不同劑量放射線對(duì)小鼠畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射和外毛細(xì)胞Prestin蛋白表達(dá)的影響△

趙向東 梁勇 任陳 袁亞維

感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失（sensorineural hearing loss，SNHL）是鼻咽癌患者放療后常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和社會(huì)活動(dòng)能力。國(guó)外文獻(xiàn)［1，2］報(bào)道放療后SNHL 的發(fā)生率達(dá)30%～50%，其發(fā)病機(jī)理目前仍不明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為放療導(dǎo)致SNHL 可能與放射線損傷了耳蝸外毛細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)［3］。

2000年Zheng等［4］發(fā)現(xiàn)了沙鼠耳蝸外毛細(xì)胞膜上的一種馬達(dá)蛋白，并命名為Prestin。Prestin蛋白是外毛細(xì)胞膜上馬達(dá)蛋白復(fù)合體的關(guān)鍵組成部分，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上帶電離子的轉(zhuǎn)運(yùn)［5，6］，對(duì)于哺乳動(dòng)物聽(tīng)覺(jué)高度的靈敏性和頻率選擇性至關(guān)重要［7～9］，Zheng等［10］敲除小鼠的Prestin基因后發(fā)現(xiàn)外毛細(xì)胞的電能動(dòng)性降低，聽(tīng)閾上升約50dB，對(duì)聲音頻率的選擇性下降，毛細(xì)胞胞體長(zhǎng)度比正常小鼠的變短且外毛細(xì)胞在逐漸死亡［11，12］。哺乳動(dòng)物的聽(tīng)覺(jué)依賴(lài)于耳蝸外毛細(xì)胞的高頻分辨率和信號(hào)放大作用，Prestin蛋白是外毛細(xì)胞膜的重要組成部分，為了解放射線照射導(dǎo)致的SNHL與Prestin蛋白之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)就不同劑量放射線照射對(duì)Balb／c小鼠畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射和耳蝸外毛細(xì)胞Prestin蛋白表達(dá)的影響作了初步研究，并進(jìn)一步探討放射線照射導(dǎo)致SNHL的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用正常出生后4周齡的雄性Balb／c小鼠48只（由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重17～22g，均排除外耳道及中耳感染并通過(guò)DPOAE檢測(cè)，隨機(jī)分成4組，每組12只（耳）：正常對(duì)照組（不予放射線照射組）、第1組（8Gy放射線照射組）、第2組（12Gy放射線照射組）和第3組（16 Gy放射線照射組）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 各照射組耳部放射線照射方法 小鼠稱(chēng)重，2%戊巴比妥鈉溶液按0.3ml／100g的劑量行腹腔注射麻醉后，俯臥位固定，在X 線下定位，確定內(nèi)耳照射區(qū)域，然后于相同體位固定在直線加速器治療床上，美國(guó)Varian2100直線加速器6MeV 電子線、劑量率為400cGy／min、源皮距100cm，用鉛檔塊避免呼吸道、消化道受照，參考深度為皮下1.5cm，分別給予3個(gè)照射組小鼠右側(cè)內(nèi)耳單次8、12、16Gy劑量放射線照射，對(duì)照組不予放射線照射。

1.2.2 DPOAE 檢測(cè) 放射線照射后第7 天對(duì)各組小鼠分別進(jìn)行DPOAE檢測(cè)。將被檢測(cè)小鼠置于隔聲室中，用2%戊巴比妥鈉溶液0.3ml／100g腹腔注射麻醉，水溫40 ℃熱水袋保溫。用美國(guó)GSI型聽(tīng)力計(jì)進(jìn)行測(cè)試，兩個(gè)初始音強(qiáng)度皆為80dB SPL，兩者頻率之比為f1／f2=1.22，測(cè)試頻率范圍為3～12kHz，即分別測(cè)試3、4、6、8、10、12kHz 6個(gè)頻率，讀取2f1－f2處的強(qiáng)度。反應(yīng)幅值以高于本底噪聲3dB為標(biāo)準(zhǔn)記錄并計(jì)算。

