徐友強(qiáng)，孫寶國，蔣玥鳳，侯 潔，許春艷，王文華，滕 超，熊 科，范光森，李秀婷,

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048；3.北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京工商大學(xué)，北京 100048）

紅曲黃酒是我國的代表性黃酒之一，其成品色紅、味醇、香濃，獨(dú)具特色[1]。紅曲黃酒釀造以大米為原料，大米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在70%以上，淀粉的水解，即液化和糖化，是黃酒釀造原料的主要轉(zhuǎn)化過程之一，并為微生物生長提供碳源[2]。淀粉水解速度對(duì)于釀造體系微生物的生長及代謝具有顯著影響，如果液化和糖化速度過慢，則微生物因缺乏碳源而生長代謝緩慢；如果液化和糖化速度過快，會(huì)造成發(fā)酵醪中糖濃度過高，進(jìn)而抑制微生物的代謝[3]。因此，淀粉水解對(duì)于黃酒的釀造過程和產(chǎn)品品質(zhì)影響極大，而決定釀造體系淀粉水解的內(nèi)在主要源動(dòng)力，即為微生物來源的淀粉酶[4]。

表1 紅曲黃酒來源的主要微生物Table1 Major microorganisms originated from Hongqu glutinous rice wine

傳統(tǒng)紅曲黃酒釀造過程有多種微生物共同參與[5]。微生物可以產(chǎn)生淀粉酶，以降解原料大米中的淀粉，是釀造過程原料中淀粉轉(zhuǎn)化的內(nèi)在原動(dòng)力[4]。已有研究通過現(xiàn)代微生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)，對(duì)紅曲黃酒釀造過程真菌和細(xì)菌區(qū)系變化規(guī)律進(jìn)行分析，并從酒藥和釀造過程樣品中分離大量霉菌、酵母菌和細(xì)菌資源（表1）[6-13]。研究表明，傳統(tǒng)紅曲黃酒釀造過程是霉菌、酵母菌和細(xì)菌共同參與的結(jié)果[6-13]，并且多種微生物具有產(chǎn)生淀粉酶的能力[14-19]。紅曲黃酒釀造真菌來源的淀粉酶主要為α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶[18-19]，主要作用于淀粉的內(nèi)部不規(guī)則切開直鏈淀粉的α-1,4-糖苷鍵，但不水解支鏈淀粉的α-1,6-糖苷鍵，也不水解靠近α-1,6-糖苷鍵的α-1,4-糖苷鍵，而大米淀粉中支鏈淀粉的含量在75%以上，因而酶解產(chǎn)物主要是麥芽糖、少量葡萄糖以及一系列分子質(zhì)量不等的低聚糖和糊精[18]。這兩種酶均難以越過支鏈淀粉分子中的α-1,6-糖苷鍵分支點(diǎn)，導(dǎo)致紅曲黃酒釀造周期相對(duì)較長，原料利用率普遍較低[20]。

