劉軍彤，吳敬，陳晟

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 2141222 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

工業(yè)生物技術(shù)

分散泛菌蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中的表達(dá)及發(fā)酵優(yōu)化

劉軍彤1，2，吳敬1，2，陳晟1，2

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122
2 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

劉軍彤， 吳敬， 陳晟. 分散泛菌蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中的表達(dá)及發(fā)酵優(yōu)化. 生物工程學(xué)報(bào)， 2016， 32（8）: 1070-1080.

Liu JT， Wu J， Chen S. Expression and production optimization of sucrose isomerase from Pantoea dispersa in Escherichia coli. Chin J Biotech， 2016， 32（8）: 1070-1080.

為了提高分散泛菌Pantoea dispersa UQ68J來源的蔗糖異構(gòu)酶產(chǎn)量，研究了不同信號(hào)肽及發(fā)酵條件對(duì)蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中重組表達(dá)的影響。將攜帶天然信號(hào)肽的蔗糖異構(gòu)酶基因優(yōu)化后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichia coli BL21 （DE3） 構(gòu)建重組表達(dá)菌株——ORI菌株，搖瓶發(fā)酵總酶活和胞外酶活分別為85 U/mL、65 U/mL。從天然信號(hào)肽開始第22位氨基酸作為成熟蛋白的起始，連接PelB或OmpA信號(hào)肽構(gòu)建P22和O22菌株，其中P22菌株發(fā)酵總酶活提高至138 U/mL，是ORI菌株總酶活的1.6倍；而O22菌株發(fā)酵總酶活和ORI菌株無明顯差別。采用3.0 g/L的乳糖誘導(dǎo)，P22菌株的蔗糖異構(gòu)酶總酶活提高至168 U/mL。在3 L發(fā)酵罐中，研究甘氨酸濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蔗糖異構(gòu)酶分泌的影響，當(dāng)補(bǔ)加0.5%甘氨酸，DCW為18 g/L （OD600=30）開始誘導(dǎo)，P22菌株的蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活最高達(dá)1 981 U/mL，同時(shí)蔗糖異構(gòu)酶總酶活達(dá)到2 640 U/mL，是已報(bào)道大腸桿菌重組表達(dá)蔗糖異構(gòu)酶的最高水平。

蔗糖異構(gòu)酶，信號(hào)肽，發(fā)酵優(yōu)化

異麥芽酮糖 （6-O-a-D-吡喃葡糖基-D-果糖）是蔗糖的 1種同分異構(gòu)體，其很多物理性質(zhì)與蔗糖相似，如具有甜度、易溶于水等［1-2］。此外，異麥芽酮糖不易水解，被食用后，人體內(nèi)葡萄糖和胰島素濃度仍然維持在一定范圍內(nèi)，能夠有效預(yù)防糖尿病，因此被看作糖尿病患者的理想食品［3-4］。目前，異麥芽酮糖作為食品添加劑，已經(jīng)應(yīng)用于糕點(diǎn)、糖果、飲料等食品領(lǐng)域，且需求量不斷增加。然而，天然的異麥芽酮糖主要存在于蜂蜜、甘蔗汁中，其含量非常低，無法滿足市場(chǎng)需求。工業(yè)上異麥芽酮糖主要通過蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖來獲得［5］。

蔗糖異構(gòu)酶能催化蔗糖生成異麥芽酮糖和海藻酮糖，并生成少量的葡萄糖和果糖［5-7］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，來源于大黃歐文氏菌 Erwinia rhapontici NCPPB1578［7］、大黃歐文氏菌E. rhapontici NX-5［8］、歐文氏桿菌屬Erwinia sp. D12［9］、克雷伯氏肺炎菌Klebsiella pneumonia NK33-98-8［10］、紅 色 精 朊 桿 菌Protaminobacter rubrum CBS574.77［11］、克雷伯氏桿菌屬 Klebsiella sp. LX3［12］、普城沙雷氏菌Serratia plymuthica ATCC15928［13］、P. dispersa UQ68J［14］等的蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖產(chǎn)生的主產(chǎn)物為異麥芽酮糖，轉(zhuǎn)化率介于 65%-91%，其中來源于 P. dispersa UQ68J的蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中表達(dá)，其純酶轉(zhuǎn)化率高達(dá)91.0%，是已報(bào)道的最高轉(zhuǎn)化率［15］。

