鄧加聰，杜可，韓艷麗，鄭虹,2

(1.福建師范大學福清分校 海洋與生化工程學院，福建 福清 350300； 2.食品軟塑包裝技術(shù)福建省高校工程研究中心，福建 福清 350300)

隨著人們健康意識的增強，天然色素越來越受廣大消費者的青睞，特別是由紅曲霉合成的紅曲色素，具有調(diào)節(jié)血壓、抗突變、抑菌等活性，是一類安全、無毒的天然食用色素[1-3]。紅曲色素在肉制品、面包制品、豆腐乳制品、釀酒行業(yè)等食品制作中都得到了廣泛的應用[4-6]。

目前，紅曲色素的發(fā)酵生產(chǎn)方法主要有固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵[7-9]，其中由于液態(tài)發(fā)酵具有發(fā)酵周期短、不易染菌等優(yōu)點，近年來深受人們的關(guān)注。付榮霞等[10]從不同碳源、氮源、pH、裝液量等方面對紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的液態(tài)發(fā)酵條件進行了研究，結(jié)果表明：其最佳的發(fā)酵工藝條件是以3%玉米粉為碳源，0.02%酵母膏為氮源，pH為4.0，裝液量為125 mL/250 mL，此時紅曲色素的總色價可達93.66 U/mL。王艷等[11]得到紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的最佳工藝條件為：葡萄糖60 g/L、蛋白胨26 g/L、FeSO40.9 g/L、L-谷氨酸2 g/L和初始pH 4.5。在此優(yōu)化條件下，紅曲色素色價為105.22 U/mL，比優(yōu)化前(33.62 U/mL)提高了3.13倍。

為了更好地開發(fā)利用紅曲色素，本文不僅從裝液量、時間、接種量、金屬離子及維生素添加量等方面對紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的工藝條件進行了研究，還從pH、光照、添加劑等方面研究了紅曲色素的穩(wěn)定性，為紅曲色素的生產(chǎn)及在食品行業(yè)中的進一步開發(fā)應用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅曲霉(Monascusrubber)：保存于福建師范大學福清分校生物工程實驗室；蔗糖、蛋白胨、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸錳、硫酸鋅等試劑：均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；試管斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)；種子培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖30、蛋白胨30、KH2PO40.5、MgSO40.5、pH 5.5～6.0；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖40、蛋白胨30、KH2PO42.0、MgSO41.0、硝酸鈉 0.1、pH 6.0。

SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱 福州精科儀器儀表有限公司；722SP分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；TG16-WS高速臺式離心機 上海湘儀有限公司；BS224S電子天平 賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；FA2204B電子分析天平 上海越平科學儀器有限公司；T.HZ-C臺式恒溫振蕩器 太倉市華美生化儀器廠；NRY-2102C恒溫培養(yǎng)震蕩器 南榮實驗室設備有限公司；DKS-24數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海精密實驗設備有限公司；CDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺 福州伍聯(lián)醫(yī)療器械有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅曲霉的活化及種子液的制備

挑取4 ℃冰箱保存的紅曲霉劃線接種于試管斜面，30 ℃活化培養(yǎng)5 d；挑取活化后的紅曲霉接至裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。

1.2.2 紅曲霉液態(tài)發(fā)酵優(yōu)化的單因素試驗

將培養(yǎng)好的種子液按不同接種量接至不同裝液量，添加不同金屬離子濃度及不同維生素濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中(添加有數(shù)粒玻璃珠)，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)一定時間后，發(fā)酵液在8000 r/min離心5 min，分別收集上清液和菌絲沉淀，測定上清液的紅曲色素。裝液量梯度為25，50，75，100，125，150 mL/250 mL三角瓶；接種量梯度為1%、3%、5%、7%、9%、11%；培養(yǎng)時間梯度為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11 d；金屬離子(硫酸銅、硫酸亞鐵、硫酸鐵)添加量梯度為0，0.025，0.05，0.075，0.100，0.125，0.150 mmol/L；維生素(維生素B1、維生素B3、維生素B5、葉酸、維生素H)添加量梯度為0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%。

1.2.3 紅曲霉液態(tài)發(fā)酵優(yōu)化的正交設計試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用五因素三水平對紅曲霉液態(tài)發(fā)酵進行正交試驗設計，其因素和水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 發(fā)酵液中紅曲色素色價的測定

紅曲紅色素色價的測定采用GB 15961-2005《食品添加劑 紅曲紅》。

1.2.5 紅曲色素的穩(wěn)定性研究[12-15]

1.2.5.1 溫度對紅曲色素穩(wěn)定性的影響

取10 mL發(fā)酵上清液于25 mL具塞試管中，分別置于20，40，60，80，100 ℃水浴中，每隔0.5 h測定色價。

1.2.5.2 光照對紅曲色素穩(wěn)定性的影響

取10 mL發(fā)酵上清液于25 mL具塞試管中，分別在18 W日光、自然光、避光下放置，每隔12 h取樣測定色價。

1.2.5.3 pH對紅曲色素穩(wěn)定性的影響

取10 mL發(fā)酵上清液于25 mL具塞試管中，用0.1 mol/L鹽酸或0.1 mol/L氫氧化鈉將pH調(diào)至1，3，5，7，9，11，室溫下放置一定時間，每隔2 h取樣測定色價。