1.2.3 Western Blot分析Prestin蛋白的表達(dá) 放射線照射第7天，各組每2只小鼠右側(cè)耳蝸?zhàn)鳛橐粋€(gè)樣本，每組共6個(gè)樣本，研磨成粉末后加入200μl的RIPA 組織裂解液，勻漿，離心并取上清液。各組取總蛋白200μl經(jīng)10%SDS—PAGE 凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，然后用20 ml含5%脫脂奶粉的TBS緩沖液4 ℃封閉18小時(shí)，洗膜后，加入羊抗鼠Prestin 多克隆抗體（1：200），經(jīng)兔抗羊IgG（1：3 000）二抗（美國(guó)Santa Cruz公司）雜交，最后在暗室內(nèi)加入ECL 化學(xué)發(fā)光底物，曝光，依次放入顯影液和定影液。選用β－actin 作為內(nèi)參照，并用凝膠成像系統(tǒng)軟件SC805凝膠成像系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析結(jié)果。各組中Prestin蛋白與β－actin 吸光度的比值與正常組比較，判斷其表達(dá)變化。

1.2.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)Prestin mRNA 的表達(dá) 從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找出小鼠Prestin基因序列.使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)小鼠Prestin引物、探針，內(nèi)參β－actin引物及探針序列由廣州美津生物技術(shù)有限公司提供（表1）。小鼠耳蝸剝離后，立即放入液氮中，隨后轉(zhuǎn)入－80 ℃保存待勻漿，樣本收集完后用Biozol法分別抽提總RNA。各組中分別取1μg總RNA 電泳，檢測(cè)RNA 質(zhì)量；隨后取RNA 1μg，按照ReverTra Ace－a－反轉(zhuǎn)錄試劑盒［東洋紡（上海）生物科技有限公司］說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA 的合成。反應(yīng)條件的設(shè)置：37 ℃15min，98 ℃5min，反應(yīng)結(jié)束后保存于－20 ℃待用。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物連續(xù)10倍梯度稀釋?zhuān)缓笠詢(xún)?nèi)參β－actin引物進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系為20μl，根據(jù)表2配置。反應(yīng)條件為95 ℃2min；95 ℃15 s，60 ℃40s，45個(gè)循環(huán)，60 ℃獲取熒光信號(hào)；循環(huán)結(jié)束后從65 ℃升高到95 ℃獲取溶解曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

表1 使用的引物

表2 20μl熒光定量PCR 反應(yīng)體系

2 結(jié)果

2.1 DPOAE檢測(cè)結(jié)果 4組小鼠80dB SPL刺激聲下各頻率的DPOAE幅值見(jiàn)表3，第1、2和3組小鼠3、4、6、8、10和12kHz DPOAE幅值均較正常對(duì)照組小鼠降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常對(duì)照組、第1組、第2組和第3組小鼠DPOAE 幅值依次逐漸降低，在3、4、6、8、12kHz的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在10kHz的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組小鼠不同頻率DPOAE幅值比較（dB SPL，±s）

表3 各組小鼠不同頻率DPOAE幅值比較（dB SPL，±s）

組別耳數(shù)（耳）頻率（kHz）3 4 6 8 10 12正常對(duì)照組12 21.0±0.7 6.4±0.8 21.7±7.2 30.0±3.3 35.8±4.1 37.3±3.9第1組12 20.1±0.7 6.1±0.4 12.7±1.6 25.9±10.1 25.7±4.1 28.6±2.0第2組12 20.0±0.9 5.7±0.7 11.5±1.4 24.2±7.0 24.3±6.6 27.3±3.4第3組12－7.1±3.3－11.0±2.8 5.0±2.2 20.6±4.5 23.2±5.8 26.7±5.5 F 5.316 8.693 5.547 4.881 1.490 3.295 P 0.003 0.000 0.003 0.005 0.230 0.029