此外，目前報(bào)道的采用野生菌生產(chǎn)的蔗糖異構(gòu)酶，大部分產(chǎn)量較低。因此，有人嘗試構(gòu)建重組菌株來表達(dá)蔗糖異構(gòu)酶，以提高蔗糖異構(gòu)酶的產(chǎn)量。目前，E. rhapontici NX-5［8］、Klebsiella sp. LX3［12］、P. rubrum CBS574.77［11］、E. rhapontici DSM 4484［16］、腸桿菌屬Enterobacter sp.FMB-1［17］、K. pneumonia NK33-98-8［10］、植生克雷伯氏菌 Klebsiella planticola UQ14S［14］來源的蔗糖異構(gòu)酶都已成功在大腸桿菌中重組表達(dá)。蔗糖異構(gòu)酶的表達(dá)量介于15-654 U/m L。程勝等采用高密度發(fā)酵，胞外蔗糖異構(gòu)酶酶活達(dá)到654 U/m L，是目前文獻(xiàn)報(bào)道最高的酶活［15，18］。此外，來源于Enterobacter sp. FMB-1的蔗糖異構(gòu)酶還在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae［19］和乳酸乳球菌Lactococcus lactis MG1363［20］中重組表達(dá)，但其表達(dá)量相對(duì)較低。

Wu 篩選獲得的P. dispersa UQ68J，該菌株生產(chǎn)的蔗糖異構(gòu)酶能夠高效合成異麥芽酮糖。但將去除信號(hào)肽 （1-33位氨基酸） 的蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中克隆表達(dá)，可溶性蔗糖異構(gòu)酶的含量很低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)［14］。因此，本實(shí)驗(yàn)以P. dispersa UQ68J來源的蔗糖異構(gòu)酶為研究對(duì)象，嘗試更換信號(hào)肽提高蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中的表達(dá)量，同時(shí)采用高密度發(fā)酵實(shí)現(xiàn)蔗糖異構(gòu)酶的高產(chǎn)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1基因和菌株

根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性對(duì)來源于 P. dispersa UQ68J的蔗糖異構(gòu)酶完整基因 （NCBI Accession Number AY223549.1，包括信號(hào)肽和成熟肽） 進(jìn)行基因優(yōu)化并合成 （Generay，上海）。將合成的基因與 pMD-18T連接，轉(zhuǎn)入 E. coli JM 109擴(kuò)增重組質(zhì)粒，利用NdeⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，經(jīng)核酸電泳和基因片段純化后，連接無信號(hào)肽的表達(dá)載體 pET-24a （+） 構(gòu)建重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli JM 109進(jìn)行擴(kuò)增，基因測(cè)序正確后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E. coli BL21 （DE3），獲得ORI菌株 （表2）。

表1　更換信號(hào)肽引物Table 1 Primers used in changing signal pep tides

表2　構(gòu)建的菌株及其特征Tab le 2 The recombinant stains and the property

1.1.2試劑

質(zhì)粒小提試劑盒 （天根生化科技有限公司）；蛋白電泳試劑和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) （南通碧云天技術(shù)研究所）；卡那霉素 （上海生工生物有限公司）；蛋白胨、酵母粉 （英國Oxoid公司）；異麥芽酮糖、海藻酮糖標(biāo)樣 （Sigma公司）；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基

LB種子培養(yǎng)基 （g/L）：蛋白胨 10.0，酵母粉 5.0，和NaCl 10.0。

TB培養(yǎng)基 （g/L）：蛋白胨 12.0，酵母粉24.0，甘油 5.0，KH2PO4·3H2O 2.3，K2HPO416.4。

3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基 （g/L）：（NH4）2HPO44.0，KH2PO4·3H2O 13.5，檸檬酸·H2O 1.7，MgSO40.8，工業(yè)蛋白胨 1.0，工業(yè)酵母粉 2.0，甘油 8.0；并添加微量元素10 m L/L，用氨水調(diào)節(jié)pH至 7.0。

微量元素液 （g/L）：Al2（SO4）3·18H2O 2.0，CoSO4·7H2O 0.75，H3BO30.5，MnSO4·H2O 14.6，Na2MoSO43.0，NiSO4·6H2O 2.5，ZnSO4·7H2O 15.0。

補(bǔ)加培養(yǎng)基 （g/L）：甘油600.0，MgSO49.0，工業(yè)酵母粉4.8，工業(yè)蛋白胨 2.4。

誘導(dǎo)劑為20 g/L的乳糖。

1.1.4主要儀器

凝膠成像儀、蛋白電泳儀 （美國Bio-Rad公司）；Agilent 1 100 高效液相色譜儀 （美國安捷倫公司）；細(xì)胞破碎儀 （浙江寧波新芝生物科技股份有限公司）；3 L-Infors 全自動(dòng)發(fā)酵罐 （伊孚森生物技術(shù)有限公司）。

1.2方法

1.2.1信號(hào)肽的更換

PelB信號(hào)肽，其堿基序列為：5′-ATGAAAT ACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCT GCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCC-3′。OmpA信號(hào)肽，其堿基序列為：5′-ATGAAAAA GACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGC TGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCC-3′。PelB、OmpA信號(hào)肽前期已經(jīng)連接到表達(dá)載體pET-24a （+） 上，同時(shí)兩信號(hào)肽的堿基序列末端和pET-24a （+） 載體間插入了ATGG 4個(gè)堿基來添加Nco I限制性酶切位點(diǎn)。