與真菌所產(chǎn)淀粉酶種類不同，細(xì)菌除產(chǎn)生α-淀粉酶外，還可以產(chǎn)生β-淀粉酶和普魯蘭酶等[21]。其中，普魯蘭酶可以作用于支鏈淀粉的α-1,6-糖苷鍵，即可以特異性水解普魯蘭多糖，有助于淀粉的充分水解。基于作用底物和產(chǎn)物的差異，目前普魯蘭酶主要分為I型普魯蘭酶、II型普魯蘭酶、I型普魯蘭糖水解酶、II型普魯蘭糖水解酶和III型普魯蘭糖水解酶[22]。I型普魯蘭酶（EC 3.2.1.41）作用于支鏈低聚糖的α-1,6-糖苷鍵，產(chǎn)物為麥芽三糖；II型普魯蘭酶（EC 3.2.1.41）可作用于α-1,4-和α-1,6-糖苷鍵，水解產(chǎn)物包括葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖；I型普魯蘭糖水解酶（EC 3.2.1.135），又名Neopullulanase，主要在非還原端水解α-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)物是潘糖；II型普魯蘭糖水解酶（EC 3.2.1.57），又名Isopullulanase，主要作用于α-1,4-糖苷鍵，水解產(chǎn)物為異葡糖基麥芽糖；III型普魯蘭糖水解酶（EC 3.2.1.-）可作用于α-1,4-和α-1,6-糖苷鍵，水解產(chǎn)物為潘糖、麥芽糖和麥芽三糖?；谶@類酶的特性，細(xì)菌來源普魯蘭酶在黃酒釀造的淀粉水解過程中應(yīng)具有重要的作用。但是到目前為止，紅曲黃酒微生物淀粉酶的研究仍局限于真菌，特別是霉菌高產(chǎn)淀粉酶菌株的選育及應(yīng)用[14-16]，該過程細(xì)菌產(chǎn)普魯蘭酶的相關(guān)研究鮮見報(bào)道，不利于全面認(rèn)知紅曲黃酒釀造的淀粉水解過程，制約了釀造機(jī)制的深入解析，進(jìn)而導(dǎo)致紅曲黃酒釀造效率較低，并且不同批次產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定性差。前期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌中的芽孢桿菌屬菌株存在于紅曲黃酒整個(gè)釀造過程中，是紅曲黃酒釀造的典型代表性微生物[5,23-24]，且具有表達(dá)普魯蘭酶的能力[10]?；谏鲜鲅芯楷F(xiàn)狀，在前期從紅曲黃酒釀造酒曲中分離具有淀粉水解能力的芽孢桿菌基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)對(duì)芽孢桿菌所攜帶普魯蘭酶的基本性質(zhì)進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析，以為后續(xù)的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芽孢桿菌BHQ03、BHQ04和BHQ06由前期工作分離獲得，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成，基因測(cè)序委托華大基因完成。克隆載體pEASY-T1、Trans Taq-T DNA聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司；Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；BIOMIGA Gel/PCR Extraction Kit 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、胰蛋白胨10 g/L，pH 7.0，LB固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外透射反射分析儀 上?？等A生化儀器制造廠；Microfuge 20R高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；T100TM基因熱循環(huán)儀 美國Bio-Rad公司；DYY-III-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種鑒定

在前期工作中，研究通過芽孢桿菌培養(yǎng)基對(duì)紅曲黃酒酒曲中的芽孢桿菌進(jìn)行分離和純化，繼而利用淀粉平板對(duì)篩選的芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，依據(jù)平板水解圈的大小對(duì)菌株的淀粉水解性能進(jìn)行評(píng)估，獲得3 株具有顯著淀粉水解性能的芽孢桿菌，編號(hào)BHQ03、BHQ04和BHQ06，分別接種培養(yǎng)12 h，離心收集菌體，按照細(xì)菌基因組DNA試劑盒操作步驟提取基因組DNA。利用細(xì)菌16S rRNA基因克隆引物27f和1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得芽孢桿菌的16S rRNA基因[25]，擴(kuò)增條件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、90 s，循環(huán)30 次；72 ℃、10 min，4 ℃恒溫。

1.3.2 普魯蘭酶基因克隆與測(cè)序

根據(jù)菌種鑒定結(jié)果，NCBI檢索近源芽孢桿菌基因組信息，依據(jù)注釋普魯蘭酶基因序列，設(shè)計(jì)簡并引物（表2），進(jìn)行普魯蘭酶基因的擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、2.5 min，循環(huán)30 次；72 ℃、10 min，4 ℃恒溫。

表2 菌種鑒定和普魯蘭酶基因擴(kuò)增引物Table2 Primers used for strain identification and amplification of the pullulanase genes

擴(kuò)增所得DNA條帶，通過BIOMIGA膠回收試劑盒進(jìn)行DNA條帶純化，然后按照pEASY-T1載體說明書要求進(jìn)行普魯蘭酶基因的連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白斑篩選挑取陽性克隆子，送至華大基因進(jìn)行普魯蘭酶基因序列測(cè)定。

1.3.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

菌種鑒定系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：將測(cè)序所得16S rRNA基因序列提交EzbioCloud細(xì)菌專業(yè)分類鑒定在線網(wǎng)站（https：//www.ezbiocloud.net/taxonomy），將序列相似性大于等于97%的序列下載到本地，按照系統(tǒng)發(fā)育分析軟件MEGA 5.0要求制作序列比對(duì)文件，通過Neighbour-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap values為1 000。

