紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造用曲的特征揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

呂旭聰 蔣雅君 胡榮康 ，3 郭偉靈 ，3 周文斌 ，3 李 燕 ，3饒平凡 陳勁星 倪 莉*

（1福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所 福建省食品生物技術(shù)創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心 福州 350108

2福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福州 350002

3福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心 福州 350002

4福建中檢華日食品安全檢測(cè)有限公司 福州 350008）

黃酒是我國(guó)釀造史上最悠久的酒種之一，享有“國(guó)酒”的美譽(yù)[1-2]，與啤酒、葡萄并稱世界三大古酒。紅曲黃酒是以糯米為主要原料，添加紅曲和藥白曲作為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)多種微生物釀造而成的一種低度黃酒，以色紅、味醇、香濃而著稱，不僅具有豐富營(yíng)養(yǎng)成分，還因添加了紅曲進(jìn)行發(fā)酵而具備多種與眾不同的生理功效，是中國(guó)黃酒中十分有特色的一類黃酒[3-6]。

紅曲黃酒香氣成分復(fù)雜，既有原料中固有的揮發(fā)性香氣，又有產(chǎn)生于發(fā)酵過(guò)程中的微生物代謝產(chǎn)物，還有陳釀階段形成的風(fēng)味物質(zhì)[7-9]。風(fēng)味是影響黃酒感官質(zhì)量的重要因素，其中揮發(fā)性香氣物質(zhì)又是黃酒風(fēng)味的重要構(gòu)成部分，決定著黃酒的風(fēng)味的典型性[10-11]。被稱為“酒之骨”的酒曲對(duì)黃酒的風(fēng)味影響尤為重要。我國(guó)古代就有許多關(guān)于“酒曲”的記載，如《禮記》中記有釀酒的注意事項(xiàng)“秫稉必齊，曲糵必時(shí)……”；《書經(jīng)-說(shuō)命篇》記載：“若作酒醴，爾唯曲蘗”；《天工開物》指出：“無(wú)曲，即佳米珍黍空造不成”，這些都說(shuō)明曲對(duì)釀酒的重要性。酒曲是黃酒釀造的動(dòng)力，具有糖化、發(fā)酵和生香三大功能，對(duì)于黃酒風(fēng)味物質(zhì)的形成起到至關(guān)重要的作用[9]。酒曲主要功用是給黃酒釀造提供多種需要的酶和微生物，而且在制曲過(guò)程中原料的分解產(chǎn)物和微生物的代謝產(chǎn)物直接或間接地構(gòu)成黃酒的風(fēng)味物質(zhì)，使黃酒具有獨(dú)特的風(fēng)味[9]。至今，對(duì)于紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造用曲（紅曲和藥白曲）中的微生物菌群研究報(bào)道較多[12-15]，而對(duì)于傳統(tǒng)釀造用曲中的揮發(fā)性風(fēng)味組成目前尚未見報(bào)道。

隨著頂空固相微萃取技術(shù)的出現(xiàn)，頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC/MS）技術(shù)已成為研究酒香氣成分的有效手段，被廣泛應(yīng)用于葡萄酒、白酒和黃酒等的揮發(fā)性香氣成分的萃取[16-18]。目前國(guó)內(nèi)雖有大量關(guān)于頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC/MS）技術(shù)用于黃酒香氣成分分析的報(bào)道[19-20]，但其應(yīng)用于紅曲黃酒釀造用曲成分的分析尚未見報(bào)道。本研究運(yùn)用頂空固相微萃?。℉S-SPME）與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）相結(jié)合的方法來(lái)分析紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造用曲（紅曲和藥白曲）中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分，并借助主成分分析找出重要的香氣物質(zhì)和特征香氣物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

