氧化鈉（西隴科學(xué)股份有限公司）。試驗(yàn)時(shí)間在2023年6月至11月，試驗(yàn)地點(diǎn)位于中國藥科大學(xué)江寧校區(qū)內(nèi)。

試驗(yàn)儀器主要有：精密電子天平（賽多利斯有限公司）、NanoZS90型納米粒度儀（Malvern公司，英國）、島津液相色譜儀LC-2030 Plus（日本SHIMADZU公司）、磁力攪拌器（西安遠(yuǎn)艦儀器設(shè)備有限公司）、Tensor 27傅里葉紅外光譜儀（布魯克光譜儀器公司、JEM-1200 EX透射電鏡（日本JEOL公司）。

1.1.2 ""供試菌株" 人參黑斑病菌（Alternaria panax） CPB，由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3" 供試植株" 健康且生長一致的3年生的人參根，品種為集安大馬芽，由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院人參平臺提供。

1.1.4" 供試培養(yǎng)基" 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（杭州百思生物技術(shù)有限公司）。

1.2" 小檗堿殼聚糖納米粒的制備

為制備小檗堿－殼聚糖納米粒，選用常規(guī)離子交聯(lián)法。稱取CS粉末緩慢溶于1%醋酸中，配制成0.5 mg/mL CS－HAC溶液（pH值為5）。在去離子水溶液中，加入適量的小檗堿粉末，制備成 0.5 mg/mL 的小檗堿溶液，通過磁力攪拌器將二者混合。稱取適量的三聚磷酸鈉（TPP）粉末于去離子水中，緩慢地向混合溶液中滴加，攪拌25 min，配制成0.5 mg/mL TPP水溶液。

1.3" 小檗堿殼聚糖納米粒的單因素考察

采用粒徑和PDI作為評價(jià)指標(biāo)，單因素考察CS濃度、TPP濃度、攪拌速度、攪拌時(shí)間和藥載質(zhì)量比對負(fù)載BR殼聚糖納米粒的影響機(jī)制。

1.3.1" 殼聚糖質(zhì)量濃度

按“1.2”節(jié)中的方法制備BRCSNP，固定攪拌速度為1 000 r/min，攪拌時(shí)間為25 min，TPP與小檗堿濃度為0.5 mg/mL，藥載比為4 ∶1，考察殼聚糖不同濃度（0.25、0.50、1.00、1.50 mg/mL）對納米粒的粒徑和聚合物分散性指數(shù)（PDI）的影響。

1.3.2" TPP質(zhì)量濃度

按“1.2”節(jié)中的方法制備BRCSNP，固定攪拌速度為1 000 r/min，攪拌時(shí)間為25 min，CS與小檗堿濃度為0.5 mg/mL，藥載比為 4 ∶1，考察TPP不同濃度（0.25、0.50、1.00、1.50 mg/mL）對納米粒粒徑、PDI的影響。

1.3.3" 小檗堿與殼聚糖的質(zhì)量比

按“1.2”節(jié)中的方法制備BRCSNP，固定攪拌速度為1 000 r/min，攪拌時(shí)間為25 min，TPP、CS與BR濃度為 0.5 mg/mL，考察小檗堿與殼聚糖不同質(zhì)量比（1 ∶1、1 ∶2、1 ∶4、1 ∶6、1 ∶8）對納米粒的粒徑和PDI的影響。

1.3.4" 攪拌時(shí)間

按“1.2”節(jié)中的方法制備BRCSNP，固定攪拌速度為1 000 r/min，TPP與小檗堿濃度為0.5 mg/mL，藥載比為4 ∶1，考察不同攪拌時(shí)間（10、15、20、25、30 min）對納米粒粒徑、PDI的影響。

1.3.5" 攪拌速度

按“1.2”節(jié)中的方法制備BRCSNP，固定攪拌時(shí)間為20 min，TPP與小檗堿濃度為0.5 mg/mL，藥載比為4 ∶1，考察不同攪拌速度（600、800、1 000、1 200、1 500 r/min）對納米粒粒徑、PDI的影響。