2.2 各組動(dòng)物耳蝸組織Prestin蛋白表達(dá) 不同劑量放射線照射均抑制了Prestin蛋白的表達(dá)，與正常對(duì)照組比較，第1、2和3組小鼠耳蝸組織Prestin蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著放射線劑量的增加，小鼠耳蝸組織Prestin蛋白的表達(dá)逐漸下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1、2。

2.3 各組動(dòng)物耳蝸組織Prestin mRNA 的相對(duì)表達(dá) Prestin mRNA的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖3，可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比較，不同劑量放射線照射后小鼠耳蝸組織Prestin mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨著放射線劑量的增加，正常對(duì)照組、第1、2和3組小鼠耳蝸組織Prestin mRNA 相對(duì)表達(dá)量依次逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠耳蝸組織Prestin的表達(dá)

圖2 各組小鼠耳蝸組織Prestin蛋白的相對(duì)表達(dá)量

圖3 各組小鼠耳蝸組織Prestin mRNA 相對(duì)表達(dá)量

3 討論

鼻咽癌（carcinoma of nasopharynx，NPC）是我國(guó)南方地區(qū)高發(fā)的惡性腫瘤之一，大部分為低分化鱗癌，放射治療是鼻咽癌等頭頸部惡性腫瘤的主要治療手段。眾所周知，放射治療頭頸部腫瘤常導(dǎo)致感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失，如：鼻咽癌患者在接受完整的放射治療后很快就會(huì)出現(xiàn)感音神經(jīng)性聽(tīng)力下降，尤其在高頻最常見(jiàn)，并且這種聽(tīng)力損傷是不可逆的，這可能與放射線對(duì)耳蝸結(jié)構(gòu)、功能的受損有關(guān)［13～15］。放射線導(dǎo)致的感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失的程度與耳蝸吸收的射線劑量的大小密切相關(guān)，對(duì)內(nèi)耳放射劑量的限制可降低感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失程度及發(fā)生率［16，17］。小劑量放射線照射即可導(dǎo)致耳蝸組織結(jié)構(gòu)的損傷，Kim 等［18］報(bào)道10～15Gy單一劑量放射線照射即可引起內(nèi)耳毛細(xì)胞的明顯損傷；范靜平等［19］用20Gy60Co對(duì)豚鼠內(nèi)耳進(jìn)行照射，結(jié)果提示豚鼠內(nèi)耳在小劑量放射線照射后受到了潛在的損傷。放療引發(fā)的聽(tīng)力損傷早期診斷非常重要，目前多通過(guò)DPOAE監(jiān)測(cè)耳蝸功能，其敏感性?xún)?yōu)于純音測(cè)聽(tīng)，可早期判斷是否有耳蝸功能的損傷。Akmansu等［20］以DPOAE為檢查方法進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)放射線照射后1 周、8 周所有頻率DPOAE 幅值均有下降趨勢(shì)。從文中結(jié)果看，給予不同劑量的放射線照射后，3組照射組小鼠3、4、6、8、10和12kHz的DPOAE幅值均較正常對(duì)照組小鼠降低，隨著放射線劑量的增加，各照射組小鼠的DPOAE 幅值依次逐漸降低。說(shuō)明放射線照射導(dǎo)致了小鼠耳蝸功能的受損，與范靜平等［21］研究發(fā)現(xiàn)放射線照射早期電鏡下即可見(jiàn)豚鼠耳蝸基底回外毛細(xì)胞纖毛消失，大量外毛細(xì)胞壞死溶解的結(jié)果相符。由此可見(jiàn)，DPOAE檢測(cè)可在一定條件下反映鼻咽癌患者放療后外毛細(xì)胞受損狀況，提示受損的基底膜節(jié)段，可以及早發(fā)現(xiàn)患者內(nèi)耳功能的損傷，為臨床防護(hù)及早期干預(yù)提供依據(jù)。