古田紅曲、烏衣紅曲、龍巖藥曲及南平白曲，購(gòu)自當(dāng)?shù)丶t曲黃酒釀造酒廠；2-辛醇（內(nèi)標(biāo)）為色譜純化學(xué)標(biāo)樣，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；NaCl（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀7890A/5975MSD，美國(guó)Agilent公司；DB-5MS彈性石英毛細(xì)管管柱（30 m×0.25 mm），膜厚度 0.25 μm，美國(guó) Agilent公司；固相微萃?。⊿PME）裝置、75 μm 碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（CAR/PDMS）萃取頭、50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷 （DVB/CAR/PDMS） 萃取頭、100 μm 聚二甲基硅氧烷（PDMS）萃取頭、100 μm 聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB）萃取頭，美國(guó) SUPELCO 公司；15 mL頂空鉗口樣品瓶，上海安譜公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海精宏儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME提取酒曲中的揮發(fā)性組分 取樣前先將固相微萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口老化1 h，老化溫度250℃。取6 mL樣品迅速將其裝入20 mL的鉗口樣品瓶中，2.0 g NaCl，5μL 內(nèi)標(biāo)溶液（2-辛醇質(zhì)量濃度為1 mg/L）上部留有約2.5 cm左右的空間，用封蓋器封好。于40℃磁力攪拌器上加熱平衡10 min后，將老化好的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，40℃萃取40 min。

1.3.2 GC-MS分析 將萃取頭抽出插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，進(jìn)樣口溫度250℃解吸2 min，進(jìn)行GC-MS分析。氣相色譜-質(zhì)譜條件：載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；程序升溫：起始溫度40℃，以每分鐘5℃升溫到150℃，保持3 min，再以每分鐘5℃升溫到250℃。

質(zhì)譜條件：接口溫度：280℃；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；離子化方式為EI；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～450；ACQ方式：Scan。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 定性和定量分析：由GC-MS得到的譜圖，經(jīng)計(jì)算機(jī)在標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)NIST11和Wiley中比對(duì)檢索，并結(jié)合人工圖譜解析及保留指數(shù)資料的查詢，確認(rèn)香氣物質(zhì)的各個(gè)化學(xué)成分。HSSPME法萃取的缺陷之一是圖譜中會(huì)出現(xiàn)少量由萃取頭帶來(lái)的硅氧烷類雜質(zhì)峰，在對(duì)樣品分析時(shí)應(yīng)扣除這類雜質(zhì)峰，準(zhǔn)確鑒定4種酒曲中的揮發(fā)性成分，同時(shí)采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量，得到各組分的質(zhì)量濃度。

主成分分析：采用SIMCA14.1軟件，根據(jù)相關(guān)系數(shù)列出相關(guān)矩陣，求出特征根及其相應(yīng)的特征向量，從特征根中選出幾個(gè)較大的特征根及其特征向量，使其累積貢獻(xiàn)率在85%以上。根據(jù)種酒曲有關(guān)成分相對(duì)含量的標(biāo)準(zhǔn)化值及特征根、特征向量計(jì)算各主成分值，并以此作散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 頂空固相微萃取（HS-SPME）萃取頭的篩選

采用4種萃取頭，分別為75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（CAR/PDMS）萃取頭、50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS） 萃取頭、100 μm 聚二甲基硅氧烷（PDMS）萃取頭、100 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB）萃取頭，在吸附溫度40℃，吸附時(shí)間40 min，解吸時(shí)間2 min的條件下做試驗(yàn)。由圖1可以看出，50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭和75 μm CAR/PDMS萃取頭檢出的化合物比其它兩個(gè)萃取頭檢出的化合物多，這主要是因?yàn)檩腿☆^的涂層極性不同的緣故，萃取頭對(duì)所萃取的化合物具有選擇性，根據(jù)“相似相溶”原理，50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭和75 μm CAR/PDMS萃取頭的固定相屬于中等極性混合型涂層，兼有極性和非極性涂層[21]，吸附的化合物較多。從峰面積可以看出，50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭檢測(cè)到揮發(fā)性成分的離子信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)，說(shuō)明其對(duì)酒曲中的揮發(fā)性風(fēng)味組分的吸附能力較強(qiáng)。近年來(lái)也有許多學(xué)者認(rèn)為采用DVB/CAR/PDMS萃取頭對(duì)于易揮發(fā)性組分和極性化合物的分析更為有效[22-23]。綜合考慮檢出的化合物數(shù)量和質(zhì)譜離子信號(hào)強(qiáng)度，最終選擇50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭進(jìn)行紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造用曲中揮發(fā)性成分的萃取分析。

