大鯢MC1R基因的克隆、序列分析與表達(dá)研究

鄧捷　衛(wèi)小燕　張晗　馬紅英　王啟軍　趙虎　張紅星　姜維

摘 要：為研究MC1R在兩棲動物體色形成中的作用，試驗結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析和電子克隆技術(shù)得到大鯢（Andrias davidianus）MC1R部分cDNA序列并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，采用實時熒光定量法檢測了大鯢MC1R基因在皮膚、肝臟等10個組織中的表達(dá)情況及4種不同體色大鯢皮膚組織中MC1R基因的表達(dá)量。結(jié)果表明：得到大鯢MC1R部分cDNA長為295 bp，位于該基因編碼區(qū)。其與人、小鼠等哺乳動物和鳥類MC1R核苷酸同源性在57%～83%。大鯢MC1R基因與粗皮漬螈的親緣關(guān)系最近。該基因在不同組織中均有表達(dá)，以皮膚組織表達(dá)量最高。4種不同體色大鯢皮膚組織中，黑色皮膚中MC1R基因表達(dá)量高于其他體色。說明大鯢MC1R基因在體色形成過程中可能具有與其他兩棲動物不同的調(diào)控機制。

關(guān)鍵詞：大鯢（Andrias davidianus）;體色;黑色素;黑皮質(zhì)素受體-1（Melanocortin-1 receptor，MC1R）基因;表達(dá)

中圖分類號：Q959.9;Q78

兩棲類動物體表表現(xiàn)出獨特的色彩類型和著色模式，是物種進(jìn)化和表觀遺傳學(xué)研究的熱點問題。兩棲動物體色與其真皮層中的三類色素細(xì)胞相關(guān)：載黑素細(xì)胞（melanophores）合成和運輸黑色素，產(chǎn)生了褐色-黑色體色[1]，載虹素細(xì)胞（iridophores）對光線的反射和散射作用，產(chǎn)生了藍(lán)-綠色體色[2];載黃素細(xì)胞（xanthophores）含有蝶啶或類胡蘿卜素，產(chǎn)生了黃色的體色。

目前，有關(guān)哺乳動物、鳥類和魚類體色形成的分子遺傳機制的研究較多，揭示了圍繞黑色素細(xì)胞進(jìn)行的黑色素合成與運輸相關(guān)分子調(diào)控系統(tǒng)。兩棲類動物具有獨特的體色類型，以往的研究從生理學(xué)和行為學(xué)上對其體色形成模式進(jìn)行闡述和分析[3-5]，有關(guān)其體色性狀下潛在的分子遺傳特征的報道較少[6]。黑皮質(zhì)素受體-1（Melanocortin-1 receptor，MC1R）是動物黑色素合成通路中的限速酶，在載黑素細(xì)胞合成黑色素轉(zhuǎn)為合成褐色素過程中起著類似于“開關(guān)”的作用[7]。哺乳動物、鳥類、爬行動物MC1R基因突變會引起動物體色（毛色）白化、黃化或者黑化[8-10]。Herczeg等研究成果顯示MC1R基因的核苷酸突變與歐洲普通青蛙（Rana temporaria）體色的黑化程度不存在相關(guān)性[11]，但歐洲普通青蛙（Rana temporaria）17個地理種群間MC1R基因的多態(tài)性存在差異[12]。中國大鯢（Andrias davidianus）是現(xiàn)存體型最大的兩棲動物，在其漫長的進(jìn)化過程中形成了豐富的體色。野生型的大鯢體色為不同深淺的棕-黑色，白化和黑化是兩種比較常見的體色變異類型[13]。黑色素合成通路十分保守，因此推測黑皮質(zhì)素受體-1MC1R）基因及其多態(tài)性可能與中國大鯢不同體色的表型相關(guān)。

本研究采集了自然色大鯢、白化個體、黑化個體（見封三圖1）皮膚組織樣，克隆了大鯢MC1R基因部分序列，采用qRT-PCR方法檢測并分析其在大鯢10個組織和器官中表達(dá)分布和其在上述三種體色個體皮膚組織中表達(dá)情況，總結(jié)了大鯢MC1R基因表達(dá)譜差異，探討了該基因與大鯢體色白化與黑化之間的關(guān)系，初步闡述了大鯢體色形成的分子基礎(chǔ)，為兩棲動物體色遺傳機制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗大鯢個體來自漢中古生大鯢有限公司，具有漁業(yè)行政主管部門頒發(fā)的水生野生動物經(jīng)營利用許可證（（漢）水野經(jīng)字（2015）23號））。