1.2.5.4 氧化劑、還原劑及添加劑對紅曲色素穩(wěn)定性的影響

取10 mL發(fā)酵上清液于25 mL具塞試管中，分別添加維生素C、雙氧水、苯甲酸鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)及亞硝酸鈉等，使其終濃度為100 mg/L。搖勻后，避光保存，每隔2 h取樣測定色價。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉產(chǎn)紅曲色素產(chǎn)量的單因素試驗

2.1.1 裝液量對紅曲霉液態(tài)發(fā)酵的影響

圖1 裝液量對紅曲霉的發(fā)酵產(chǎn)色素的影響Fig.1 The effect of loading volume on pigment produced by Monascus

由圖1可知，隨著裝液量的不斷升高，紅曲霉所產(chǎn)紅曲色素的色價含量呈先增后降的趨勢；當裝液量為75 mL時，紅曲色素的產(chǎn)量達到最高，其色價值可達到279.60 U/mL。紅曲霉為好氧菌，裝液量主要影響液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量，當其他培養(yǎng)條件相同時，隨著裝液量的增加，發(fā)酵液中單位體積的溶氧量下降，紅曲色素產(chǎn)量在一定程度上會有所下降。付榮霞等研究發(fā)現(xiàn)，裝液量125 mL/250 mL時，紅曲霉產(chǎn)生的紅曲色素最高，總色價可達93.66 U/mL。

2.1.2 接種量對紅曲霉液態(tài)發(fā)酵的影響

圖2 接種量對紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)色素的影響Fig.2 The effect of inoculation amount on pigment produced by Monascus

由圖2可知，隨著接種量的不斷升高，紅曲霉所合成的色價含量先增大后減小，之后接種量繼續(xù)增大色價再變?。划斀臃N量為7%時，紅曲霉所合成的色價含量達到最高，其色價值可達到373.55 U/mL。接種量過少，菌體生長緩慢，發(fā)酵時間長，色素產(chǎn)量低；接種量過多，會導致發(fā)酵前期營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，使發(fā)酵液體黏度增加，影響菌絲體生長劑色素的合成和分泌。因此，紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素的最適接種量為7%。這與李慧等[16]的實驗結(jié)果有所不同，李慧等的研究結(jié)果表明5%的接種量對紅曲霉液態(tài)發(fā)酵效果較好。

2.1.3 培養(yǎng)時間對紅曲霉液態(tài)發(fā)酵的影響

圖3 培養(yǎng)時間對紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)色素的影響Fig.3 The effect of culture time on pigment produced by Monascus

由圖3可知，隨著培養(yǎng)天數(shù)的遞增，紅曲霉所合成的紅曲色素含量逐漸增高，當培養(yǎng)時間為7 d時，紅曲色素的含量達到最大，其色價可達429.39 U/mL；之后，隨著培養(yǎng)時間的延長，色素含量反而逐漸減少。估計是因為紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)到一定時間后，體系中的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸耗盡，導致紅曲霉生長緩慢，而紅曲色素的產(chǎn)量也隨之減少。因此選擇培養(yǎng)時間7 d為最佳培養(yǎng)時間。而邱鵬等[17]得到的最適培養(yǎng)時間為10 d，紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)10 d后，其紅曲色價可達112 U/L。

2.1.4 金屬離子對紅曲色素產(chǎn)量的影響

圖4 金屬離子對紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)色素的影響Fig.4 The effect of mental ions on pigment produced by Monascus

由圖4可知，與未添加銅離子的對照相比，加入銅離子后，色價隨銅離子濃度的增加而逐漸降低，表明發(fā)酵液中的紅曲色素產(chǎn)量減少，最后趨于平緩；加入亞鐵離子后，色價隨亞鐵離子濃度的增加逐漸增加，當亞鐵離子濃度達到0.01 mmol/L時，色價達到最大值，為503.00 U/mL；之后，色價隨著亞鐵離子的增加而逐漸減少；當亞鐵離子>0.02 mmol/L，色價變化不是很大；與對照相比，發(fā)酵液的色價隨鐵離子濃度增加呈先增后降的趨勢，當鐵離子濃度為0.01 mmol/L時，色價達到最大值，為512.33 U/mL。

2.1.5 維生素對紅曲色素產(chǎn)量的影響

圖5 維生素對紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)色素的影響Fig.5 The effect of vitamins on pigment produced by Monascus

由圖5可知，與對照CK(紅曲色素產(chǎn)量為476.40 U/mL)相比，不同維生素對紅曲霉產(chǎn)紅曲色素的影響各不相同，維生素B1和維生素B3對紅曲色素產(chǎn)量有促進作用，維生素B5和葉酸對紅曲色素產(chǎn)量影響不大，而維生素H對紅曲色素的合成具有抑制作用。不同濃度的同一種維生素對紅曲色素產(chǎn)量的影響，都是先增后降；其中當維生素B1和維生素B3的濃度為0.03%時，紅曲色素的產(chǎn)量均達到最大，分別為647.02 U/mL和635.26 U/mL。這與楊成龍等[18]得到的結(jié)果相一致。