根據(jù)蔗糖異構(gòu)酶基因序列，分別設(shè)計(jì)以22、34位點(diǎn)為起始氨基酸的上游引物F22和F34，及下游引物R22/34。

以P22重組菌株的構(gòu)建為例：設(shè)計(jì)引物F22 和R22/34，以優(yōu)化的蔗糖異構(gòu)酶基因作為模板，經(jīng)PCR獲得22位點(diǎn)為起始氨基酸的堿基序列，將其與 pMD18T-simple載體連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli JM 109進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)Nco I和Xho I限制性內(nèi)切酶酶切，采用核酸電泳和基因片段純化獲得目的堿基序列，將純化后的目的序列與含有PelB信號(hào)肽的表達(dá)載體pET-24a （+） 連接，轉(zhuǎn)入E. coli JM 109擴(kuò)增質(zhì)粒，基因測(cè)序正確后，轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E. coli BL21 （DE3） 中，即獲得表達(dá)菌株P(guān)22。按照同樣方法通過PCR擴(kuò)增、限制性酶切等分子操作獲得起始氨基酸分別為 22 和34位點(diǎn)的兩個(gè)目的片段的堿基序列，將其分別與攜帶 PelB、OmpA信號(hào)肽的表達(dá)載體pET-24a （+） 連接。將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli BL21 （DE3），則分別獲得P22、P34、O22、O34重組菌株。

1.2.2搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將構(gòu)建好的重組菌株接種到LB培養(yǎng)基中，根據(jù)載體的抗性添加抗生素 （卡那霉素終濃度30 μg/m L，氨芐青霉素終濃度 100 μg/m L），37 ℃、200 r/m in培養(yǎng)8 h。將上述培養(yǎng)的表達(dá)菌株的種子培養(yǎng)液按 5%接種量，轉(zhuǎn)接到含有50 m L TB培養(yǎng)基的搖瓶中，并補(bǔ)加終濃度為30 μg/m L的卡那霉素。37 ℃培養(yǎng)至OD600=1.0，根據(jù)需要添加誘導(dǎo)劑IPTG （終濃度0.1 mmol/L）、乳糖 （終濃度1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/L）誘導(dǎo)，或者不添加誘導(dǎo)劑，25 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。定時(shí)取樣，分別測(cè)定樣品的 OD600、DCW （細(xì)胞干重） 和蔗糖異構(gòu)酶的酶活。

1.2.3生物反應(yīng)器發(fā)酵培養(yǎng)

在3 L發(fā)酵罐中，按照10%的接種量添加種子培養(yǎng)液到半合成培養(yǎng)基中，并補(bǔ)加終濃度為30 μg/m L的卡那霉素。37 ℃培養(yǎng)至DCW達(dá)到9 g/L （OD600=15） 時(shí)，補(bǔ)加不同濃度的甘氨酸。繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)，直到DCW達(dá)到誘導(dǎo)所需的濃度時(shí)，降低溫度到30 ℃，并采用0.1 g/（L·h）的乳糖誘導(dǎo)。整個(gè)發(fā)酵過程中，通過儀器自動(dòng)補(bǔ)加氨水維持pH 7.0；同時(shí)，通過調(diào)節(jié)攪拌槳轉(zhuǎn)速 （200-900 r/min） 和空氣的流速 （1.5-4.0 L/min）控制DO在30%。

1.2.4生物量測(cè)定

細(xì)胞生長(zhǎng)通過測(cè)定發(fā)酵液在 OD600的吸光度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。DCW的測(cè)定：5 m L發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/m in離心15 m in。離心沉淀用去離子水清洗后，10 000 r/m in再次離心10 m in，離心沉淀在105 ℃條件下烘干至恒重。

1.2.5發(fā)酵液及細(xì)胞中蔗糖異構(gòu)酶的分布及SDS-PAGE電泳

發(fā)酵液經(jīng)過離心處理，獲得發(fā)酵上清和沉淀，發(fā)酵上清的酶活稱為胞外酶活。含有細(xì)胞的離心沉淀回收后，用50 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸 （pH 6.0） 清洗后懸浮，并用緩沖液稀釋至 OD600=5.0。吸取 1 m L懸浮液 （OD600=5.0）放置冰上預(yù)冷20 m in，超聲破碎處理。離心處理獲得胞內(nèi)上清和沉淀，胞內(nèi)上清的酶活稱為胞內(nèi)酶活；沉淀即為胞內(nèi)不溶物。

將上述處理獲得的發(fā)酵上清、胞內(nèi)上清取出20 μL，并加入5 μL的加樣緩沖液；胞內(nèi)不溶物加入20 μL的加樣緩沖液，煮沸處理。上述兩種上清處理樣品各加8 μL，胞內(nèi)不溶物處理樣品加2 μL，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE） 處理，并采用考馬斯亮藍(lán)R-250染料染色，獲得蛋白質(zhì)圖譜。