圖1 不同類型固相微萃取頭萃取的揮發(fā)性風(fēng)味組分的GC-MS總離子圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of aroma components extracted by different SPME fibers

2.2 紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造用曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)SPME-GC/MS分析

采用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭對(duì)福建紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造常用的4種不同地區(qū)的酒曲（古田紅曲、烏衣紅曲、龍巖藥曲、南平白曲）中的揮發(fā)性風(fēng)味組分進(jìn)行SPME-GC/MS分析。各組分經(jīng)圖譜庫(kù)檢索以及相關(guān)資料分析，其定性和半定量定量分析結(jié)果見表1。4種酒曲的總離子流色譜圖見圖2。

表1 4種酒曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)定性和定量分析結(jié)果（mg/kg酒曲）Table1 Qualitative and quantitative analysis of volatile flavor compounds in four different fermentation starters（mg/kg starter）

（續(xù)表1）

由表1可知，從4種酒曲樣品中共鑒定出62種匹配度≥80的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類17種，醛酮類9種，酚類4種，酯類8種，酸類11種，吡嗪類5種，其它化合物8種。醇類物質(zhì)是紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造用曲中種類最多和含量最多的化合物，相對(duì)含量較高的有苯乙醇、正己醇和3-甲基-1-丁醇。上海金楓酒業(yè)股份有限公司俞劍燊等[24]的研究也發(fā)現(xiàn)黃酒麥曲中的揮發(fā)性風(fēng)味組分以醇類揮發(fā)性組分為主。黎攀等[25]采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）技術(shù)研究傳統(tǒng)大曲固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性成分組成，共分離鑒定出揮發(fā)性化合物56種，其中以醇類和酯類揮發(fā)性組分最多。通過(guò)比較鄭翠銀[26]對(duì)紅曲黃酒風(fēng)味的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)酯類、醇類和酸類是紅曲黃酒中較為重要的風(fēng)味物質(zhì)。本研究中4種酒曲（古田紅曲、烏衣紅曲、龍巖藥曲、南平白曲）的揮發(fā)性風(fēng)味組分與紅曲黃酒相似的風(fēng)味化合物占紅曲黃酒的50%～70%，這表明酒曲除了對(duì)紅曲黃酒風(fēng)味的形成有直接貢獻(xiàn)外，還通過(guò)其中的各種微生物代謝產(chǎn)物影響紅曲黃酒的風(fēng)味。

通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，不同酒曲中揮發(fā)性風(fēng)味組分存在顯著性的差異，如2-壬醇、庚酮和壬醛是古田紅曲所特有的，已酸乙酯、異巴豆酸、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和3-乙基-2,5-二甲基吡嗪是烏衣紅曲所特有的，異丁醇是龍巖藥曲所特有的，鄰苯二甲酸二乙酯是南平白曲所特有的。由表1的定量分析結(jié)果還可看出，古田紅曲中辛酸、2-庚酮、2-壬酮、苯甲醛、苯甲醇、己酸的含量較高；烏衣紅曲中2-庚酮、2-壬酮、辛酸、仲辛酮、苯甲醛、正己醇、苯乙醇、三甲基吡嗪含量較高，龍巖藥曲中正己醇、苯乙醇、2-乙基-1-己醇、1,2-二甲氧基苯、2-甲基苯酚、苯甲醛含量較高，南平白曲中3-甲基-1-丁醇、正己醇、苯乙醇、1,2-二甲氧基苯含量較高。由圖1和表1可知，4種酒曲（古田紅曲、烏衣紅曲、龍巖藥曲、南平白曲）香氣物質(zhì)盡管在種類和含量上存在一定的差異，其主要香氣物質(zhì)還是相似的。其中，3-甲基-1-丁醇、正庚醇、正己醇、2-乙基-1-己醇、正辛醇、1-辛烯-3-醇、正戊醇、2,3-丁二醇、2-庚酮、2-壬酮、2-甲基苯酚、癸酸乙酯、3-甲基丁酸、辛酸、2,6-二甲基吡嗪和乙酰苯等是4種酒曲（古田紅曲、烏衣紅曲、龍巖藥曲、南平白曲）共有的揮發(fā)性風(fēng)味成分。

圖2 4種不同地區(qū)酒曲中揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.2 The total ion chromatogram of volatile components in different fermentation starters

