曹新芳，黃卉卉，任秋楠，陳婷婷，王靜，張盛周

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省重要生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蕪湖 241000)

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）別稱魚鰍、泥鰍魚，隸屬鯉形目鰍科泥鰍屬，常棲息于湖泊、池塘、水田的淤泥表層或緩流水中，繁殖速度快，適應(yīng)性強(qiáng)，是一種雜食性小型魚類，主要攝食水生昆蟲、甲殼類、幼螺等底棲無脊椎動(dòng)物和各種藻類、植物碎片等[1,2]。泥鰍肉質(zhì)鮮美，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和補(bǔ)氣養(yǎng)腎等藥用價(jià)值，其蛋白降解產(chǎn)物還具有抗氧化作用，深受人們的喜愛，有“水中之參”的美稱[2,3]。

近年來，隨著泥鰍的市場需求量不斷增加，人們對泥鰍的人工養(yǎng)殖技術(shù)及其相關(guān)基礎(chǔ)理論的研究也在不斷深入開展。劉孝華等[2]對泥鰍的生物學(xué)特性和人工養(yǎng)殖方法進(jìn)行了描述和研究；胡廷尖等[4]通過組織學(xué)切片和顯微觀察研究了泥鰍消化道的形態(tài)特征和組織結(jié)構(gòu)；陳蘇維等[5]采用生物化學(xué)方法檢測了泥鰍消化道不同部位淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的活力。然而，泥鰍消化道黏膜中與消化吸收相關(guān)的重要酶，如過氧化物酶（POX）、三磷酸腺苷酶（ATPase）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、堿性磷酸酶（ALP）、酸性磷酸酶（ACP）和非特異性酯酶（NSE）等的活力尚未見研究報(bào)道。本文采用酶組織化學(xué)染色對泥鰍消化道黏膜中該6種重要酶的分布及組織定位進(jìn)行研究，旨在增進(jìn)對泥鰍消化生理功能的認(rèn)識，為其人工養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)資料。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

鮮活人工養(yǎng)殖泥鰍9條，長15.4～18.6cm，重45.8～49.1g，購自蕪湖市黃山西路菜市場，置于清水中暫養(yǎng)2h。用鈍器敲打其頭部致暈，快速解剖取出完整消化道，在泥鰍消化道的食道、胃賁門、胃體、胃幽門、前腸、中腸、后腸等7個(gè)部位進(jìn)行精確分離取樣，樣品于0.01mol/L磷酸緩沖液（PBS）中漂洗干凈后，OCT包埋，進(jìn)行冷凍切片，厚度為8μm，置于-20 ℃冰箱中備用。

2 酶組織化學(xué)染色

6種酶的組織化學(xué)染色方法及酶反應(yīng)的底物見表1，藥品試劑的配制及實(shí)驗(yàn)操作步驟參考謝毓玲等[6]的方法進(jìn)行。

表1 6種酶的組織化學(xué)染色方法和主要底物Tab.1 Histochemical staining techniques and main substrates of the 6 enzymes

3 光密度測定與數(shù)據(jù)分析

使用Olympus BX61型顯微鏡觀察酶的組織化學(xué)染色結(jié)果并拍照。利用Image-Pro Plus圖像分析軟件，對酶組織化學(xué)染色的陽性部位進(jìn)行光密度分析，測出面積（Area）和累積光密度值（IOD），并計(jì)算出平均光密度（MOD）值表示酶活力大小。在SPSS軟件中，采用單因素方差分析（One-way ANOVN）法，分別對6種酶在消化道不同部位的活力進(jìn)行兩兩比較，得出不同酶在泥鰍消化道不同部位分布的差異顯著性，P＜0.05為差異顯著。

結(jié) 果

在光鏡下，經(jīng)組織化學(xué)染色后，泥鰍消化道黏膜6種酶均呈現(xiàn)出明顯的染色反應(yīng)。對組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行光密度測定和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出6種酶在泥鰍消化道不同部位的活力分布（表2)。

表2 泥鰍消化道黏膜6種重要酶的分布Tab. 2 Distribution of the 6 essential enzymes in the digestive mucosa of Misgurnus anguillicaudatus