1.2.6酶活測(cè)定

發(fā)酵樣品采用50 mmol/L的Na2HPO4-檸檬酸 （pH 6.0） 適當(dāng)稀釋后，取100 μL稀釋后的樣品加入到900 μL含有蔗糖的上述緩沖液中，蔗糖終濃度為 200 g/L。迅速混勻后，30 ℃反應(yīng)15 m in，沸水煮沸使其失活。利用HPLC檢測(cè)，采用Syncronis Am ino Column （Thermo） 柱子，流動(dòng)相為 78%的乙腈，經(jīng)示差檢測(cè)后，根據(jù)樣品峰面積，計(jì)算異麥芽酮糖的含量。

酶活單位定義：上述條件下，每分鐘釋放1 μmol異麥芽酮糖所需要的酶量，定義一個(gè)酶活力單位。

2　結(jié)果與討論

2.1帶有天然信號(hào)肽的蔗糖異構(gòu)酶基因在大腸桿菌中重組表達(dá)

將P. dispersa UQ68J來源的帶有天然信號(hào)肽的蔗糖異構(gòu)酶原始基因，在保證氨基酸不變的前提下，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的基因與原始基因同源性為81.6%，共替換283個(gè)密碼子，其中包括58個(gè)在大腸桿菌中使用頻率低于10‰的稀有密碼子。

將優(yōu)化后的蔗糖異構(gòu)酶基因與無信號(hào)肽的表達(dá)載體pET-24a （+） 連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli BL21 （DE3） 獲得ORI菌株。采用不添加IPTG或IPTG終濃度為0.1 mmol/L兩種方式進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果顯示不添加IPTG時(shí)蔗糖異構(gòu)酶的總酶活和胞外酶活分別達(dá)到 85 U/m L 和65 U/m L （圖1）；添加0.1 mmol/L的IPTG時(shí)，蔗糖異構(gòu)酶總酶活和胞外酶活分別降到10 U/m L和4 U/m L。將胞內(nèi)不溶物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，無論是否添加IPTG，細(xì)胞內(nèi)均形成大量包涵體，這可能是由于蔗糖異構(gòu)酶表達(dá)量過大，在胞內(nèi)不能及時(shí)折疊從而形成錯(cuò)誤構(gòu)象。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇不添加IPTG。

本實(shí)驗(yàn)中，攜帶自身信號(hào)肽的蔗糖異構(gòu)酶基因在大腸桿菌中表達(dá)的總酶活達(dá)到85 U/m L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的不含信號(hào)肽的蔗糖異構(gòu)酶基因表達(dá)的總酶活 （大約20 U/m L）［14］。其中，蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活達(dá)到65 U/m L，占總酶活的76.5%，說明信號(hào)肽對(duì)總酶活的提高起到關(guān)鍵性作用，并可將重組酶成功分泌至胞外。這可能是由于蔗糖異構(gòu)酶攜帶信號(hào)肽后，信號(hào)肽能引導(dǎo)蔗糖異構(gòu)酶快速通過細(xì)胞內(nèi)膜進(jìn)入周質(zhì)空間。由于天然蔗糖異構(gòu)酶是一種胞外酶，周質(zhì)環(huán)境可能更利于其正確折疊，最終使蔗糖異構(gòu)酶的胞外酶活和總酶活升高。

然而，ORI菌株在不添加IPTG時(shí)仍然形成大量包涵體，這可能是因?yàn)閬碓从赑. dispersa的蔗糖異構(gòu)酶信號(hào)肽不是大腸桿菌常用信號(hào)肽，當(dāng)目的蛋白大量表達(dá)時(shí)，無法高效引導(dǎo)目的蛋白分泌到細(xì)胞外。因此，嘗試使用大腸桿菌常用信號(hào)肽，來研究不同信號(hào)肽對(duì)蔗糖異構(gòu)酶總酶活的影響。

2.2不同信號(hào)肽對(duì)蔗糖異構(gòu)酶總酶活的影響

在大腸桿菌中，OmpA、PelB信號(hào)肽經(jīng)常用于重組蛋白的胞外表達(dá)。其中，OmpA信號(hào)肽成功實(shí)現(xiàn)了 α-CGTase［21］、exoglucanase［22］和TEM-в-lactanase［23］等重組蛋白的胞外表達(dá)；PelB 信號(hào)肽對(duì)角質(zhì)酶［24］、Pectate lyase［25］和Protein A-PhoA fusion protein［26］等重組蛋白具有良好的分泌效果。因此，本實(shí)驗(yàn)分別研究了OmpA、PelB信號(hào)肽對(duì)蔗糖異構(gòu)酶總酶活的影響。