1.4" 小檗堿殼聚糖納米粒的表征

1.4.1" "粒徑和Zeta電位測定以及外觀形貌表征

采用NanoZS90納米粒度分析儀測定了小檗堿納米顆粒的粒徑、PDI和電位。用透射電鏡測試并觀察其形態(tài)特征。

1.4.2" 紅外光譜分析

分別取適量CS、BR、TPP和BRCSNP樣品粉末，采用KBr壓片法進(jìn)行紅外光譜掃描檢測，掃描范圍為400～4 000 cm-1。

1.4.3" 載藥量及包封率的測定

1.4.3.1" 小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線測定" 先稱取5 mg BR原藥，用甲醇溶解并定容至5 mL，得到質(zhì)量濃度為 1 000 μg/mL 的BR甲醇溶液；再依次將其稀釋成200、150、100、80、60、40 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用高效液相色譜（HPLC）測試樣品的峰面積。色譜條件：色譜柱：Kromasil C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）：流動相：甲醇-乙腈-磷酸（0.01 mol/L）溶液（10 ∶28 ∶62，體積比）；流速：1 mL/min；檢測波長：350 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4.3.2" 載藥量及包封率測定" 采用超濾離心法測定小檗堿殼聚糖納米粒包封率（EE）和載藥量（DL）［15］。取適量制備好的小檗堿殼聚糖水分散體系納米粒于Nanosep@10 Ku超濾離心管上端在 15 000 r/min 下離心30 min，取續(xù)濾液按“1.4.3.1”節(jié)中的色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算EE、DL，計(jì)算公式如下：

EE=（C-C1）/C；

DL=W1/（W1+W2）。

式中：C表示總藥物質(zhì)量濃度；C1表示未包封藥物質(zhì)量濃度；W1表示包封藥物質(zhì)量；W2代表所有輔料總質(zhì)量。

1.5" 小檗堿殼聚糖納米粒釋放性能測定

精密量取BR納米?；鞈乙汉虰R溶液2 mL裝于透析袋中，置于盛有PBS（pH值為7.4）緩沖溶液的燒杯中，低速攪拌，分別于0.25、0.50、0.75、1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00、24.00 h取樣，每次取樣1 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，并利用HPLC根據(jù)對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測定，平行測量3次，獲取累計(jì)釋放率［16］。

1.6" 小檗堿殼聚糖納米粒光穩(wěn)定性測試

取適量小檗堿與小檗堿殼聚糖納米粒，放置在距離16 W的紫外燈20 cm處，間隔一定時(shí)間取樣 1 mL，并利用HPLC根據(jù)對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線測量小檗堿的含量，并計(jì)算小檗堿的降解率，來探究小檗堿殼聚糖納米粒的抗光解性能。

1.7" 葉面滯留量研究

采用葉面浸濕稱取法測定小檗堿殼聚糖納米粒在人參葉片表面的葉面滯留量，每個(gè)處理3次重復(fù)，同時(shí)以去離子水在葉片上的滯留量作為對照。取人參展葉期新鮮葉片，使用無菌水沖洗葉片以減少試驗(yàn)誤差，待葉片自然晾干后，利用直徑為 1.5 cm 的打孔器，打出大小相似的葉片圓片。測量葉面干重W1，將葉片完全浸沒在小檗堿殼聚糖納米粒溶液中20 s，將葉面取出，并在葉面沒有液滴滴落時(shí)記錄重量W2。滯留量（Rr）采用如下公式計(jì)算：