1.2 主要試劑

Trizol Reagent，購自美國Invitrogen公司;Rnase-free DnaⅠ，購自大連寶生物公司;RevertAid cDNA Synthesize Kit，購自加拿大Fermentas公司;FastStart SYBR Green qPCR Master Mix，購自德國Roche公司。

1.3 主要儀器

液氮生物容器，購自四川金鳳;臺式超速低溫離心機，購自德國Eppendorf公司;去離子水超純水系統(tǒng)及恒溫水浴循環(huán)系統(tǒng)，購自美國Thermo公司;紫外分光光度計，購自德國Beckman公司;實時熒光定量PCR儀及凝膠成像系統(tǒng)，購自美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 實驗動物分組

選取3尾大鯢，取其皮膚、肌肉等10個組織，具體采集的組織部位和方法同姜維等[13]所述。

2.2 RNA提取

取0.2 g不同組織樣本，于研磨器中低溫研磨至勻漿后，利用Trizol法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取效果，紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。

2.3 反轉(zhuǎn)錄

利用RevertAid cDNA Synthesize Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實驗，反應(yīng)體系：總體積20 μL，其中RNA模板 2 μg，oligoDT 1 μL，5×buffer 2 μL，RNase抑制劑1 μL，10 mM dNTP mix 1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，加DEPC水至20 μL。反應(yīng)條件：42 ℃，60 min;70 ℃，2 min。-20 ℃保存產(chǎn)物，備用。

2.4 MC1R基因擴(kuò)增及熒光定量PCR引物設(shè)計與合成

以前期實驗獲得的大鯢皮膚組織轉(zhuǎn)錄組文庫中MC1R基因序列為參照，使用PrimerQuest（http：//sg.idtdna.com/Primerquest/Home/IndexPrimer）設(shè)計MC1R基因熒光定量PCR引物，引物詳情見表1。

2.5 MC1R基因序列分析

通過CAP3（http：//biosrv.cab.unina.it/webcap3/）軟件完成大鯢MC1R基因序列拼接;FeatureMap3D （http：//www.cbs.dtu.dk/services/FeatureMap3D/）及SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進(jìn)行蛋白高級結(jié)構(gòu)域分析;利用ClustalW等將大鯢MC1R基因核苷酸序列與GenBank中的其他物種序列進(jìn)行同源比對。

2.6 qRT-PCR分析大鯢MC1R和MITF基因的組織特異性表達(dá)

采集大鯢肌肉、皮膚、心、肝、脾、肺、胃、胰臟、生殖腺（卵巢/精巢）、腸道組織等不同來源組織cDNA為模板，使用前期設(shè)計的熒光定量PCR引物，進(jìn)行大鯢MC1R基因PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積為20 μL，其中cDNA 1 μL，10 nmol/μL? dNTP 1 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.75 μL，F(xiàn)astStart SYBR Green qPCR Master Mix （德國Roche） 14.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃，1 min;40個循環(huán)（94 ℃，18 s;62 ℃，18 s;72 ℃，20 s;），85 ℃ 讀板。GAPDH作為內(nèi)參基因，同時以未加模板的反應(yīng)孔作為空白對照，每個反應(yīng)重復(fù)三次。利用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計，分別以MC1R/MITF基因的Ct值減掉相應(yīng)GAPDH的Ct值，得出MC1R/MITF基因的ΔCt，使用Power（2，-ΔΔCt）公式計算MC1R/MITF基因的相對表達(dá)量。

2.7 qRT-PCR分析不同體色大鯢MC1R基因的特異性表達(dá)

以WT、am、aa、ma等4種差異顯著體色大鯢皮膚組織cDNA為模板，利用熒光定量PCR引物，進(jìn)行MC1R基因PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系及條件等同2.6。