過氧化物酶：POX組織化學(xué)染色陽性部位呈棕褐色，顆粒狀分布。POX在食道中酶活性最高，在消化道的其余部位酶活性顯著較低(表2）。POX在食道中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞中（圖A1）；在胃賁門、胃體和胃幽門中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞基部；在腸道中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞基部，固有層也有少量零星分布（圖A2）。

三磷酸腺苷酶：ATPase組織化學(xué)染色陽性部位呈棕黑色。ATPase在胃賁門、胃體、胃幽門、前腸、中腸和后腸中酶活性較高，在食道中酶活性顯著較低（表2）。ATPase在食道中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部；在胃賁門、胃體和胃幽門中集中分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部（圖B1）；在前腸、中腸和后腸中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞的紋狀緣，上皮細(xì)胞的基部亦可見少量分布（圖B2）。

琥珀酸脫氫酶：SDH組織化學(xué)染色陽性部位呈藍(lán)紫色。SDH在胃賁門、胃體、胃幽門、前腸、中腸和后腸中酶活性較高，在食道中酶活性顯著降低（表2）。SDH在食道中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部；在胃賁門、胃體和胃幽門中主要分于胃小凹黏膜上皮細(xì)胞頂部，上皮細(xì)胞基部亦有少量分布（圖C1）；在前腸、中腸和后腸中集中分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部，部分上皮細(xì)胞基部亦有少量分布（圖C2）。

堿性磷酸酶：ALP組織化學(xué)染色陽性部位呈深藍(lán)色。ALP在胃賁門、胃體、胃幽門、前腸、中腸和后腸中酶活性較高，在食道中酶活性顯著較低（表2）。ALP在食道中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部；在胃賁門、胃體和胃幽門中集中分布于黏膜上皮細(xì)胞的頂部（圖D1）；在前腸、中腸和后腸中集中分布于黏膜上皮細(xì)胞的紋狀緣（圖D2）。

酸性磷酸酶：ACP組織化學(xué)染色陽性部位呈棕黃色。ACP在食道、胃賁門、胃體、前腸、中腸和后腸中酶活性較高，在胃幽門中酶活性顯著較低（表2）。ACP在食道中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞中；在胃賁門、胃體和胃幽門中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞中，固有層中亦有少量分布（圖E1）；在前腸、中腸和后腸中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部，固有層亦有少量分布（圖E2）。

非特異性酯酶：NSE組織化學(xué)染色陽性部位呈磚紅色。NSE在食道、胃賁門、胃幽門、前腸、中腸中酶活性較高，在胃體和后腸中酶活性顯著降低（表2）。NSE在食道中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞的頂部和基部；在胃賁門、胃體和胃幽門中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部和基底部，固有層亦有少量分布（圖F1）；在前腸、中腸和后腸中主要分布于黏膜上皮細(xì)胞的紋狀緣，上皮細(xì)胞基部和固有層中亦有少量分布（圖F2）。

圖1 泥鰍消化道黏膜6種酶的組織化學(xué)定位。A，POX在食道（A1）和后腸（A2）的分布；B，ATPase在胃體（B1）和后腸（B2）的分布；C，SDH在胃體（C1）和中腸（C2）的分布；D，ALP在胃體（D1）和前腸（D2）的分布；E，ACP在胃幽門（E1）和中腸（E2）的分布；F，NSE在胃幽門（F1）和后腸（F2）的分布；SB，紋狀緣；ME，黏膜上皮；LP，固有層；GP，胃小凹；比例尺，50μmFig. 1 Histochemical localization of 6 enzymes in digestive tract mucosa of Misgurnus anguillicaudatus. A, distribution of POX in the esophagus (A1)and hindgut (A2); B, distribution of ATPase in the stomach corpus (B1) and hindgut (B2); C, distribution of SDH in the stomach corpus (C1) and midgut (C2); D, distribution of ALP in the stomach corpus (D1) and foregut (D2); E, distribution of ACP in the stomach pylorus (E1) and midgut (E2); F,distribution of NSE in the stomach pylorus (F1) and hindgut (F2); SB, striated border; ME, mucosal epithelia; LP, lamina propria; GP, gastric pit; scale bar, 50μm