4種酒曲（古田紅曲、烏衣紅曲、龍巖藥曲、南平白曲）中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成復(fù)雜而獨(dú)特，對(duì)紅曲黃酒的風(fēng)味品質(zhì)和口感的影響很大。醇類、酸類、醛酮類、酯類是酒曲中種類和含量較為豐富的四大類揮發(fā)性組分。然而，含量大的物質(zhì)對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)并不一定大，后續(xù)研究還需要結(jié)合揮發(fā)香物質(zhì)的閾值或者采用氣相色譜-嗅聞法（GC-O）才能判定各揮發(fā)香物質(zhì)是否對(duì)酒曲香氣起到積極作用。如俞劍燊等[24]通過(guò)固相微萃取結(jié)合氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-O-MS）對(duì)黃酒麥曲中揮發(fā)性風(fēng)味組分進(jìn)行定性分析，從不同種類的麥曲中共鑒定出50種揮發(fā)性化合物，其中氣相色譜-嗅聞法 （GC-O）能嗅聞到的揮發(fā)性化合物只有21種，這說(shuō)明某些揮發(fā)性化合物對(duì)酒曲風(fēng)味影響不大。

2.3 紅曲和藥白曲揮發(fā)性風(fēng)味組分主成分分析

在傳統(tǒng)發(fā)酵食品的香氣特征以及香氣質(zhì)量研究中，主成分分析法被許多研究者作為主要的分析工具。主成分分析的目的是簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)和揭示變量間的關(guān)系。本研究利用SIMCA軟件對(duì)4種酒曲香氣成分的含量進(jìn)行主成分分析，得到主成分的特征值和特征向量。表2所示3種主成分的載荷矩陣。其中，第1成分的貢獻(xiàn)率為56.08%，第2成分的貢獻(xiàn)率為30.31%，第3成分的貢獻(xiàn)率為13.62%，這3個(gè)成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到100%。根據(jù)主成分分析一般提取主成分包含85% 以上信息的原理，第一和第二主成分足以說(shuō)明本研究酒曲揮發(fā)性風(fēng)味組分?jǐn)?shù)據(jù)的規(guī)律。

表2 主成分載荷矩陣Table2 Loading matrix of principal component

（續(xù)表2）

圖3 不同紅曲黃酒釀造用曲揮發(fā)性香氣成分的主成分分析雙標(biāo)圖Fig.3 Biplots of aroma components in traditional fermentation starters for Hong Qu glutinous rice wine brewing

從圖3可以看出，古田紅曲和烏衣紅曲位于不同象限中，說(shuō)明這兩種紅曲的香氣組分差異較大。其中，古田紅曲分布在圖3中的第2象限，主要與第2主成分（PC2）呈正相關(guān)，與之密切相關(guān)的香氣成分包括2-壬醇 （C11）、 庚酮 （Q5）、 糠醛（Q7）、壬醛（Q9）、3-甲基丁酸（S3）和己酸（S5）。 烏衣紅曲分布在圖3中的第3象限，與第1主成分（PC1）和第 2主成分（PC2）呈負(fù)相關(guān)，與之密切相關(guān)的揮發(fā)性化合物主要包括正庚醇 （C2）、2-庚酮（Q1）、2-壬酮（Q2）、仲辛酮（Q3）、2-甲基-十二烷基酯（Z1）、癸酸乙酯（Z3）、已酸乙酯（Z6）、庚酸（S4）、異巴豆酸（S7）、戊酸（S11）、2,6-二甲基吡嗪（P1）、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪（P2）、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪（P3）和三甲基吡嗪（P5），可以看出烏衣紅曲富含吡嗪類化合物。此外，圖3還顯示龍巖藥曲和南平白曲二者都分布在第4象限且距離較近，說(shuō)明這兩種藥白曲的揮發(fā)性化合物組成較為接近，與它們密切相關(guān)的香氣成分有3-甲基-1-丁醇（C1）、2-乙基-1-己醇（C4）、3-辛醇（C12）、α-甲基苯甲醇（C13）、茨醇（C15）、雪松醇（C16）、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（F1）、苯酚（F2）、2-甲氧基苯酚（F3）、丁二酸二乙酯（Z2）、異丁酸丁酯（Z8）、乙偶姻（O1）、愈創(chuàng)木酚甘油醚（O3）、苯并噻唑（O5）、1，2-二甲氧基苯（O6）、1,4-二甲氧基苯（O7）和大茴香醚（O8）。