蛋白質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：選取代表性的不同普魯蘭酶亞家族蛋白序列，參照菌種鑒定系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建步驟構(gòu)建蛋白質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 普魯蘭酶序列和基本性質(zhì)分析

序列拼接及比對(duì)選用DNAMAN 7.0軟件完成、信號(hào)肽的預(yù)測(cè)通過SignalP 4.1網(wǎng)站進(jìn)行（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、理化性質(zhì)分析采用ExPASy-ProtParam tool完成（http：//web.expasy.org/protparam/）。

1.3.5 普魯蘭酶親/疏水性及跨膜區(qū)分析

蛋白親水/疏水性分析提交預(yù)測(cè)軟件ExPASy-ProtScale完成（http：//web.expasy.org/protscale/），利用在線軟件TMHMM 2.0進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）。

1.3.6 普魯蘭酶二級(jí)、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和催化機(jī)制分析

蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)利用軟件SOPMA Secondary Structure Prediction Method（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）進(jìn)行分析。蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）完成。分子對(duì)接通過DISCOVERY STUDIO 2.5軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定

16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析表明，3 株菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上與B. wiedmannii、B. thuringiensis、B. toyonensis、B. pseudomycoiders和B. cereus聚于同一分支，表明親緣關(guān)系較近（圖1），BHQ03與B. cereus、B. wiedmannii、B. thuringiensis、B. toyonensis和B. pseudomycoides的同源性分別為100.00%、99.82%、99.45%、99.45%和99.45%；BHQ04與B. wiedmannii、B. cereus、B. thuringiensis、B. toyonensis和B. pseudomycoides的同源性分別為100.00%、99.83%、99.66%、99.66%和99.31%；BHQ06與B. wiedmannii、B. cereus、B. thuringiensis、B. toyonensis和B. pseudomycoides的同源性分別為100.00%、99.85%、99.55%、99.55%和99.41%。進(jìn)一步序列分析發(fā)現(xiàn)與BHQ03相比，BHQ04與BHQ06親緣關(guān)系更近。因此，后續(xù)以BHQ03和BHQ06為研究對(duì)象，選取16S rRNA基因序列相似性最高的B. wiedmannii、B. toyonensis、B. thuringiensis和B. cereus共4 株菌基因組注釋普魯蘭酶基因序列設(shè)計(jì)引物。由于B. cereus基因組注釋普魯蘭酶基因序列與其余3 株菌差異較大，為降低引物的簡并性，以B. cereus基因組注釋普魯蘭酶基因序列單獨(dú)設(shè)計(jì)引物，然而PCR擴(kuò)增并未獲得預(yù)期目標(biāo)基因。以B. wiedmannii、B. toyonensis和B. thuringiensis基因組注釋普魯蘭酶基因序列設(shè)計(jì)引物，其中，Pullulanase.f1/Pullulanase.r1的參考基因序列NCBI登錄號(hào)：AT260_RS18700、BTOYO_RS09760和CAB88_RS24225；Pullulanase.f2/Pullulanase.r2的參考基因序列NCBI登錄號(hào)：AT260_RS06110、BTOYO_RS00120和CAB88_RS13920。

圖1 芽孢桿菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of Bacillus strains based on 16S rRNA gene sequences

2.2 普魯蘭酶基因克隆和序列解析

上述分離的2 株Bacillus sp.均攜帶2 個(gè)普魯蘭酶基因，且同一菌株來源的2 個(gè)基因在序列上差別較大，比如菌株BHQ03的2 個(gè)普魯蘭酶基因pulL1和pulL2序列相似度僅有19.72%，但是2 株菌對(duì)應(yīng)的普魯蘭酶基因序列相似度較高，測(cè)序和比對(duì)結(jié)果表明，pulL1和pulL3的長度均為2 142 bp，共有79 個(gè)堿基存在差異，序列相似度達(dá)96.31%，pulL2和pulL4的長度均為2 559 bp，僅有6 個(gè)堿基存在差別，序列相似度達(dá)99.77%。從基因進(jìn)化角度講，pulL2和pulL4較pulL1和pulL3在進(jìn)化上更加保守。將上述4 個(gè)普魯蘭酶編碼基因提交到NCBI，登錄號(hào)分別為：pulL1（MG971224）、pulL2（MG971225）、pulL3（MG971226）和pulL4（MG971227）。

