鐘 戀， 汪云偉， 楊詩龍， 黎 量， 劉玉杰， 黃勤挽

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都611137)

地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的新鮮或干燥塊根。生地黃性甘、寒，功效以清熱涼血、養(yǎng)陰生津為主;熟地黃性甘、溫，功效以補血滋陰、填精益髓為主［1］。地黃經(jīng)酒燉炮制，化學(xué)成分發(fā)生改變［2-4］，其“味”也發(fā)生一定的變化。文獻 ［5］指出，中藥的“味”和它本身的化學(xué)成分具有密切關(guān)系，而近年來發(fā)展起來的電子舌技術(shù)是一種分析、識別液體“味”的新型檢測手段［6］。因此，本實驗采用HPLC法測定地黃酒燉過程中梓醇、毛蕊花糖苷及5-羥甲基糠醛 (5-HMF)的含有量變化，分析地黃酒燉過程化學(xué)成分的變化規(guī)律;同時采用電子舌技術(shù)采集地黃酒燉炮制過程“味”的電子舌響應(yīng)值，應(yīng)用統(tǒng)計質(zhì)量分析 (SQC)模型分析其“味”的變化規(guī)律;最后對“味”的電子舌響應(yīng)與化學(xué)成分的相關(guān)性進行探索。

1 儀器與試藥

島津LC-2010A自動高效液相色譜儀 (包括四元泵、單波長檢測器、柱溫箱、自動進樣器、LC-solution色譜工作站)，ASTREE電子舌 (法國Alpha.MOS公司)，BP 211D電子天平 (德國賽多利斯股份有限公司)，優(yōu)普超純水制造系統(tǒng) (四川優(yōu)普超純科技有限公司)，恒溫水浴鍋，超聲波儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)，色譜甲醇、色譜乙腈 (美國Fisher公司)，黃酒 (浙江古越龍山紹興酒股份有限公司)，磷酸、冰醋酸均為分析純。梓醇對照品、毛蕊花糖苷對照品、5-HMF對照品購于成都曼斯特生物科技有限公司，批號分別為 MUST-13030609、 MUST-13122711、 MUST-13110805。生地黃購于河南省焦作市武陟縣，由成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥塊根。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制品制備 取大小均勻生地黃4 kg，清水淘洗3次除去泥沙，加黃酒1.6 kg潤透后置于陶瓷鍋內(nèi)，密閉后隔水燉制24 h，在0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、24 h 分別取樣200 g，編號，樣品置于40℃烘箱干燥12 h，備用。

2.2 化學(xué)成分定量測定

2.2.1 色譜條件 Global chromatography C18色譜柱 (250 mm ×4.6 mm，5μm)，測定梓醇流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液 (1∶99)，檢測波長210 nm;測定毛蕊花糖苷流動相為乙腈-0.1%醋酸溶液 (16∶84)，檢測波長 334 nm［1］;測定5-HMF流動相為甲醇-水 (5∶95)，檢測波長284 nm。體積流量1 mL/min，柱溫30℃。

2.2.2 對照品溶液制備 取梓醇、毛蕊花糖苷、5-HMF對照品適量，分別加乙腈-0.1%磷酸溶液(1∶99)、乙腈-0.1%醋酸溶液 (16∶84)、甲醇制備成0.215、0.0313、0.0768 mg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 參考《中國藥典》2010年版一部地黃項下［含量測定］樣品處理方法進行供試品制備［1］，得測定梓醇供試品溶液 (供試品溶液1)和測定毛蕊花糖苷的供試品溶液 (供試品溶液2)。另取地黃樣品粗粉，精密稱取約1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入20%甲醇25 mL，超聲提取30 min，搖勻，過濾，取濾液0.45 μm微孔濾膜濾過，得測定5-HMF的供試品溶液 (供試品溶液3)。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密取0.384 mg/mL的5-HMF對照品溶液，加甲醇分別稀釋成0.0768、0.0384、0.00768 mg/mL的對照品溶液，結(jié)果5-HMF進樣量在0.015～0.768 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系 (線性方程:y=4.31×106x+5128.79，r=0.9998)。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一地黃樣品，按“2.2.3”項所述供試品溶液3制備方法制備，分別在配制后0、4、8、12、16、20、24 h進樣10 μL，結(jié)果5-HMF峰面積積分值RSD為2.5%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取供試品溶液3，按上述色譜條件，重復(fù)進樣6次，結(jié)果5-HMF峰面積積分值RSD為1.3%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一地黃樣品粉末6份，分別制備供試品溶液，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定峰面積，用外標兩點法計算。結(jié)果5-HMF平均含有量為0.067%，RSD為1.8%，表明測定5-HMF方法重復(fù)性良好。