4種不同地區(qū)的酒曲（古田紅曲、烏衣紅曲、龍巖藥曲、南平白曲）香氣成分的種類和含量存在顯著差別，這可能是由于制曲所采用的原料和制曲工藝的不同，更為重要的原因是傳統(tǒng)制曲過(guò)程中的微生物菌群差異造成的。后續(xù)研究將通過(guò)酒曲中的微生物菌群分析，從中篩選出有益的微生物菌株，進(jìn)行純種混合發(fā)酵制曲來(lái)提高酒曲的發(fā)酵特性以及風(fēng)味品質(zhì)。

通過(guò)SIMCA軟件分析不同揮發(fā)性香氣成分對(duì)不同紅曲黃酒釀造用曲（古田紅曲、烏衣紅曲、龍巖藥曲、南平白曲）風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)度，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同紅曲黃酒釀造用曲中揮發(fā)性成分對(duì)風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)度分析Fig.4 Contribution analysis of different volatile aroma compositions to different traditional fermentation starters

對(duì)古田紅曲風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)，按影響力從大到小依次為己酸（S5）、壬醛（Q9）、糠醛（Q7）、庚酮（Q5）、2-壬醇（C11）、正己醛（Q8）、苯甲醇（C14）、3-甲基丁酸（S3）、苯甲醛（Q6）；對(duì)烏衣紅曲風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)，按影響力從大到小依次為棕櫚酸乙酯（Z5）、正辛醇（C5）、四甲基吡嗪（P4）、1-辛烯-3-醇（C6）、正庚醇（C2）、仲辛酮（Q3）、2,6-二甲基吡嗪（P1）、已酸乙酯（Z6）、戊酸（S11）、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪 （P2）、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪（P3）；對(duì)龍巖藥曲風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)，按影響力從大到小依次為 2-乙基己酸 （S6）、α-甲基苯甲醇（C13）、茨醇（C15）、雪松醇（C16）、庚酮（O5）、苯甲醛（O6）、仲辛酮（O3）、2-甲氧基苯酚（F3）、正己醛（O8）；對(duì)南平白曲風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)，按影響力從大到小依次為乙酸（S1）、正己醇（C3）、2,3-丁二醇（C9）、3-甲基丁酸 （S3）、 苯乙醇 （C17）、3-辛酮（Q4）、鄰苯二甲酸二乙酯（Z4）、棕櫚酸乙酯（Z5）、乙偶姻（O1）。

3 結(jié)論

1）通過(guò)比較4種類型涂層的SPME萃取頭對(duì)酒曲揮發(fā)性風(fēng)味組分萃取效果的影響，并綜合考慮檢出的化合物數(shù)量和質(zhì)譜離子信號(hào)強(qiáng)度，最終選擇50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭進(jìn)行紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造用曲中揮發(fā)性成分的萃取分析。

2）采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭對(duì)福建紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造常用的4種酒曲 （古田紅曲、烏衣紅曲、龍巖藥曲、南平白曲）中的揮發(fā)性風(fēng)味組分進(jìn)行SPME-GC/MS分析，共鑒別出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)62種，包括醇類17種，醛酮類9種，酚類4種，酯類8種，酸類11種，吡嗪類5種，其它少量化合物8種。其中，醇類、酸類、醛酮類、酯類是酒曲中種類和含量較為豐富的四大類揮發(fā)性組分。

3）運(yùn)用主成分分析法對(duì)不同酒曲中揮發(fā)性風(fēng)味組分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)古田紅曲和烏衣紅曲在香氣成分上有明顯差異，而龍巖藥曲和南平白曲在香氣成分上較為接近。通過(guò)分析不同揮發(fā)性成分對(duì)不同紅曲黃酒釀造用曲 （古田紅曲、烏衣紅曲、龍巖藥曲、南平白曲）風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)度，尋找與不同酒曲密切相關(guān)的特征揮發(fā)性風(fēng)味成分。