孫健　王曉波　張旗　慕俐君

EZH2在急性髓系白血病病程中的表達(dá)和對(duì)預(yù)后判斷的意義研究

孫健王曉波張旗慕俐君

目的：探討DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT1）與EZH2在急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）中的表達(dá)及其相關(guān)性。方法：采用熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）檢測(cè)大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2014年1月至2015年1月50例初治AML患者骨髓細(xì)胞中DNMT1與EZH2 mRNA的表達(dá)水平，分析DNMT1表達(dá)水平與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系以及與EZH2的相關(guān)性。結(jié)果：50例AML患者骨髓細(xì)胞中DNMT1 mRNA的表達(dá)顯著高于30例正常供者（2.72±0.73 vs.0.89± 0.27，P＜0.01）；EZH2的表達(dá)水平也顯著高于正常供者（4.39±1.06 vs.1.87±0.33，P＜0.01）；EZH2與DNMT1的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（r=0.51，P=0.002）；DNMT1表達(dá)水平與外周血幼稚細(xì)胞比例≥60%（P＜0.05）、WBC≥50×109/L（P＜0.05）呈顯著相關(guān)；DNMT1高表達(dá)組患者中位生存時(shí)間15個(gè)月（95%CI為9～19個(gè)月），顯著低于DNMT1低表達(dá)組患者的32個(gè)月（95%CI為27～40個(gè)月，P= 0.006）。結(jié)論：DNMT1和EZH2在AML患者中均高表達(dá)，兩者表達(dá)水平呈正相關(guān)，DNMT1與AML患者預(yù)后不良相關(guān)。

DNMT1EZH2 急性髓系白血病相關(guān)性

表觀遺傳學(xué)變異在白血病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2是特異性H3K27甲基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT1）合作，致使靶基因CpG島區(qū)DNA甲基化導(dǎo)致靶基因的永久性沉默，從而參與異染色質(zhì)的形成及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控［1］。有研究表明，EZH2在多種惡性實(shí)體腫瘤組織中表達(dá)異常增高，并且具有癌基因的活性［2］。EZH2在高危骨髓增生異常綜合征患者及急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）患者中的表達(dá)水平顯著高于低危骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）患者及正常人群［3-4］，提示EZH2在髓系惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但是，DNMT1的表達(dá)在AML中有何臨床意義？EZH2在AML中的表達(dá)與DNMT1有無(wú)相關(guān)性？目前國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道尚少。本研究就DNMT1和EZH2在AML中的表達(dá)及其相關(guān)性，以及與AML臨床特征、預(yù)后的關(guān)系作初步探討，為急性白血病的治療提供新的思路。

1　材料與方法

1.1病例資料

回顧性分析2014年1月至2015年1月大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院50例初治AML患者，所有患者均經(jīng)骨髓形態(tài)細(xì)胞學(xué)檢查、免疫組織化學(xué)染色或流式細(xì)胞術(shù)免疫分型確診。按照FAB白血病診斷分型標(biāo)準(zhǔn)，其中M1 8例、M2 13例、M4 12例、M5 17例。男性33例，女性17例；中位年齡42.5（12～62）歲；中位WBC為38.9（1.9～359.7）×109/L；外周血原幼稚細(xì)胞比例中位數(shù)為61（5～87）%；骨髓幼稚細(xì)胞比例＜60%為22例，骨髓幼稚細(xì)胞比例≥60%為28例；按SWOG標(biāo)準(zhǔn)將50例患者根據(jù)染色體核型分析結(jié)果分為3組，良好14例、中危30例、高危6例。對(duì)照組為30例正常供者。所有標(biāo)本的采集均經(jīng)過(guò)被研究對(duì)象或其家屬知情同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離常規(guī)骨髓穿刺，抽取患者骨髓液3～5 mL，肝素抗凝，采用淋巴細(xì)胞分離液分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗滌2遍后加1 mL Trizol反復(fù)吹打至無(wú)沉淀，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2總RNA提取按Trizol說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作抽提總RNA。DEPC水溶解后采用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，A260/A280＞1.8方可用于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照TAKARA公司的Prime-Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將1 μg總RNA，1 μL Oligo（dT）18，1 μL dNTPmix充分混勻后，置65℃作用5 min后迅速冰上冷卻，再加入4 μL 5×PrimeScript緩沖液，1 μL Ribonuclease Inhibitor，最后加入1 μL Enzyme Mix逆轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）至終體積為20 μL，42℃作用1 h，70℃作用10 min后冰上冷卻，獲得的cDNA第1鏈立即行PCR或-80℃冰箱保存待用。