3 結(jié)果與分析

3.1 RNA提取效果檢測

組織樣總RNA電泳效果見圖2，結(jié)果顯示28 S條帶亮度是18 S的2倍左右，說明提取的總RNA完整性和濃度較好，可用于后續(xù)實驗。

3.2 MC1R和MITF基因的電子克隆及序列分析

大鯢皮膚組織轉(zhuǎn)錄組文庫中的ESTs經(jīng)拼接后得到大鯢MC1R基因cDNA長為295 bp，位于該基因編碼區(qū)（圖3）。

3.3 MC1R基因核苷酸同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

使用BioEdit軟件的ClustalW程序?qū)Υ篥FMC1R基因與其他物種的核苷酸序列相似性進(jìn)行多重比對（圖4），結(jié)果顯示，大鯢與粗皮漬螈（T.granulosa）相似性最高，為83.33%，與西部錦龜（C.picta bellii）的序列相似性在80.14%，與其他脊椎動物的序列同源性介于57%～79.18%之間。采用NJ法構(gòu)建蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），結(jié)果顯示：大鯢與粗皮漬螈進(jìn)化關(guān)系最近，能夠聚為一支。

3.4 大鯢MC1R基因組織表達(dá)譜差異

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，大鯢MC1R基因在實驗個體的所有組織中均有表達(dá)，其中在皮膚組織中mRNA的表達(dá)量最高，其次為胰腺、胃、肺、肝臟、腸、脾臟、性腺組織等，在心臟和肌肉組織中表達(dá)量最低（圖6）。同時發(fā)現(xiàn)MC1R基因在不同體色個體的皮膚組織中均有表達(dá)（圖7），其中在尾部皮膚為黑色（am型）中mRNA的表達(dá)量最高，其次為黃色皮膚組織（aa型）和黑色皮膚上散布白斑（ma型）的個體，野生型（WT型）個體皮膚組織中MC1R基因的表達(dá)量最低。

4 討論

大鯢是我國的特有的二級保護(hù)動物，以往有關(guān)大鯢生物學(xué)特征和資源保護(hù)方面的研究較多，分子遺傳學(xué)方面的研究較少[14]。候選基因法是目前比較常用的功能基因的研究方法，由于大鯢及其近緣物種的基因組數(shù)據(jù)比較缺乏，沒有體色方面的候選基因信息，因此本研究采用了轉(zhuǎn)錄組測序的方法，通過構(gòu)建和分析大鯢皮膚組織轉(zhuǎn)錄組文庫中MC1R基因的contigs，得到大鯢MC1R基因長295 bp的核苷酸序列。該序列位于基因的編碼區(qū)，其與人（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）等哺乳動物和鳥類的MC1R 同源性在57%～83%，表明MC1R 基因在不同物種間較為保守。

本實驗中MC1R 基因mRNA在大鯢的皮膚、胰腺、胃、肺、肝臟、腸、脾臟、生殖腺（卵巢/精巢）、心臟、肌肉中均有表達(dá)，其中皮膚組織中的表達(dá)量為最高，這與其他物種略有差別。哺乳動物的MC1R 基因主要在毛囊和皮膚黑素細(xì)胞中表達(dá)[15]。綿羊MC1R基因主要表達(dá)部位為毛囊的基質(zhì)、根鞘等區(qū)[16]。新月魚（X.maculatus） 的MC1R基因在腦、眼、鰓、皮膚、睪丸、肌肉和肝臟都有表達(dá)，與青鳉（O.latipes） 的MC1R基因的表達(dá)模式相似[17]。橘色雙冠麗魚MC1R 基因在成熟魚體的鱗片、性腺、肌肉、尾鰭、心、腎、眼、腦、皮膚、鰓、鰾等11種組織中均有表達(dá)[18]。研究表明，MC1R在不同物種中其組織表達(dá)模式存在較大差異性。

大鯢的基本體色為不同深淺的棕-黑，黑化是比較常見的體色變異類型。在本實驗中，大約1/3的大鯢皮膚出現(xiàn)黑化。哺乳動物、鳥類、爬行動物MC1R基因發(fā)生突變時，MC1R表達(dá)量上升，細(xì)胞內(nèi)大量合成黑色素，使得動物毛色黑化[19-20]。而MC1R基因突變與蜥蜴（L.occipitalis ，L.arambarensis）、歐洲蛙（R.temporaria）體表顏色的加深沒有直接的關(guān)系[11，21]。在本研究中，大鯢MC1R基因mRNA在am （背部為黃色，尾部為黑色）和ma （背部和尾部主色為黑色，隨機散布白斑）黑化型個體中的表達(dá)量均高于野生型（深棕色-深灰色），說明大鯢體色黑化可能與MC1R基因的表達(dá)量升高有關(guān)。