2.2.8 回收率試驗 采用加樣回收法，稱取已知含有量的地黃樣品 (JD S13)6份，每份1.0 g，精密稱定，分別加入0.213 mg/mL的5-HMF對照品溶液3 mL，超聲處理30 min，同上測定，計算5-HMF的回收率，結(jié)果見表1。

表1 5-HMF加樣回收率試驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests for 5-HMF

2.2.9 樣品測定 精密吸取梓醇對照品溶液、5-HMF對照品溶液、供試品溶液1、供試品溶液3各10 μL及毛蕊花糖苷對照品溶液、供試品溶液220 μL，注入液相色譜儀中，梓醇、毛蕊花糖苷按外標一點法計算，5-HMF按外標二點法計算，以干燥品計，結(jié)果見表2。

2.3 電子舌技術(shù)“味”動態(tài)變化分析

2.3.1 樣品處理 取地黃樣品粗粉，精密稱定1.0 g，加水100 mL，超聲提取30 min，過濾，取濾液50 mL加水定容至100 mL，備用。

表2 樣品測定結(jié)果 (n=3)Tab.2 Determination of samples(n=3)

2.3.2 分析方法 采集溫度25℃，數(shù)據(jù)采集時間120 s，采集周期1 s，攪動速度1 r/s。以超純水為清洗液，每次測量樣品前清洗傳感器10 s。將配制好的樣品溶液置于100 mL專用燒杯中，進行電子舌測定。每份樣品平行測定10次，取其中最后3次穩(wěn)定可靠數(shù)據(jù)作為輸出值進行后期分析處理。

2.3.3 精密度考察 電子舌由 ZZ、AB、BB、CA、GA、DA、JE7個傳感器進行數(shù)據(jù)采集，以100～120 s內(nèi)傳感器平均響應(yīng)值作為輸出值。采用“2.3.1”項及“2.3.2”項所述分析方法采集數(shù)據(jù)，進行精密度考察。重復(fù)測定同一樣品10次，取其中最后3次數(shù)據(jù)作為輸出值。數(shù)據(jù)精密度結(jié)果如表3，結(jié)果顯示各傳感器輸出值 RSD均小于3%，數(shù)據(jù)結(jié)果穩(wěn)定，儀器精密度良好。

表3 電子舌精密度考察結(jié)果Tab.3 Inspection results of precision in electronic tongue

2.3.4 統(tǒng)計質(zhì)量分析 (SQC) SQC是在考慮樣本的差異性的基礎(chǔ)上，通過計算參考樣本得出接受區(qū)域和拒絕區(qū)域。未知樣本被映射到圖表中，得出結(jié)論接受或拒絕。對每個數(shù)據(jù)點而言它在單元內(nèi)的距離表明了差異［7］。

將地黃酒燉炮制過程共14個樣品的電子舌傳感器響應(yīng)值進行SQC分析，以未燉樣品 (JD S0)樣品為參照樣本建立SQC模型，將其他樣品與其進行比較，結(jié)果如圖1。

圖1 地黃酒燉炮制過程樣品SQC分析圖Fig.1 SQC analysis chart of stewing Rehmanniae Radix with wine

由圖1可見，地黃未燉樣品 (JD S0)與其他酒燉樣品“味”的電子舌傳感器響應(yīng)值差異較大，表明未燉樣品與酒燉樣品之間“味”差異明顯，可以通過電子舌實現(xiàn)區(qū)分。隨著炮制程度加重，樣品“味”電子舌傳感器響應(yīng)值呈現(xiàn)明顯變化趨勢，未燉樣品與酒燉樣品的差異越來越大。JD S13至JD S24“味”的電子舌傳感器響應(yīng)值變化較大，表明地黃在酒燉的13 h后的階段“味”的變化較明顯。