更換信號(hào)肽涉及到蔗糖異構(gòu)酶成熟蛋白的起始位點(diǎn)，文獻(xiàn)中Wu預(yù)測(cè)認(rèn)為該蔗糖異構(gòu)酶的成熟蛋白起點(diǎn)為34位點(diǎn)［14］。本研究采用不同的軟件重新預(yù)測(cè)成熟蛋白起點(diǎn)，其中 SignalP 4.1 Server和predisi預(yù)測(cè)認(rèn)為22位點(diǎn)為成熟蛋白起點(diǎn)；SPEPLip和TatP 1.0 Server預(yù)測(cè)認(rèn)為34位點(diǎn)為成熟蛋白起點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，信號(hào)肽切點(diǎn)需滿足-3，-1原則——即-1、-3位點(diǎn)的氨基酸（信號(hào)肽切點(diǎn)前第1和第3個(gè)氨基酸） 必須含有一個(gè)小的中性側(cè)鏈，而且信號(hào)肽的-1位點(diǎn)通常是A la，有利于被信號(hào)肽酶識(shí)別切割［27］。觀察蔗糖異構(gòu)酶的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，21、33位點(diǎn)的氨基酸都是A la；19和31位點(diǎn)氨基酸分別為Tyr、Pro，都是含有小的中性側(cè)鏈的氨基酸，符合-1、-3原則。由于兩個(gè)預(yù)測(cè)位點(diǎn)都具有信號(hào)肽切點(diǎn)的特征，因此本實(shí)驗(yàn)將外源信號(hào)肽分別與以22、34位點(diǎn)為起始位點(diǎn)的氨基酸序列連接。

將以22、34位點(diǎn)為起始位點(diǎn)的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的基因與分別攜帶OmpA、PelB信號(hào)肽的pET-24a（+） 表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E. coli BL21 （DE3），獲得不同的重組菌株O22、O34、P22、P34菌株，不添加IPTG培養(yǎng)24 h。其結(jié)果如圖1所示。

ORI、O22、O34、P22、P34菌株表達(dá)蔗糖異構(gòu)酶的總酶活分別達(dá)到85、88、53、138和92 U/m L。其中，OmpA、PelB信號(hào)肽與 22位點(diǎn)連接獲得O22、P22菌株表達(dá)的蔗糖異構(gòu)酶總酶活，均明顯高于O34、P34菌株的總酶活。說明22位點(diǎn)氨基酸更可能是蔗糖異構(gòu)酶成熟蛋白的起始位點(diǎn)。

圖1　不同菌株在無IPTG條件下培養(yǎng)24 h的發(fā)酵結(jié)果Fig. 1 The fermentation results of strains w ithout IPTG after 24 h of culture. DCW （A）， total sucrose isomerase activity （B） and extracellular sucrose isomerase activity （C）.

進(jìn)一步分析信號(hào)肽對(duì)蔗糖異構(gòu)酶總酶活的影響。與PelB信號(hào)肽連接獲得P22菌株的總酶活最高達(dá)138 U/m L，是ORI和O22菌株總酶活的1.6倍。SDS-PAGE顯示，P22菌株幾乎不形成包涵體。P34、O22和O34菌株仍然形成大量的包涵體 （圖2）。綜上說明，采用PelB信號(hào)肽并與22位點(diǎn)氨基酸連接，能明顯提高蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌表達(dá)的總酶活。

2.3發(fā)酵條件對(duì)蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活和總酶活的影響

2.3.1不同濃度乳糖對(duì)蔗糖異構(gòu)酶的影響

上述研究表明，P22菌株其蔗糖異構(gòu)酶總酶活最高，可作為進(jìn)一步發(fā)酵優(yōu)化研究的菌株。為在發(fā)酵罐中對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，首先在搖瓶中考察了不同濃度的乳糖誘導(dǎo)對(duì)蔗糖異構(gòu)酶的影響。

圖 2 各菌株發(fā)酵上清、胞內(nèi)上清及胞內(nèi)不溶物的SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE analysis of fermentation supernatant， intracellular supernatant and intracellular insoluble protein. （A） Fermentation supernatant. （B）Intracellular supernatant. （C） Intracellular insoluble protein. 1: ORI strain； 2: P22 strain； 3: P34 strain； 4: O22 strain； 5: O34 strain； 6: marker.

實(shí)驗(yàn)中，添加一定量乳糖誘導(dǎo) （濃度低于4.0 g/L） 時(shí)，蔗糖異構(gòu)酶總酶活比不添加誘導(dǎo)劑的總酶活明顯提高。其中添加終濃度3.0 g/L的乳糖誘導(dǎo)，蔗糖異構(gòu)酶總酶活最高，達(dá)到168 U/m L，比不添加乳糖提高約21.7% （圖3）。但其胞外酶活較低，僅為蔗糖異構(gòu)酶總酶活的35.7%。因此，如何促進(jìn)蔗糖異構(gòu)酶分泌到發(fā)酵液中，對(duì)蔗糖異構(gòu)酶的生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。

2.3.2甘氨酸濃度對(duì)蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活和總酶活的影響

甘氨酸，是一種空間結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的氨基酸。當(dāng)細(xì)胞壁上的氨基酸被甘氨酸替代，會(huì)引起細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)松散。這有利于合成蛋白分泌到發(fā)酵液中，但也降低了細(xì)胞壁對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響，進(jìn)而可能影響酶產(chǎn)量［28-29］。因此，尋找適宜的甘氨酸濃度，對(duì)提高蔗糖異構(gòu)酶的胞外酶活具有重要意義。

圖3　P22菌株在不同濃度乳糖誘導(dǎo)下培養(yǎng)24 h的發(fā)酵結(jié)果Fig. 3 The fermentation results of P22 strain w ith different concentration of lactose after 24 h of culture. DCW （A）， total sucrose isomerase activity （B） and extracellular sucrose isomerase activity （C）.