圖2 普魯蘭酶基因克隆和序列測(cè)定結(jié)果Fig.2 Cloning and sequencing of the pullulanase genes

2.3 普魯蘭酶基本性質(zhì)和序列比對(duì)分析

表3 普魯蘭酶基本性質(zhì)分析Table3 Analysis of the basic characteristics of the pullulanases

對(duì)普魯蘭酶的基本性質(zhì)包括氨基酸殘基數(shù)量、分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、帶負(fù)電荷氨基酸、帶正電荷氨基酸、分子式、原子總數(shù)、消光系數(shù)和不穩(wěn)定指數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。上述基本酶學(xué)性質(zhì)的分析，有助于后續(xù)蛋白質(zhì)的分離純化和性質(zhì)研究。其中，4 個(gè)酶的不穩(wěn)定指數(shù)均小于40，說明蛋白本身在結(jié)構(gòu)上是穩(wěn)定的[26]。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白穩(wěn)定性的決定因素之一在于其序列中的二肽[26]，PulL1、PulL2、PulL3和PulL4之間的氨基酸組成存在差異（表3），導(dǎo)致其序列中的二肽存在不同，是不同普魯蘭酶不穩(wěn)定指數(shù)差異的主要原因。在基因序列測(cè)定和酶基本性質(zhì)的信息解析基礎(chǔ)上，研究進(jìn)一步對(duì)酶的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育和比對(duì)分析。

圖3 普魯蘭酶系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the pullulanases

選取代表性普魯蘭酶進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)PulL1、PulL2、PulL3和PulL4均屬于I型普魯蘭酶（圖3），隸屬于GH13家族。PulL1和PulL3與B. thuringiensis來源的I型普魯蘭酶進(jìn)化關(guān)系最近，序列相似性分別為99.58%、96.35%，而PulL2和PulL4與B. bombysepticus來源I型普魯蘭酶進(jìn)化關(guān)系最近，序列相似性分別為99.41%、99.77%。I型普魯蘭酶（EC 3.2.1.41）又被稱為真普魯蘭酶、脫支酶，僅作用于α-1,6-糖苷鍵，特異性水解普魯蘭多糖及相關(guān)分支多糖，水解產(chǎn)物為麥芽三糖[22]。I型普魯蘭酶不具有水解α-1,4-糖苷鍵的能力，底物專一性好，在直鏈淀粉的生產(chǎn)中具有很好的應(yīng)用。另外，在實(shí)際應(yīng)用中往往將其與其他類型的淀粉水解酶搭配使用，以有效降解淀粉為小分子單糖或多糖[22]。

普魯蘭酶氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，PulL1和PulL3存在25 個(gè)氨基酸的差別，序列相似度為96.49%；PulL2和PulL4僅有3 個(gè)氨基酸的差別，序列相似度為99.65%（圖4）。序列比對(duì)表明，本研究的4 個(gè)普魯蘭酶具有I型普魯蘭酶的4 個(gè)特征性高度保守區(qū)域，雖然PulL2和PulL4的序列相似度非常高，但是在高度保守區(qū)域Region II的催化活性中心存在差別，PulL2的D（Asp）突變?yōu)镚（Gly），說明普魯蘭酶PulL2和PulL4的催化特性可能存在顯著差別（圖4）。研究表明淀粉酶的催化機(jī)制雖然相似，但是不同種類淀粉酶底物特異性和產(chǎn)物存在差異，推測(cè)原因在于，雖然不同種類淀粉酶的活性中心相同，但高度保守區(qū)域特別是活性中心位點(diǎn)附近的氨基酸殘基不同[21,27-28]。對(duì)于同種淀粉酶，由于序列，特別是活性中心附近氨基酸序列的差別，也會(huì)帶來酶的特性，包括最適溫度和pH值、催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)等的變化[21]。圖4的比對(duì)結(jié)果顯示，普魯蘭酶PulL1和PulL2的高度保守區(qū)催化活性中心附近的保守區(qū)域氨基酸殘基也存在差別，可能影響酶的催化性質(zhì)，有待后續(xù)研究。在上述4 個(gè)特征性高度保守區(qū)域之外，I型普魯蘭酶還具有1 個(gè)特征性的7氨基酸殘基特征區(qū)域“YNWGYDP”（圖4標(biāo)示289～295區(qū)域）。文獻(xiàn)研究表明該區(qū)域與酶的底物特異性密切相關(guān)，使酶特異的水解α-1,6-糖苷鍵[29]。PulL1和PulL3該特征區(qū)域存在單氨基酸殘基的突變（D294N），該突變可能對(duì)酶催化底物的特異性和催化效率產(chǎn)生影響。