2.4 相關(guān)性探索 相關(guān)性分析通過運用SPSS 17.0軟件對電子舌測定的7個傳感器響應(yīng)值進行主成分抽取降維［8］，得第一主成分得分FAC1和第二主成分得分 FAC2，其貢獻率分別為 55.579%和37.268%，累計貢獻率達92.847%，因此可認為FAC1和FAC2能夠代表樣品的電子舌響應(yīng)值特征。將FAC1、FAC2與梓醇、毛蕊花糖苷、5-HMF的量運用SPSS 17.0軟件進行相關(guān)性分析，由于各變量均不服從正態(tài)分布，因此采用斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)，分析結(jié)果如表4。

從表4可以看出，F(xiàn)AC2與梓醇、毛蕊花糖和5-HMF均有顯著的相關(guān)性 (P＜0.01)，其中與梓醇的相關(guān)系數(shù)達0.95以上;FAC1與以上化學(xué)成分的相關(guān)性不顯著。

表4 地黃樣品測定數(shù)據(jù)相關(guān)性系數(shù)分析結(jié)果Tab.4 Measurement data correlation coefficient analysis results of samples

3 結(jié)論與討論

在進行5-HMF定量測定時，對不同比例的甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸及乙腈-0.1%磷酸流動相進行考察，結(jié)果表明以甲醇-水 (5∶95)為流動相時，5-HMF色譜峰分離效果好，色譜重復(fù)性好。對提取溶劑進行了考察，分別選擇甲醇，50%甲醇，20%甲醇和水作為提取溶劑，結(jié)果20%甲醇能更為有效地提取樣品中的5-HMF。

隨著酒燉程度加重，地黃中梓醇含有量明顯下降。梓醇為環(huán)烯醚萜葡萄糖苷，在加工過程中容易發(fā)生苷鍵斷裂脫去糖基而降解［9］，這可能是其含有量隨炮制程度加重而明顯下降的原因。毛蕊花糖苷隨酒燉程度加重含有量也呈明顯下降，而其在地黃加工炮制過程發(fā)生何種變化目前還未見報道，有待進一步研究。根據(jù)實驗結(jié)果，5-HMF含有量則隨炮制程度加重呈上升趨勢，酒燉11 h后含有量上升明顯。5-HMF是具有代表性的美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物，也用于判斷是否發(fā)生了美拉德反應(yīng)［10］，其主要存在于可能發(fā)生糖降解反應(yīng)和美拉德反應(yīng)的食品和植物中［11］。地黃酒燉過程5-HMF大量產(chǎn)生，因此推斷糖降解反應(yīng)和美拉德反應(yīng)可能是地黃酒燉炮制機理之一。

電子舌技術(shù)檢測酒燉過程地黃性狀“味”的特征，實現(xiàn)對“味”的客觀化。隨著炮制程度加重，各樣品“味”的電子舌響應(yīng)值變化趨勢呈現(xiàn)規(guī)律，能體現(xiàn)出酒燉前后的差異，因此電子舌技術(shù)結(jié)合SQC分析方法可以實現(xiàn)地黃酒燉炮制過程的質(zhì)量監(jiān)控。同時筆者對樣品“味”的電子舌響應(yīng)值與梓醇、毛蕊花糖苷、5-HMF含有量變化的相關(guān)性進行了探索研究，結(jié)果顯示電子舌響應(yīng)值降維后的FAC2與梓醇、毛蕊花糖苷和5-HMF的含有量變化均有顯著相關(guān)性，F(xiàn)AC1與3種化學(xué)成分含有量變化沒有顯著相關(guān)性，但FAC2貢獻率僅有37.268%，因此認為梓醇、毛蕊花糖苷和5-HMF3種成分的含有量變化與“味”電子舌響應(yīng)值變化雖然具有一定的相關(guān)性，但引起地黃炮制“味”變化的主要物質(zhì)可能還有其他化學(xué)成分，將進行進一步研究。

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