1.2.4熒光定量PCR應(yīng)用SYBR Green熒光定量PCR （fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。EZH2上游引物為5'-GACCCTGACCTCTGTCTT ACTT-3'，下游引物為5'-GATGGTGCCAGGCAATAGA TG-3'。DNMT1上游引物為5'-AACCTTCACCT AGCCCCAG-3'，下游引物為5'-CTCATCCGATTTGGCT CTTCA-3'。內(nèi)參GAPDH上游引物為5'-TGAAGGTC GGAGTCAACGG-3'，下游引物為5'-CTGGAAGATGGT GATGGGATT-3'。PCR擴(kuò)增條件：95℃30 s，95℃5 s，60℃40 s，40個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用相對(duì)定量法，以2-ΔCt表示標(biāo)本中目的基因的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=（CtEZH2/CtDNMT1-Ctβ-actin）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1DNMT1在AML患者中的表達(dá)

FQ-PCR結(jié)果顯示，50例AML患者骨髓細(xì)胞中DNMT1 mRNA的表達(dá)值為2.72±0.73，顯著高于30例正常供者0.89±0.27（P＜0.01）；DNMT1在AML患者中的表達(dá)陽(yáng)性率為85.9%，顯著高于正常供者中的表達(dá)陽(yáng)性率32.6%（P＜0.01）。

2.2EZH2在AML中的表達(dá)及其與DNMT1的相關(guān)性

EZH2在50例AML患者骨髓細(xì)胞中的表達(dá)水平為4.39±1.06，顯著高于30例正常供者的1.87±0.33 （P＜0.01）；EZH2在AML患者中的表達(dá)陽(yáng)性率為87.3%，顯著高于正常供者中的表達(dá)陽(yáng)性率29.5%（P＜0.01）。相關(guān)性分析顯示，EZH2 mRNA在AML患者骨髓細(xì)胞中的表達(dá)水平與DNMT1 mRNA的表達(dá)水平均呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（r=0.51，P=0.002，圖1）。

圖1　DNMT1表達(dá)水平與EZH2表達(dá)水平呈正相關(guān)Figure 1　Positive correlation between DNMT1 and EZH2 expression levels

2.3DNMT1表達(dá)水平與臨床特征之間的關(guān)系

AML患者骨髓細(xì)胞中DNMT1 mRNA表達(dá)水平與外周血幼稚細(xì)胞比例≥60%（P＜0.05）、WBC≥50× 109/L（P＜0.05）顯著相關(guān)，而與性別、年齡、骨髓中幼稚細(xì)胞比例、LDH水平以及染色體核型相關(guān)預(yù)后均不相關(guān)（表1）。

2.4DNMT1和EZH2的表達(dá)水平與AML的病程相關(guān)性

治療前及復(fù)發(fā)AML患者骨髓細(xì)胞中DNMT1和EZH2 mRNA表達(dá)水平顯著高于正常供者；治療后緩解的AML患者骨髓細(xì)胞中DNMT1和EZH2 mRNA表達(dá)水平與治療前相比顯著降低（P＜0.05，表2）。

2.5DNMT1和EZH2表達(dá)水平與AML患者預(yù)后的關(guān)系

所有病例中位隨訪時(shí)間為16（3～43）個(gè)月，38%（19/50）患者死亡。以DNMT1 mRNA表達(dá)水平中位值2-ΔCt=2.16作為截?cái)嘀?，將DNMT1在AML中的表達(dá)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。應(yīng)用Kaplan-Meier法生存分析表明，DNMT1高表達(dá)組患者中位生存時(shí)間15個(gè)月（95%CI為9～19個(gè)月），顯著低于DNMT1低表達(dá)組患者的32個(gè)月（95%CI為27～40個(gè)月），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006）。EZH2高表達(dá)組患者中位生存時(shí)間17個(gè)月（95%CI為11～21個(gè)月），顯著低于EZH2低表達(dá)組患者的36個(gè)月（95%CI為26～42個(gè)月），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003，圖2）。

表1　DNMT1表達(dá)水平與AML患者臨床特征之間的關(guān)系Table 1　Relationship of the expression level of DNMT1 with the clinical characteristics of patients with AML

表2　DNMT1和EZH2的表達(dá)水平與AML的病程相關(guān)性Table 2　Correlation of DNMT1 and EZH2 expression levels with AML course

圖2　DNMT1和EZH2表達(dá)水平與AML患者預(yù)后的關(guān)系Figure 2　Relationship of the expression levels of DNMT1 and EZH2 with the prognosis of patients with AML

3　討論

AML是發(fā)生于造血干/祖細(xì)胞的惡性增殖性疾病。表觀遺傳學(xué)變異在白血病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［5-6］。近幾年來(lái)，染色體甲基化異常逐漸成為AML研究的熱點(diǎn)，AML中存在一組基因的高度甲基化，導(dǎo)致這些基因表達(dá)的沉默或抑制，從而促進(jìn)正常造血干細(xì)胞向白血病細(xì)胞的轉(zhuǎn)化［7-8］。EZH2基因是果蠅ZESTE基因增強(qiáng)子的人類(lèi)同源物，其編碼蛋白含有高度保守的SET結(jié)構(gòu)域，可甲基化組蛋白H3K27，通過(guò)調(diào)節(jié)染色體組蛋白的甲基化狀態(tài)而沉默分化基因［9-10］。