圖4　甘氨酸濃度對(duì)蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活、總酶活和生物量 (DCW) 的影響Fig.4 The effect of different glycine concentrations on extracellular sucrose isomerase activity （A）， total sucrose isomerase activity （B） and biomass （C）.

在3 L罐中，補(bǔ)加不同濃度的甘氨酸 （0%、0.5%和1%） 時(shí)，蔗糖異構(gòu)酶的分泌效率隨甘氨酸濃度的增加而不斷提升，胞外酶活和總酶活分別達(dá)到586、1 148、566 U/m L和2 339、3 029、1 032 U/m L （圖4）。其中，補(bǔ)加甘氨酸濃度為0.5%時(shí)，蔗糖異構(gòu)酶的總酶活和胞外酶活最高，分別是不補(bǔ)加甘氨酸的2.0和1.3倍；同時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)也未受到影響，DCW達(dá)到83.5 g/L。當(dāng)補(bǔ)加甘氨酸濃度為1.0%時(shí)，蔗糖異構(gòu)酶的分泌效率最高 （54.8%）；但細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯影響，DCW為62.2 g/L，是不補(bǔ)加甘氨酸時(shí)DCW的77.1%。因此，補(bǔ)加0.5%甘氨酸最適。

2.3.3誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活和總酶活的影響

補(bǔ)加甘氨酸能促進(jìn)蔗糖異構(gòu)酶的分泌，但仍有大量的蔗糖異構(gòu)酶未能分泌到發(fā)酵液中，需要采用其他策略進(jìn)一步提高分泌效率。文獻(xiàn)報(bào)道，重組蛋白的表達(dá)會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生代謝壓力，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速率、生物量及蛋白表達(dá)量降低［28］。為減輕這種不利影響，采用不同的誘導(dǎo)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)重組酶的分泌效率不同。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間提前，分泌效率逐漸提高，但對(duì)細(xì)胞的傷害愈加明顯［28-29］。因此，研究了不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蔗糖異構(gòu)酶分泌效率的影響，以獲得最佳誘導(dǎo)時(shí)間，來提高蔗糖異構(gòu)酶的胞外酶活。

圖5　誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活、總酶活和生物量 (DCW) 的影響Fig. 5 The effect of different induction time on extracellular sucrose isomerase activity （A）， total sucrose isomerase activity （B） and biomass （C）.

實(shí)驗(yàn)中，分別采用DCW為30 g/L、18 g/L 及9 g/L （OD600=50、30及15） 時(shí)開始誘導(dǎo)，蔗糖異構(gòu)酶的分泌效率隨誘導(dǎo)時(shí)間提前分泌效率不斷提升，胞外酶活和總酶活分別達(dá)到1 148、1 981、1 501 U/m L和3 029、2 654、1 742 U/m L（圖5）。當(dāng)DCW為30 g/L （OD600=50） 時(shí)開始誘導(dǎo)，蔗糖異構(gòu)酶總酶活和生物量最高，但其胞外酶活僅占總酶活的37.9%。將誘導(dǎo)時(shí)間提前至DCW為18 g/L （OD600=30） 時(shí)，蔗糖異構(gòu)酶的分泌效率達(dá)到74.6%，胞外酶活達(dá)到最高 （1981 U/m L），是DCW為30 g/L （OD600=50） 開始誘導(dǎo)胞外酶活的1.7倍。當(dāng)DCW為9 g/L （OD600=15）誘導(dǎo)，蔗糖異構(gòu)酶分泌效率最高 （86.2%），但其細(xì)胞生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，DCW最低只有44.0 g/L，僅為DCW 為 30 g/L （OD600=50） 開始誘導(dǎo)生物量的52.7%。綜合比較，當(dāng)DCW為18 g/L （OD600=30）時(shí)，蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活最高。

通過實(shí)驗(yàn)確定了最優(yōu)發(fā)酵條件為：補(bǔ)加0.5%甘氨酸，DCW為18 g/L （OD600=30） 時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)。該條件下，蔗糖異構(gòu)酶胞外酶活最高，達(dá)到1 981 U/m L，是不補(bǔ)加甘氨酸時(shí)胞外酶活（586 U/m L） 的2.4倍，也是目前蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中表達(dá)的最高胞外酶活。

3　結(jié)論

本文研究了不同信號(hào)肽及發(fā)酵條件，對(duì)P. dispersa蔗糖異構(gòu)酶在大腸桿菌中重組表達(dá)的影響。采用攜帶天然信號(hào)肽及基因優(yōu)化策略，蔗糖異構(gòu)酶的總酶活明顯升高。更換PelB信號(hào)肽并與22位點(diǎn)的氨基酸連接，使蔗糖異構(gòu)酶的總酶活進(jìn)一步提升。3 L發(fā)酵罐中，采用最適的甘氨酸濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，蔗糖異構(gòu)酶分泌效率得到大幅提高，胞外酶活最高達(dá)1 981 U/m L，總酶活達(dá)到2 640 U/m L，該研究為其他蔗糖異構(gòu)酶的高效生產(chǎn)提供參考。

REFERENCES

［1］ Low NH， Sporns P. Analysis and quantitation of m inor di-and trisaccharides in honey using capillary gas chromatography. J Food Sci， 1988，53（2）: 558-561.