白化癥是動物毛色（體色）變化中比較常見的變異類型。研究發(fā)現(xiàn)，多種蜥蜴（A.inornata，S.undulates，L.lepida）MC1R基因的堿基替代，導(dǎo)致其編碼的MC1R蛋白喪失部分功能，使得蜥蜴背部出現(xiàn)白斑[22-24]。本實驗表明，大鯢MC1R基因mRNA在黃色個體皮膚組織中的表達(dá)量較野生型相對較高，但差異不顯著，說明MC1R基因的表達(dá)量與大鯢個體體色的白化不存在顯著相關(guān)性。Woodcock等[25]研究發(fā)現(xiàn)edn3基因突變和tyr基因142 bp的核苷酸缺失與美西鈍口螈A.mexicanum個體的白化病存在相關(guān)性。鑒于MC1R基因是調(diào)控黑色素合成的眾多基因之一，大鯢個體體色的白化是否與其下游基因，例如tyr等基因相關(guān)，還需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] DUELLMAN W E，TRUEB L.Biology of amphibians[M].New York：McGraw-Hill Book Co.1986.

[2] SAENKO S V J，TEYSSIER D，VAN DER M，et al.Precise colocalization of interacting structural and pigmentary elements generates extensive color pattern variation in Phelsuma lizards[J].BMC Biol，2013（11）：105.

[3] BAGNARA J T，HADLEY M E.The control of bright colored pigment cells of fishes and amphibians[J].Am Zool，1969，9 （2）：465-478.

[4] BEUKEMA W，NICIEZA A G，LOURENO A，et al.Colour polymorphism in Salamandra salamandra （Amphibia：Urodela），revealed by a lack of genetic and environmental differentiation between distinct phenotypes[J].Journal of Zoological Systematics & Evolutionary Research，2016，54 （2）：127-136.

[5] KINDERMANN C，HERO J M.Pigment cell distribution in a rapid colour changing amphibian （Litoria wilcoxii）[J].Zoomorphology，2016，135 （2）：1-7. Kindermann C ， Hero J M . Pigment cell distribution in a rapid colour changing amphibian （Litoria wilcoxii）[J]. Zoomorphology， 2016， 135（2）：197-203.

[6] STUCKERT A M M，MOORE E，COYLE K P，et al.Variation in pigmentation gene expression is associated with distinct aposematic color morphs in the poison frog Dendrobates auratus[J].BMC Evolutionary Biology，2019，19（1）：85.

[7] WOLF H E M，BOULANGER M C，DORAZIO J A.Melanocortin 1 receptor：structure，function，and regulation[J].Frontiers in Genetics，2016（7）：95.

[8] EIZRIK E，YUHKI N，JOHNSON W E，et al.Molecular genetics and evolution of melanism in the cat family[J].Current Biology，2003，13（5）：448-453.

[9] NADEAU N J，MINVIELLE F，MUNDY N I.Association of a Glu92Lys substitution in MC1R with extended brown in Japanese quail （Coturnix japonica）[J].Animal Genetics，2006， 37（3）：287-289.

[10] NUNES V L，MARILDO A，BEAUMONT M A，et al.Association of MC1R variants with ecologically relevant phenotypes in the European ocellated lizard，Lacerta lepida[J].Journal of Evolutionary Biology，2011，24（8）：2289-2298.

[11] HERCZEG G，MATSUBA C，MERIL J.Sequence variation in the melanocortin-1 receptor gene MC1R） does not explain variation in the degree of melanism in a widespread amphibian[J].Annales Zoologici Fennici，2010，47（1）：37-45.

[12] MATSUBA C.Geographic variations of melanocortine 1 receptor gene MC1R） in the common frog （Rana temporaria） in Northern Europe[J].Amphibia-Reptilia，2012，33（1）：105-111.

[13] 姜維，鄧捷，王啟軍，等.大鯢Agouti基因的克隆、表達(dá)及多態(tài)性分析[J].四川動物，2019，38（2）：121-129.

[14] 何青，劉靜，劉麗麗，等.中國大鯢Sox2基因全長cDNA 序列的克隆及組織表達(dá)分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2018，37（3）：1137-1144.

[15] MOUNTJOY K G，ROBBINS L S，MORTRUD M T，et al.The cloning of a family of genes that encode the melanocortin receptors[J].Science，1992，257（5074），1248-1251.

[16] 王海東，李亞楠，陳天直，等.不同毛色綿羊皮膚中 MC1R 的差異表達(dá)及定位[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2016，35 （10）：2614-2620.