放射線照射后出現(xiàn)感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失的損傷機(jī)理尚未明確，目前主要有以下兩種推測(cè)：其一是輻射直接作用于感覺(jué)細(xì)胞引起膜結(jié)構(gòu)如細(xì)胞膜、線粒體膜、溶酶體膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用及細(xì)胞核中DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞代謝障礙，使毛細(xì)胞變性、壞死、功能異常。Kim 等［18］發(fā)現(xiàn)在一次較大劑量輻射后18h豚鼠耳蝸毛細(xì)胞即出現(xiàn)常染色質(zhì)凝集、異染色質(zhì)分散及線粒體多樣改變、液泡形成；張孝文等［22］采用60Co照射豚鼠的耳顳區(qū)，然后對(duì)耳蝸毛細(xì)胞進(jìn)行DNA 損傷檢測(cè)，結(jié)果表明對(duì)照組與各照射組（劑量40Gy、70Gy）之間內(nèi)毛細(xì)胞DNA 損傷差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且隨照射劑量增加DNA 損傷加重，故認(rèn)為，放射治療后內(nèi)耳毛細(xì)胞DNA 損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡是致聾的重要機(jī)制。其二是血管紋及其中微小血管的損傷，引起內(nèi)耳微循環(huán)障礙。Kim 等［18］在電鏡下觀察到耳蝸血管紋形態(tài)的變化為胞內(nèi)和血管旁液體聚集；楊新明等［23］發(fā)現(xiàn)40Gy的放射線照射24 h，豚鼠耳蝸血管紋的邊緣細(xì)胞、中間細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及周?chē)g質(zhì)輕度水腫，2周后病變加重，線粒體腫脹、變形，而螺旋器的病變相對(duì)較輕，推測(cè)血管紋比螺旋器對(duì)輻射更為敏感，輻射導(dǎo)致內(nèi)耳損傷最早變化的是血管紋，認(rèn)為輻射致內(nèi)耳循環(huán)障礙是內(nèi)耳損傷最主要的致病機(jī)理。馬達(dá)蛋白Prestin對(duì)于哺乳動(dòng)物聽(tīng)覺(jué)靈敏性和頻率選擇性的重要性已被諸多學(xué)者所證實(shí)［7～9］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予不同劑量的放射線照射后，小鼠的聽(tīng)覺(jué)功能明顯受損，且在放射線照射后第7天各組小鼠耳蝸組織Prestin蛋白及Prestin mRNA 的表達(dá)量較正常對(duì)照組小鼠下降，且隨著放射線劑量的增加，其表達(dá)量依次逐漸下降，由此推測(cè)放射線照射后的聽(tīng)力損失可能還與放射線導(dǎo)致耳蝸外毛細(xì)胞Prestin蛋白功能表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

有文獻(xiàn)報(bào)道［24］：放射線照射導(dǎo)致的SNHL 主要表現(xiàn)為低、中、高頻段全頻率范圍內(nèi)不同程度的聽(tīng)力下降，Akmansu等［20］研究放療總量55Gy 對(duì)大鼠的影響，行2～6kHz頻率范圍內(nèi)的DPOAE 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在該頻率范圍內(nèi)DPOAE 的幅值在放療后第1～8周呈增加趨勢(shì)。目前本次實(shí)驗(yàn)只是就不同劑量的放射線單次單側(cè)照射對(duì)Balb／c小鼠畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（3～12kHz頻率范圍）和耳蝸外毛馬達(dá)蛋白Prestin表達(dá)的影響及放射線照射導(dǎo)致感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失的可能機(jī)制作了初步的探討，今后尚需要擴(kuò)大DPOAE檢測(cè)的頻率范圍，利用掃描電鏡、耳蝸免疫組化等技術(shù)，結(jié)合耳蝸毛細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、病理學(xué)觀察，進(jìn)行更深入、系統(tǒng)的臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。

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