［2］ Hamada S. Role of sweeteners in the etiology and prevention of dental caries. Pure Appl Chem，2002， 74（7）: 1293-1300.

［3］ Lina BA， Jonker D， Kozianow ski G. Isomaltulose （Palatinose）: a review of biological and toxicological studies. Food Chem Toxicol， 2002，40（10）: 1375-1381.

［4］ Godshall MA. How carbohydrates influence food flavors. Food Technol， 1997， 51: 63-66.

［5］ Tang WZ， Chen F， Li XZ. Advances in isomaltulose production catalyzed by sucrose isomerase. M icrobiol China， 2012， 39（9）: 1314-1322 （in Chinese）.

唐文竹， 陳放， 李憲臻. 蔗糖異構(gòu)酶催化生產(chǎn)異麥芽酮糖研究進(jìn)展. 微生物學(xué)通報(bào)， 2012， 39（9）: 1314-1322.

［6］ Ravaud S， Watzlaw ick H， Haser R， et al. Overexpression， purification， crystallization and prelim inary diffraction studies of the Protaminobacter rubrum sucrose isomerase SmuA. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun， 2006， 62（1）: 74-76.

［7］ Cheetham PS. The extraction and mechanism of a novel isomaltulose-synthesizing enzyme from Erwinia rhapontici. Biochem J， 1984， 220（1）: 213-220.

［8］ Ren B， Li S， Xu H， et al. Purification and characterization of a highly selective sucrose isomerase from Erwinia rhapontici NX-5. Bioprocess Biosyst Eng， 2011， 34（5）: 629-637.

［9］ Kawaguti HY， Sato HH. Characterization of a glucosyltransferase from Erwinia sp. D12 and the conversion of sucrose into isomaltulose by immobilized cells. Biochem Eng J， 48: 211-217.

［10］ Aroonnual A， Nihira T， Seki T， et al. Role of several key residues in the catalytic activity of sucrose isomerase from Klebsiella pneumoniae NK33-98-8. Enzyme M icrob Technol， 2007，40（5）: 1221-1227.

［11］ Lee HC， Kim JH， Kim SY， et al. Isomaltose production by modification of the fructose-binding site on the basis of the predicted structure of sucrose isomerase from “Protaminobacter rubrum”. Appl Environ M icrobiol， 2008， 74（16）: 5183-5194.

［12］ Zhang D， Li X， Zhang LH. Isomaltulose synthase from Klebsiella sp. strain LX 3: gene cloning and characterization and engineering of thermostability. Appl Environ M icrobiol， 2002，68（6）: 2676-2682.

［13］ Véronèse T， Perlot P. M echanism of sucrose conversion by the sucrose isomerase of Serratia plymuthica ATCC 15928. Enzyme M icrob Technol， 1999， 24: 263-269.

［14］ W u L， Birch RG. Characterization of the highly efficient sucrose isomerase from Pantoea dispersa UQ68J and cloning of the sucrose isomerase gene. Appl Environ M icrobiol， 2005， 71: 1581-1590.

［15］ Mu WM， Li WJ， Wang X， et al. Current studies on sucrose isomerase and biological isomaltulose production using sucrose isomerase. Appl M icrobiol Biotechnol， 2014， 98: 6569-6582.

［16］ Bornke F， Hajirezaei M， Sonnewald U. Cloning and characterization of the gene cluster for palatinose metabolism from the phytopathogenic bacterium Erwinia rhapontici. J Bacteriol， 2001，183: 2425-2530.

［17］ Cha J， Jung JH， Park SE， et al. Molecular cloning and functional characterization of a sucrose isomerase （isomaltulose synthase） gene from Enterobacter sp. FMB-1. J Appl M icrobiol， 2009，107（4）: 1119-1130.

［18］ Cheng S， Duan XG， W u J. Fermentation optim ization of recombinant sucrose isomerase and its application. Food Ferment Ind， 2015， 5: 41-47 （in Chinese）.

程勝， 段緒果， 吳敬. 重組蔗糖異構(gòu)酶的制備及應(yīng)用條件優(yōu)化. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2015， 5: 41-47.

［19］ Lee GY， Jung JH， Seo DH， et al. Isomaltulose production via yeast surface display of sucrose isomerase from Enterobacter sp. FMB-1 on Saccharomyces cerevisiae. Bioresour Technol，2011， 102（19）: 9179-9184.