Rr=（W2-W1）/S。

式中：S為葉面積。

1.8" 小檗堿殼聚糖納米粒對人參黑斑病的防效測定

1.8.1" 對菌絲生長的影響

處理組為質(zhì)量濃度200 mg/L的小檗堿殼聚糖納米粒溶液，對照組為無菌水加入到融化至40～50 ℃的PDA培養(yǎng)基中，配制成含藥培養(yǎng)基。將直徑為9 mm的人參黑斑病菌接種到處理組和對照組PDA培養(yǎng)基中，每皿接種菌餅1塊，每個(gè)處理重復(fù)3次，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)6 d后測量菌落直徑，菌絲生長抑制率采用如下公式計(jì)算。

菌落生長直徑=重復(fù)試驗(yàn)菌落直徑平均值-9 mm；

菌絲生長抑制率=（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/對照菌落生長直徑×100%。

1.8.2" 離體葉片試驗(yàn)防效測定

在培養(yǎng)皿中鋪1層濕濾紙，放入無菌載玻片。取人參展葉期新鮮葉片，用75%乙醇消毒表面20 s，再用無菌水將表面乙醇沖洗干凈，隨后放置在超凈工作臺晾干。使用無菌牙簽對葉片進(jìn)行創(chuàng)傷處理，向葉片噴灑小檗堿殼聚糖納米溶液，將葉片放置在培養(yǎng)血中的載玻片上，在刺傷處接種人參黑斑病菌餅，上述處理后，置于25 ℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)5 d。以噴灑無菌水作為對照，每組處理5個(gè)重復(fù)，病斑長度采用十字交叉法測量，病斑面積由橢圓公式計(jì)算。

2" 結(jié)果與分析

2.1nbsp; 單因素考察

由表1可知，殼聚糖負(fù)載小檗堿納米粒粒徑和PDI的主要影響因素包括：CS與TPP濃度、藥載質(zhì)量比、攪拌速度與時(shí)間等處方和工藝因素，較優(yōu)處方參數(shù)配比：CS、TPP濃度為0.5 mg/mL、藥載質(zhì)量比為 1 ∶4、攪拌速度為1 000 r/min、攪拌時(shí)間為25 min。

2.2" 小檗堿殼聚糖納米粒的表征

2.2.1" 粒徑和Zeta電位測定以及外觀形貌表征

圖1為BRCSNP的透射電鏡圖，可以看出納米粒為球形顆粒，粒徑約為150 nm。DLS法測得小檗堿殼聚糖納米粒平均粒徑為（141.8±5.8） nm、PDI為0.17±0.02、Zeta電位為+（22.7 ±1.8） mV。

2.2.2" 紅外光譜分析

由紅外圖譜可知，BR、CS、TPP物理混合結(jié)果基本上是峰的疊加，BR特征峰 1 568.29 cm-1 依然存在，主要吸收峰的位置和強(qiáng)度并沒有明顯的變化，而在BECSNP中，BR特征峰發(fā)生了偏移且減弱，BR在指紋區(qū)的一些特征峰 1 388.11、1 037.02 cm-1等消失可以推測BR與CS、TPP之間可能有氫鍵或范德力的形成（圖2）。

2.2.3" 載藥量及包封率

2.2.3.1" 小檗堿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

由小檗堿標(biāo)樣高效液相色譜圖（圖3）可知，小檗堿的保留時(shí)間為4.5 min。以譜圖峰面積對小檗堿的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得到小檗堿HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=71 764x-114 880（r2=0.999）。

2.2.3.2" 載藥量及包封率" 研究結(jié)果表明，所制備的BRCSNP的包封率為87.38%，載藥量為14.76%。

2.3" 小檗堿殼聚糖納米粒的釋放性能分析

按照累計(jì)釋放公式計(jì)算BR和BRCSNP的體外釋放度，結(jié)果如圖4所示，小檗堿原料藥在6 h幾乎釋放完全，BRCSNP在24 h累計(jì)釋放達(dá)72.31%，說明此時(shí)納米粒中小檗堿還未被完全釋放，表明載藥納米膠囊具有較好的緩釋特性。其中納米粒在 0.5 h 內(nèi)累計(jì)釋放量為18.64%，呈現(xiàn)快速釋放的現(xiàn)象，產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因?yàn)槲郊{米粒表面的藥物釋放。