[17] SELZ Y， BRAASCH I， HOFFMANN C，et al.Evolution of melanocortin receptors in teleost fish：The melanocortin type 1 receptor[J].Gene，2007，401（1-2）：114-122.

[18] 周康奇，宋紅梅，潘賢輝，等.橘色雙冠麗魚體色相關(guān)基因 mc1r 的組織表達(dá)分析[J].動物學(xué)雜志，2019，54（1）：45-56.

[19] REES J L. The melanocortin 1 receptor MC1R）：more than just red hair[J].Pigment Cell Research 2010， 13（3），135-140.

[20] MCROBIE H R，KING L M，F(xiàn)ANUTTI C，et al.Melanocortin 1 receptor MC1R） gene sequence variation and melanism in the gray （Sciurus carolinensis），fox （Sciurus niger），and red （Sciurus vulgaris） squirrel[J].Journal of Heredity，2014，105（3）：423-428.

[21] CORSO J，GONALVES G L，F(xiàn)REITAS T RO DE.Sequence variation in the melanocortin-1 receptor MC1R） pigmentation gene and its role in the cryptic coloration of two South American sand lizards[J].Genetics and Molecular Biology，2012，35（1）：81-87.

[22] ROSENBLUM E B，HOEKSTRA H E，NACHMAN M W.Adaptive reptile color variation and the evolution of the Mc1r gene[J].Evolution，2004，58：1794-1808.

[23] ROSENBLUM E B，ROMPLER H，SCHONEBERG T，et al.Molecular and functional basis of phenotypic convergence in white lizards at White Sands[J].Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（5）：2113-2117.

[24] GARCIA-BORRON J C，SANCHEZ-LAORDEN B L，JIMENEZ-CERVANTES C.Melanocortin-1 receptor structure and functional regulation[J].Pigment Cell Res，2005，18（6）：393-410.

[25] WOODCOCK M R，VAUGHN-WOLFE J，ELIAS A，et al.Identification of mutant genes and introgressed tiger salamander DNA in the laboratory axolotl，Ambystoma mexicanum[J].Scientific Reports，2017，7（1）：1-10.

Cloning and Expression Analysis of MC1R in Different Skin Color Phenotypes in Giant Salamanders （Andrias davidianus）

DENG Jie1，WEI Xiaoyan2，ZHANG Han1，MA Hongying1，WANG Qijun1，ZHAO Hu1，ZHANG Hongxing1，JIANG Wei1*

（1.Shaanxi Key Laboratory for Animal Conservation，Shaanxi Institute of Zoology，Xian 710032，China;2.Lishan Animal Husbandry & Veterinary Station， Xian 710600，China）

Abstract：To investigate the relationship between MC1R gene and skin color formation of amphibians，the giant salamander（Andrias davidianus） MC1R gene were cloned and sequence characteristics were analyzed using bioinformatics tools.Meanwhile，by quantitative real-time PCR （qRT-PCR），expression patterns of MC1R gene in ten different tissues and in four types of skin colorphenotypes were detected.The obtained MC1R cDNA were 295 bp long.Multiple sequence alignment indicated the giant salamander MC1R had a high nucleotides similarity with amphibians and reptiles，and it had low similarity with mammalian and bird.These results were further confirmed by phylogenetic tree analysis.Quantitative analysis showed that MC1R mRNA expressed in all tissues in giant salamander，among which the maximum level expression were founded in skin.Besides，MC1R mRNA displayed a higher expression in the melanic skin than other colour phenotypes.The distinctive sequence characteristics and expression pattern suggested that there might be different regulatory mechanism of MC1R gene in skin color formation in giant salamander compare with other species.

Key words：giant salamander（Andrias davidianus）; body color; melanin; MC1R gene; tissue expression

（收稿日期：2020-09-02）

基金項目：陜西省科學(xué)院科技計劃項目“大鯢體色性狀相關(guān)基因克隆表達(dá)、序列特征及SNP分析”（2014K-19）;陜西省科學(xué)院重點項目“秦巴山區(qū)大鯢種質(zhì)資源調(diào)查與遺傳多樣性分析”（2015K-03）。

作者簡介：鄧捷（1986-），女，助理研究員，碩士，研究方向：水生生物保護(hù)與養(yǎng)殖。E-mail：dengjie0311@ms.xab.ac.cn。

通信作者：姜維（1981-），女，副研究員，博士，研究方向：水生生物保護(hù)與養(yǎng)殖。E-mail：jiangwei197981@163.com。