［20］ Park JY， Jung JH， Seo DH， et al. M icrobial production of palatinose through extracellular expression of a sucrose isomerase from Enterobacter sp. FMB-1 in Lactococcus lactis MG1363. Bioresour Technol， 2010， 101（22）: 8828-8833.

［21］ Li B， Wu J， Chen J. The effects of signal peptide on extracellular expression of CGTase from Paenibacillus macerans in E. coli. Ind M icrobiol，2011， 41（3）: 54-59 （in Chinese）.

李彬， 吳敬， 陳堅(jiān). 信號(hào)肽對(duì)浸麻類芽孢桿菌α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中胞外表達(dá)的影響. 工業(yè)微生物， 2011， 41（3）: 54-59.

［22］ Lam TL， W ong RS， Wong WK. Enhancement of extracellular production of a Cellulomonas fimi exoglucanase in Escherichia coli by the reduction of promoter strength. Enzyme M icrob Technol，1997， 20: 482-488.

［23］ Wan EW， Baneyx F. TolAIII co-expression facilitates the recovery of periplasm ic recombinant proteins into the grow th medium of Escherichia coli. Protein Expr Purif， 1998， 14（1）: 13-22.

［24］ Chen S， Li B， Hong， RY. The number of signal peptide cleavage site is critical for extracellular production of recombinant Thermobifida fusca cutinase. Process Biochem， 2011， 46（9）: 1867-1870.

［25］ Matsumoto T， Katsura D， Kondo A， et al. Efficient secretory overexpression of Bacillus subtilis pectate lyase in Escherichia coli and single-step purification. Biochem Eng J， 2002， 12（3）: 175-179.

［26］ Chowdhury PS， Kushwaha A， Abrol S， et al. An expression system for secretion and purification of a genetically engineered thermostable chimera of protein A and alkaline phosphatase. Protein Expr Purif， 1994， 5: 89-95.

［27］ Choi JH， Lee SY. Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli. Appl M icrobiol Biotechnol，2004， 64: 625-635.

［28］ Cheng J， Wu D， Chen S. High-level extracellular production of alpha-cyclodextrin glycosyltransferase w ith recombinant Escherichia coli BL21 （DE3）. J Agric Food Chem， 2011，59（8）: 3797-3802.

［29］ Zou C， Duan XG， W u J. Enhanced extracellular production of recombinant Bacillus deramificans pullulanase in Escherichia coli through induction mode optim ization and a glycine feeding strategy. Bioresour Technol， 2014， 172: 174-179.

（本文責(zé)編 陳宏宇）

November 17， 2015； Accepted: January 19， 2016

Sheng Chen. Tel/Fax: +86-510-85326653； E-mail: chensheng@jiangnan.edu.cn

Expression and production optim ization of sucrose isomerase from Pantoea dispersa in Escherichia coli

Juntong Liu1,2, Jing Wu1,2, and Sheng Chen1,2

1 State Key Laboratory of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， Jiangsu， China
2 Key Laboratory of Industrial Biotechnology， Ministry of Education， School of Biotechnology， Jiangnan University， Wuxi 214122，Jiangsu， China

To improve the yield of sucrose isomerase from Pantoea dispersa UQ68J， we studied the effect of different signal peptides and fermentation conditions on sucrose isomerase expression in Escherichia coli. The gene of sucrose isomerase was optim ized and expressed in E. coli BL21 （DE3） w ith native signal peptide which was named as ORI strain. The total and extracellular enzyme activity was 85 and 65 U/m L in the flask， respectively. The mature protein， which started from the 22th am ino acid， was connected w ith the PelB and OmpA signal peptide to construct P22 and O22 strain，respectively. The total activity of P22 reached 138 U/m L， which was 1.6 times of ORI strain. The total activity of O22 strain was sim ilar to that of ORI strain. Induced by 3.0 g/L lactose， the total activity of P22 strain increased to 168 U/m L. In 3 L fermentor， the effects of glycine concentration and induction time were studied. Induction when the DCW reached 18 g/L （OD600=30）， w ith 0.5% glycine， the extracellular enzyme activity reached 1 981 U/m L， and the total enzyme activity reached 2 640 U/m L， which is the highest activity of sucrose isomerase that was expressed in recombinant E. coli.

sucrose isomerase， signal peptides， fermentation optim ization

Supported by: National Science Fund for Distinguished Young Scholars （No. 31425020）， The Project of Outstanding Scientific and Technological Innovation Group of Jiangsu Province （Jing Wu， 111 Project） （No. 111-2-06）， Natural Science Foundation of Jiangsu Province （No. BK20140132）， The Fundamental Research Funds for the Central Universities （No. JUSRP51304A）.

國家杰出青年基金 （No. 31425020），江蘇高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 （吳敬，111計(jì)劃） （No. 111-2-06），江蘇省自然科學(xué)基金 （No. BK20140132），中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金 （No. JUSRP51304A） 資助。