圖4 普魯蘭酶氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Amino acid sequence alignment of the pullulanases

2.4 普魯蘭酶疏水性分析、信號(hào)肽和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

圖5 普魯蘭酶疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of the pullulanases

采用Hphob/Kyte & Doolittle算法計(jì)算PulL1和PulL2的疏水性（圖5）。PulL1疏水指數(shù)最小值為－3.411（78位），最大值為2.756（554位），總平均親水性指數(shù)（grand average of hydropathicity，GRAVY）為－0.412。PulL2疏水指數(shù)最小值為－2.822（336位），最大值為3.289（16位），GRAVY為－0.675。特定位點(diǎn)的氨基酸親水性指數(shù)越大，表明該位點(diǎn)的疏水性越高[30]。PulL1和PulL2雖然都是親水性蛋白，但是在氨基酸殘基親水性指數(shù)和蛋白的總平均親水性指數(shù)均存在差異，說明二者親水性存在差別，但總平均親水性指數(shù)均為負(fù)值，屬于親水性蛋白。氨基酸的疏水作用在很大程度上影響蛋白的穩(wěn)定性[31]，氨基酸疏水性分析對(duì)于通過定點(diǎn)突變或者區(qū)域替換提高蛋白的穩(wěn)定性具有重要指導(dǎo)作用。

圖6 普魯蘭酶信號(hào)肽和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of the signal peptide and transmembrane domain of the pullulanases

文獻(xiàn)報(bào)道，不同I型普魯蘭酶有分泌到胞外[32-33]、結(jié)合在細(xì)胞膜上[34]和存在于細(xì)胞內(nèi)[35]3 種形式。同一普魯蘭酶也可能形成不同的存在形式，例如，Bacillus sp. S-1來源堿性普魯蘭酶具有兩種存在形式，前體蛋白主要存在于胞內(nèi)；成熟蛋白可以結(jié)合在細(xì)胞膜上[36]。圖6表明，PulL2的N-端具有信號(hào)肽序列，可以引導(dǎo)其由胞內(nèi)分泌到胞外，而PulL1并不具有信號(hào)肽序列。研究一般認(rèn)為，沒有信號(hào)肽的蛋白不能轉(zhuǎn)運(yùn)，即翻譯完畢的蛋白會(huì)滯留在合成的區(qū)域。因此，生物信息學(xué)分析結(jié)果說明Bacillus sp.BHQ03來源的2 個(gè)普魯蘭酶分別具有分泌到胞外和存在于胞內(nèi)兩種存在形式。

2.5 普魯蘭酶二級(jí)、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和催化過程分析

圖7 普魯蘭酶PulL1（A）和PulL2（B）二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of the secondary structures of the pullulanases

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，PulL1的α-螺旋占蛋白質(zhì)的31.00%，伸展鏈占蛋白質(zhì)的24.82%，β-折疊占蛋白質(zhì)的11.64%，無規(guī)則卷曲占蛋白質(zhì)的32.54%（圖7A）；PulL2的α-螺旋占蛋白質(zhì)的30.75%，伸展鏈占蛋白質(zhì)的25.94%，β-折疊占蛋白質(zhì)的10.68%，無規(guī)則卷曲占蛋白質(zhì)的32.63%（圖7B）?？梢姡瑢?duì)于Bacillus sp. BHQ03來源普魯蘭酶，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是蛋白結(jié)構(gòu)的主要組成部分，伸展鏈和無規(guī)則卷曲分散其間。二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)對(duì)于蛋白的研究具有重要幫助，例如蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)分析得到的規(guī)則可用于全新蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)；當(dāng)序列同源性較低時(shí)，二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)有助于蛋白之間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系分析；在基于二級(jí)結(jié)構(gòu)片段堆積的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中首先需要正確的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；另外，二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)有助于多維核磁共振中二級(jí)結(jié)構(gòu)的確認(rèn)和晶體結(jié)構(gòu)的解析[37]。