2.4" 小檗堿殼聚糖納米粒的光穩(wěn)定性

BR水溶液和BRCSNP抗紫外性能見圖5。由圖5可知，在紫外燈照射下未包封的BR降解率較高，在72 h后降解率為51.4%，而BRCSNP降解率僅為39.7%，這是由于CS載體作為物理屏障阻隔了紫外光照射，減弱了紫外線對BR的照射分解，從而減緩了BR的光降解速率。小檗堿在抗光解性能方面，遠(yuǎn)優(yōu)于化學(xué)農(nóng)藥分子。

2.5" 小檗堿殼聚糖納米粒葉面滯留量

潤濕性是評判農(nóng)藥藥效的指標(biāo)之一，高黏附性會提高葉面藥液滯留率，減少農(nóng)藥噴施次數(shù)，提高利用率［17］。本試驗(yàn)通過對比BRCSNP、BR水溶液、去離子水在人參葉片上的葉面滯留量來表征農(nóng)藥的潤濕性，結(jié)果見圖6。BR水溶液在葉面的滯留量為17.74 mg/cm2，而BRCSNP的滯留量最高是28.51 mg/cm2，比BR水溶液提高了60.71%，說明封裝的BR具有良好的黏附能力，殼聚糖載體材料可有效提高葉面滯留量，提高葉面潤濕性能，有利于農(nóng)藥的減施增效。

2.6" 小檗堿殼聚糖納米粒對人參黑斑病的防效測定結(jié)果

2.6.1" 小檗堿殼聚糖納米粒對人參黑斑病菌的抑菌活性

在PDA平板中培養(yǎng)6 d后，經(jīng)測量BRCSNP處理組的抑菌率為53.1%，對比對照組菌落已經(jīng)長滿平板，處理組對菌絲生長抑制作用明顯（圖7）。

2.6.2" 離體葉片試驗(yàn)防效測定

在接種人參鏈格孢菌餅7 d后，經(jīng)BRCSNP處理的人參葉片未出現(xiàn)明顯病斑，對照組葉片出現(xiàn)大塊黃褐色病斑；病斑直徑約為2.07 cm，BRCSNP對人參鏈格孢的抑制率為74.91%，表明BRCSNP對人參鏈格孢侵染離體葉片具有良好的防治效果（圖8）。

3" 結(jié)論與討論

針對小檗堿在人參黑斑病防治方面應(yīng)用受限難題，本研究利用離子凝膠法制備小檗堿殼聚糖納米粒（BRCSNP）并進(jìn)行處方工藝優(yōu)化。利用帶有正電荷的殼聚糖和帶有負(fù)電荷的小檗堿，在交聯(lián)劑的作用下，通過離子交聯(lián)法并進(jìn)行處方工藝優(yōu)化制得粒徑為156.8 nm、PDI為0.171的球形納米粒BRCSNP，并測得其包封率為87.38%，載藥量為14.76%。滯留率結(jié)果表明，BRCSNP所具備的獨(dú)特的尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)， 可以增加與生物界面的接觸面積，提升在植物人參葉片表面的滯留和積累， 更好地發(fā)揮藥效。小檗堿天然抗菌活性小分子主要

通過靜電作用加載到CSNP內(nèi)部，并受到載體的保護(hù)，改善了其抗紫外光解性能，有效提高藥物穩(wěn)定性。在人參黑斑病的防效測定中，室內(nèi)菌絲生長速率法以及離體葉片法的測定結(jié)果均表明BRCSNP對人參黑斑病具有良好的防治效果，其中給藥于葉片的抑菌率高達(dá)約74.91%，表現(xiàn)結(jié)果較好，表明本試驗(yàn)植物源農(nóng)藥納米制劑具有良好的植物病害防治前景，對促進(jìn)植物源農(nóng)藥的發(fā)展具有理論與試驗(yàn)參考價(jià)值。

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