EZH2導(dǎo)致靶基因高度失活的機(jī)制為：1）通過(guò)與DNMT1合作，致使靶基因CpG島區(qū)DNA甲基化導(dǎo)致靶基因的永久性沉默；另一種是先通過(guò)PRC2催化H3K27me3，甲基化的H3K27再作為錨定點(diǎn)結(jié)合HPC，再招募PRC1的其他蛋白結(jié)合至靶基因的polycomb反應(yīng)元件來(lái)共同完成的［2］。DNMT1是介導(dǎo)DNA甲基化的主要元件，其對(duì)沉默靶基因的甲基化作用中受到EZH2作為上游因子的調(diào)控作用［11-13］。本研究前期研究表明EZH2在AML中高表達(dá)，且與臨床高白細(xì)胞和血清LDH水平升高顯著相關(guān)，同時(shí)EZH2高表達(dá)患者預(yù)后較低表達(dá)患者差［4］。然而DNMT1在AML中的表達(dá)及其與EZH2的表達(dá)有無(wú)相關(guān)性目前尚不清楚。

本研究應(yīng)用FQ-PCR法檢測(cè)50例AML患者DNMT1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)DNMT1在AML患者的骨髓細(xì)胞中顯著高表達(dá)，而且其表達(dá)水平與其上游調(diào)控基因EZH2呈正相關(guān)。Purkait等［14］研究發(fā)現(xiàn)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者DNMT1與EZH2 mRNA具有強(qiáng)的陽(yáng)性相關(guān)性，DNMT1與EZH2低表達(dá)患者的生存期明顯高于DNMT1與EZH2高表達(dá)患者。Ning等［15］研究發(fā)現(xiàn)DNMT1與EZH2的甲基化通過(guò)抑制miRNA-200b/a/429，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，EZH2在DNMT1招募啟動(dòng)子序列的過(guò)程中起到必要作用。上述研究結(jié)果提示DNMT1與EZH2相互作用，調(diào)控抑癌基因的啟動(dòng)子甲基化，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄失活，從而導(dǎo)致白血病惡性克隆的形成。然而DNMT1如何與EZH2相互作用，其機(jī)制還有待深入研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)DNMT1 mRNA表達(dá)水平與外周血幼稚細(xì)胞比例、WBC計(jì)數(shù)呈顯著正相關(guān)，提示DNMT1能夠促使白血病細(xì)胞從骨髓釋放到外周血，遷移至髓外形成浸潤(rùn)病灶。而且DNMT1高表達(dá)的患者預(yù)后較低表達(dá)患者差，表明DNMT1可能是AML患者預(yù)后的判斷指標(biāo)。

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（2016-05-03收稿）

（2016-07-05修回）

孫健專(zhuān)業(yè)方向?yàn)楣撬杷ソ呒膊〖霸煅杉?xì)胞移植。

E-mail：sunjian_1973@aliyun.com

Research progress and prognostic significance of EZH2 in acute myeloid leukemia

Jian SUN，Xiaobo WANG，Qi ZHANG，Lijun MU

Correspondence to:Lijun MU；E-mail:jxw10144613@126.com

Department of Hematology，The Second Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116027，China

Objective:To investigate the relationship between DNA methyltransferase（DNMT1）and EZH2 gene expression levels and their clinical significance in patients with acute myeloid leukemia（AML）.Methods:The mRNA expression levels of DNMT1 and EZH2 in 50 AML cases and 30 healthy controls were quantified through real-time PCR.The relationship among DNA methyltransferase（DNMT1）and EZH2，clinicopathological factors，and prognosis was analyzed.Results:The mRNA expression of DNMT1 in the AML cases（2.72± 0.73）was significantly higher than that in the healthy controls（0.89±0.27）（P＜0.01）.The mRNA expression of EZH2 in the AML cases （4.39±1.06）was also significantly higher than that in the healthy controls（1.87±0.33）（P＜0.01）.The expression of DNMT1 was positively associated with that of EZH2（r=0.51，P=0.002）.The expression of DNMT1 was also associated with PB%and WBC≥50×109/L（P＜0.05）.The overall survival of the group with a high-mRNA-expressing DNMT1 was 15 months（95%CI=9-19 months）.This period was significantly shorter than that of the group with low-mRNA-expressing DNMT1（32 months，95%CI=27-40 months；P=0.006）.Conclusion:DNMT1 and EZH2 expression levels were downregulated.These levels were associated with poor AML prognosis.The expression of DNMT1 was also positively associated with that of EZH2.

DNMT1，EZH2，AML，correlation

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.16.518

大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液內(nèi)科（遼寧省大連市116027）

慕俐君jxw10144613@126.com