討 論

泥鰍的消化道由食道、胃、前腸、中腸和后腸組成。泥鰍的胃不十分明顯，由腸管膨大形成，呈直管狀，無彎曲，屬“I”型胃[4]。本研究顯示，泥鰍胃沒有明顯的胃腺，POX、ATPase、SDH和ALP的酶活性在胃和腸道之間沒有顯著差異性，進(jìn)一步表明，泥鰍的胃分化程度較低，其黏膜的組織結(jié)構(gòu)和酶組成與腸黏膜有較高的相似性。

POX是廣泛存在于微生物、動(dòng)植物體內(nèi)的一種氧化還原酶，具有消除細(xì)胞內(nèi)有毒代謝產(chǎn)物如過氧化氫、醛類、酚類、胺類等物質(zhì)的作用[7,8]。本研究顯示，POX主要分布于泥鰍消化道的食道，在胃和腸道中分布較少。與烏鱧（Ophiocephalus argus）[6]消化道中POX主要分布于胃賁門和胃體，食道中分布較少，存在明顯差異；與鱖魚（Siniperca chuatsi）[9]消化道中POX在腸道中分布較少相似，但鱖魚胃幽門中POX分布最多，食道中分布較少。泥鰍食道中較高的POX酶活性有利于清除食道中因頻繁吞咽活動(dòng)產(chǎn)生的較多有毒代謝廢物。POX發(fā)揮催化作用釋放的氧自由基還具有殺滅病原微生物的作用[10]，因此，POX在泥鰍食道中分布較多還有利于防止外來病原微生物侵入機(jī)體，可能是機(jī)體的一種保護(hù)機(jī)制。

ATPase是普遍存在于細(xì)胞膜和線粒體、溶酶體等細(xì)胞器膜上的一類水解酶，能夠水解ATP并釋放能量，參與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和胞內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。本研究顯示，ATPase主要分布于泥鰍消化道的胃賁門、胃體、胃幽門、前腸、中腸和后腸，在食道中酶活性顯著較低。與烏鱧[6]消化道中ATPase的分布明顯不同，主要分布于烏鱧胃體，其次為胃幽門和胃賁門，在腸道中分布相對較少；鱖魚[9]消化道中ATPase主要分布于食道、胃賁門、胃體、胃幽門、前腸和后腸，在中腸分布最少,與 泥鰍消化道ATPase的分布亦存在差異。烏鱧和鱖魚胃中ATPase活性較高主要是由于其胃腺發(fā)達(dá)， ATPase集中分布于胃腺，黏膜上皮細(xì)胞中分布較少，主要為胃蛋白酶和胃酸的分泌提供能量；泥鰍胃黏膜無明顯的胃腺，ATPase集中分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部，與腸道中ATPase主要分布于上皮細(xì)胞的紋狀緣相似，表明泥鰍的胃上皮細(xì)胞可能具有較強(qiáng)的吸收功能，泥鰍的胃和腸道均是營養(yǎng)物質(zhì)的吸收部位。

SDH廣泛存在于線粒體內(nèi)膜，是線粒體的一種標(biāo)志酶，參與并催化三羧酸循環(huán)中琥珀酸還原為延胡索酸，酶活性可用于判斷三羧酸循環(huán)的強(qiáng)度[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，SDH在泥鰍的胃和腸道各段均分布較多，在食道中分布最少。與烏鱧[6]和鱖魚[9]消化道中SDH主要分布于胃賁門和胃體，在腸道分布較少存在顯著差異，但與兩者食道中SDH分布最少相似。烏鱧和鱖魚胃腺發(fā)達(dá)，SDH集中分布于胃腺，為胃腺的分泌活動(dòng)提供足夠的能量。泥鰍沒有明顯的胃腺，胃中SDH集中分布于黏膜上皮細(xì)胞頂部，與腸道中SDH的分布相一致，可為胃和腸道上皮細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)提供充足的ATP能量。