2.2 紅曲霉液態(tài)發(fā)酵優(yōu)化的正交設計試驗

為了探討紅曲霉液態(tài)發(fā)酵的最適條件，采用七因素三水平對裝液量、接種量、培養(yǎng)時間、硫酸亞鐵添加量及維生素B1添加量5個因素進行正交試驗。正交試驗結(jié)果分析見表2。

表2 L18(37)正交試驗結(jié)果的直觀分析Table 2 Visual analysis of results of L18(37)orthogonal test

由表2極差分析可知，D>E>B>C>A，即影響紅曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素的因素順序為：硫酸亞鐵添加量>維生素B1添加量>培養(yǎng)時間>接種量>裝液量。根據(jù)各試驗因子的平均值，得到最佳組合為A3B2C3D1E3，即：裝液量為100 mL/250 mL，培養(yǎng)時間為7 d，接種量為9%，硫酸亞鐵添加濃度為0.005 mmol/L，維生素B1添加濃度為0.05%。

2.3 驗證試驗

由正交表得到的最佳組合(A3B2C3D1E3)與試驗結(jié)果得到紅曲色素產(chǎn)量最高的組合(A2B2C3D1E2)不一致，因此對兩個組合進行驗證試驗，驗證試驗結(jié)果見表3。

表3 驗證試驗結(jié)果Table 3 Results of verification test

由表3驗證試驗結(jié)果可知，組合A2B2C3D1E2與組合A3B2C3D1E3相比，前者對紅曲霉液態(tài)發(fā)酵的效果更佳。即當培養(yǎng)裝量為75 mL/250 mL，培養(yǎng)時間為7 d，接種量為9%，硫酸亞鐵添加濃度為0.005 mmol/L，維生素B1的添加濃度為0.03%。在此條件下，紅曲霉的色價可達714.80 U/mL。

2.4 紅曲色素穩(wěn)定性研究

2.4.1 pH對紅曲色素穩(wěn)定性的影響

圖6 pH對紅曲色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 The effect of pH on the stability of Monascus pigment

由圖6可知，在同一時間下，紅曲色素的色價隨著溶液中pH值的升高而呈先增后降的趨勢，當pH為7時，紅曲色價均達到最大值；在同一pH溶液中，紅曲色素的色價基本上隨著時間的延長呈先增后降的趨勢，但是變化趨勢不是很明顯。因此，紅曲色素最適保存的pH為7。

2.4.2 光照對紅曲色素穩(wěn)定性的影響

由圖7可知，不同光照對紅曲色素色價的影響各不相同，在同一時間下，光照對紅曲色素色價的影響如下：紫外光>自然光>18 W日光>避光；對于同一種光照方式，紅曲色素的色價均隨著光照時間的延長而逐漸降低。因此，紅曲色素避光保存的效果最佳。

圖7 光照對紅曲色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 The effect of illumination on the stability of Monascus pigment

2.4.3 食品添加劑對紅曲色素穩(wěn)定性的影響

圖8 食品添加劑對紅曲色素穩(wěn)定性的影響Fig.8 The effect of food additives on the stability of Monascus pigment

由圖8可知，食品添加劑苯甲酸鈉和亞硝酸鈉對紅曲色素具有一定的增色作用，但是添加一定量的EDTA會使紅曲色素的色價降低，維生素C和雙氧水對紅曲色素的影響不大。

3 結(jié)論

試驗對紅曲霉的液體搖瓶發(fā)酵工藝進行了初步研究：考察了裝液量、時間、接種量、金屬離子及維生素等因素對紅曲霉液體發(fā)酵產(chǎn)紅曲色價的影響。結(jié)果表明：當培養(yǎng)裝液量為75 mL/250 mL，培養(yǎng)時間為7 d，接種量為9%，硫酸亞鐵添加濃度為0.005 mmol/L，維生素B1添加濃度為0.03%時最有利于紅曲霉合成紅曲色素，其色價可達714.80 U/mL。

從光照、pH和食品添加劑對紅曲霉所產(chǎn)紅曲色素的穩(wěn)定性方面進行初步研究，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在同一時間下，紅曲色素的色價隨著溶液中pH值的升高而呈先增后降的趨勢，當pH為7時，紅曲色價均達到最大值；在同一pH溶液中，紅曲色素的色價基本上隨著時間的延長呈先增后降的趨勢，但是變化趨勢不是很明顯。在同一時間下，光照對紅曲色素色價的影響如下：紫外光>自然光>18 W日光>避光；對于同一種光照方式，紅曲色素的色價均隨著光照時間的延長而逐漸降低。食品添加劑苯甲酸鈉和亞硝酸鈉對紅曲色素具有一定的增色作用，但是添加一定量的EDTA會使紅曲色素的色價降低，維生素C和雙氧水對紅曲色素的影響不大。這與全桂靜等[19]的研究結(jié)果相一致。