圖8 普魯蘭酶三維結(jié)構(gòu)同源建模和催化機(jī)制分析Fig.8 Homology-based modeling of three dimensional structures and catalytic mechanism analysis of the pullulanases

與PulL1相比，PulL2的N-端（137～219）具有小的結(jié)構(gòu)域（圖8A和8B），文獻(xiàn)表明普魯蘭酶N-端區(qū)域的截短有助于酶在異源表達(dá)時(shí)的可溶性，提高表達(dá)效率[38]。原因可能是普魯蘭酶蛋白分子較大，截短后降低了蛋白錯(cuò)誤折疊的幾率。與N-端相比，PulL1的C-端（624～713）與PulL2的C-端（763～852）在結(jié)構(gòu)上差異較小。以PulL1為對(duì)象，對(duì)底物普魯蘭糖與酶進(jìn)行分子對(duì)接，確定底物與酶催化活性中心可能成鍵的氨基酸殘基（圖8C、D），解析催化活性中心與底物的作用機(jī)制。文獻(xiàn)研究表明，普魯蘭酶的活性中心一般是Asp-Glu-Asp催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，兩個(gè)Asp分別行使酶的親核基團(tuán)和穩(wěn)定過渡態(tài)中間物的作用，Glu參與酸堿催化[21,39]，催化過程共發(fā)生二次置換反應(yīng)（圖8E）。底物的糖殘基首先與酶的活性部位結(jié)合，該糖基氧原子被充當(dāng)質(zhì)子供體的氨基酸殘基Glu質(zhì)子化（圖8E II）；活性部位的氨基酸殘基Asp對(duì)糖殘基的C1碳原子進(jìn)行親核攻擊，與底物形成共價(jià)中間產(chǎn)物，同時(shí)斷裂底物糖苷之間的糖苷鍵，置換出底物的糖基配基部分（圖8E III）；糖基配基離去之后，水分子被氨基酸殘基Glu和另一氨基酸殘基Asp激活，將Asp的親核氧與糖殘基C1之間的共價(jià)鍵C1-O-Asp水解掉，置換出酶分子的Asp殘基，完成水解反應(yīng)（圖8E IV和V）。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)紅曲黃酒釀造酒曲分離的具有淀粉水解特性的芽孢桿菌進(jìn)行分子生物學(xué)初步鑒定和普魯蘭酶基因克隆與生物信息學(xué)分析。鑒定結(jié)果表明，分離的兩株芽孢桿菌BHQ03和BHQ06與B. thuringiensis、B. pseudomycoides、B. toyonensis、B. wiedmannii和B. cereus的親緣關(guān)系較近?；蚩寺『蜏y(cè)序發(fā)現(xiàn)，2 株菌各攜帶2 個(gè)不同序列的普魯蘭酶基因。進(jìn)一步序列分析顯示，BHQ03來源普魯蘭酶PulL1和PulL2均為I型普魯蘭酶，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，屬于親水性蛋白。PulL2存在信號(hào)肽，可以分泌到胞外。兩個(gè)普魯蘭酶均具有淀粉水解酶的典型高保守區(qū)域，且BHQ03來源的普魯蘭酶PulL2催化活性位點(diǎn)存在突變（D407G），表明該蛋白可能存在催化上的特殊性。基于已有研究和三維結(jié)構(gòu)模擬，分析了普魯蘭酶催化的具體作用過程。

上述研究首次報(bào)道紅曲黃酒釀造酒曲來源芽孢桿菌的普魯蘭酶序列和基本生物信息學(xué)特性。后續(xù)在基因克隆基礎(chǔ)上，擬開展蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離純化和性質(zhì)研究，以進(jìn)一步解析不同普魯蘭酶，特別是Bacillus sp. BHQ03來源PulL2的淀粉水解特性，為科學(xué)認(rèn)識(shí)紅曲黃酒釀造的淀粉水解過程提供依據(jù)。