ALP主要存在于細(xì)胞膜中，參與營養(yǎng)物質(zhì)如脂質(zhì)、糖類、鈣和無機(jī)磷酸鹽的吸收，可根據(jù)其分布來判斷魚類消化道中營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要部位[13,14]。本研究顯示，ALP在泥鰍的胃和腸道各部位活性均較高，在食道中酶活性顯著較低。與烏鱧[6]消化道中ALP主要分布于前腸和中腸，胃賁門、胃體和胃幽門分布較少不同；與許氏平鲉（Sebastes schlegelii）[15]消化道中ALP主要分布于中腸，前腸和后腸分布相對較少，食道、胃賁門和胃幽門未檢測到酶活性存在顯著差異；與半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）[8]消化道中ALP主要分布于前腸，其次為后腸，胃中分布最少亦明顯不同。泥鰍消化道中ALP主要定位于胃黏膜上皮細(xì)胞頂部和腸上皮細(xì)胞的紋狀緣，進(jìn)一步表明泥鰍的胃和腸道都是營養(yǎng)物質(zhì)的吸收部位。

ACP是存在于溶酶體的一種標(biāo)志酶，主要參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的消化和吸收。通過胞飲作用直接吸收蛋白顆粒然后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)消化被認(rèn)為是硬骨魚中蛋白質(zhì)消化的另一種途徑[16]。本研究顯示，ACP在泥鰍的食道、胃賁門、胃體、前腸、中腸和后腸中酶活性較高，胃幽門中酶活性顯著較低。與褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）[17]消化道中ACP主要分布于中腸，其次為食道、胃體、前腸和后腸，在胃賁門和胃幽門分布最少相似；與許氏平鲉[15]消化道中ACP在后腸和中腸中分布較多，前腸和胃賁門中相對較少，食道和胃幽門中分布最少存在不同之處；與烏鱧[6]消化道中ACP在中腸和后腸分布最高，其次為胃幽門和前腸，在胃賁門、胃體和食道分布最少則明顯不同。由此可見，ACP在魚類消化道各段的分布具有一定的物種特異性。泥鰍消化道ACP的分布表明其胃賁門、胃體和前腸具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)吸收和細(xì)胞內(nèi)消化功能。

NSE參與包括魚類在內(nèi)的大多數(shù)脊椎動(dòng)物中脂肪酸甘油酯的水解，與脂質(zhì)的消化和吸收有關(guān)。由于魚類的能源物質(zhì)主要是脂質(zhì)而不是碳水化合物和蛋白質(zhì)，因此，NSE對魚類獲取能源物質(zhì)尤為重要[13,18]。本研究顯示，NSE在泥鰍的食道、胃賁門、胃幽門、前腸、中腸中活性均較高，在胃體和后腸中分布較少。與項(xiàng)帶重牙鯛（Diplodus vulgaris）[19]消化道中NSE主要分布于前腸和中腸，在后腸分布最少相似；但與褐菖鲉[17]消化道中NSE在胃幽門中分布最高，其次為胃賁門、胃體，在食道和腸道中分布最少存在顯著差異；與紅娘魚（Lepidotrigla Cavillone）[20]消化道中NSE在后腸分布最多，其次為前腸，在幽門盲囊和中腸分布最少亦明顯不同。泥鰍消化道中NSE分布較為廣泛，食道、胃賁門、胃幽門和前腸中檢測到較高的酶活性，表明泥鰍消化道的前段就有較強(qiáng)的脂質(zhì)消化功能，這與魚類以脂質(zhì)為主要能源物質(zhì)相適應(yīng)。

綜上所述，泥鰍消化道黏膜6種酶的分布同其他魚類相比，顯示出明顯的物種特異性，主要表現(xiàn)為泥鰍胃分化程度低，酶的分布和定位與腸道較為相似。本研究表明，泥鰍的胃和腸都有較強(qiáng)的吸收功能；胃賁門、胃體和前腸具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)吸收和細(xì)胞內(nèi)消化功能；胃賁門、胃幽門、前腸和中腸具有較強(qiáng)的脂質(zhì)消化能力。