矯健 劉赫迪 趙玉 查江杰 杜鵑 蓋欣欣 郭素芬

[摘要]?目的?探究人乳頭狀甲狀腺癌（papillary?thyroid?cancer，PTC）細(xì)胞TPC-1中長鏈非編碼RNA（long?non-coding?RNA，lncRNA）肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis?associated?in?lung?adenocarcinoma?transcript?1，MALAT1）的表達(dá)，及沉默MALAT1對TPC-1細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響。方法?體外培養(yǎng)PTC細(xì)胞系TPC-1和人正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞系Nthy-ori3-1，采用定量反轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative?reverse?transcriptase-mediated?PCR，qRT-PCR）檢測MALAT1在TPC-1和Nthy-ori3-1細(xì)胞系中的表達(dá)水平；構(gòu)建干擾小RNA（small?interfering?RNA，siRNA），取對數(shù)生長期的TPC-1細(xì)胞，經(jīng)脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾TPC-1細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)，設(shè)置對照組（僅加入培養(yǎng)基）、MALAT1沉默對照組（si-NC組，加入空質(zhì)粒載體）、MALAT1沉默組（si-MALAT1組，加入MALAT1-siRNA質(zhì)粒），并采用qRT-PCR檢測MALAT1的mRNA表達(dá)情況；CCK-8檢測TPC-1細(xì)胞的增殖情況；Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測TPC-1細(xì)胞侵襲能力；劃痕試驗(yàn)檢測TPC-1細(xì)胞遷移能力。結(jié)果?與Nthy-ori3-1細(xì)胞相比，TPC-1中MALAT1的表達(dá)上調(diào)（P<0.01）。與對照組、si-NC組比較，si-MALAT1組MALAT1表達(dá)水平明顯降低（均P<0.01），TPC-1細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力均顯著減弱（P<0.001，P<0.01，P<0.05）。結(jié)論?沉默MALAT1可抑制人PTC細(xì)胞TPC-1的增殖、侵襲及遷移能力。

[關(guān)鍵詞]?lncRNA?MALAT1；乳頭狀甲狀腺癌；增殖；侵襲；遷移

[中圖分類號]?R736??????[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.24.003

Effects?of?lncRNA?MALAT1?on?proliferation，?invasion?and?migration?of?human?papillary?thyroid?carcinoma?cells

JIAO?Jian1，2，?LIU?Hedi1，2，?ZHAO?Yu1，2，?ZHA?Jiangjie3，?DU?Juan1，2，?GAI?Xinxin1，2，?GUO?Sufen1，2

1.Pathology?Teaching?and?Research?Office，?Mudanjiang?Medical?University，?Mudanjiang?157011，?Heilongjiang，?China;?2.Heilongjiang?Provincial?Key?Laboratory?of?Cancer?Disease?Prevention?and?Control，?Mudanjiang?157011，?Heilongjiang，?China;?3.Laboratory?Department，?Hongqi?Hospital?affiliated?to?Mudanjiang?Medical?University，?Mudanjiang?157011，?Heilongjiang，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?expression?of?long?non-coding?RNA?（lncRNA）?metastasis?associated?in?lung?adenocarcinoma?transcript?1（MALAT1）?in?human?papillary?thyroid?cancer?（PTC）?cells?TPC-1，?and?the?effect?of?silencing?MALAT1?on?TPC-1?cell?proliferation，?invasion，?and?migration.?Methods?In?vitro?cultivation?of?PTC?cell?line?TPC-1?and?human?normal?thyroid?follicular?epithelial?cell?line?Nthy-ori3-1，?quantitative?reverse?transcriptase-mediated?PCR?（qRT-PCR）?was?used?to?detect?the?expression?level?of?MALAT1?in?TPC-1?and?Nthy-ori3-1?cell?lines;?Construct?small?interfering?RNA?（siRNA），?take?logarithmic?growth?stage?TPC-1?cells，?and?use?liposome?transient?transfection?technology?to?interfere?with?the?expression?of?MALAT1?in?TPC-1?cells.?Set?up?a?control?group?（only?adding?culture?medium），?a?MALAT1?silencing?control?group?（si-NC?group，?adding?empty?plasmid?carrier），?and?a?MALAT1?silencing?group?（si-MALAT1?group，?adding?MALAT1-siRNA?plasmid），?and?use?qRT-PCR?to?detect?the?mRNA?expression?of?MALAT1;?CCK-8?was?used?to?detect?the?proliferation?of?TPC-1?cells;?Transwell?cell?assay?was?used?to?detect?the?invasiveness?of?TPC-1?cells;?The?ability?of?TPC-1?Cell?migration?was?tested?by?scratch?test.?Results?Compared?with?Nthy-ori3-1?cell，?the?MALAT1?expression?in?TPC-1?cell?was?increased?（P<0.01）.?Compared?with?control?group?and?si-NC?group，?respectively，?the?expression?of?MALAT1?was?reduced?（both?P<0.01），?the?proliferation?ability，?invasion?and?migration?ability?of?TPC-1?cell?in?the?si-MALAT1?group?were?reduced?（P<0.001，?P<0.01，?P<0.05）.?Conclusion?Silencing?MALAT1?can?inhibit?the?proliferation，?invasion?and?migration?of?TPC-1?cell.

[Key?words]?Lnc?RNA?MALAT1;?Papillary?thyroid?cancer;?Cell?proliferation;?Cell?invasion;?Cell?migration

甲狀腺癌（thyroid?cancer，TC）是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的癌癥，其發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)持續(xù)增長。TC主要有4種亞型：乳頭狀甲狀腺癌（papillary?thyroid?cancer，PTC）、濾泡狀甲狀腺癌（follicular?thyroid?carcinoma，F(xiàn)TC）、甲狀腺髓樣癌（medullary?thyroid?carcinoma，MTC）和間變性甲狀腺癌（anaplastic?thyroid?carcinoma，ATC）。其中，PTC是最常見的類型，約占TC的85%[1]。通過手術(shù)切除、甲狀腺激素和輔助放射性碘治療，大多數(shù)PTC患者預(yù)后較好。然而，PTC有很強(qiáng)的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移趨勢，一些患者表現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞分化差和轉(zhuǎn)移，面臨復(fù)發(fā)和死亡[2]。因此，迫切需要明確PTC潛在惡性轉(zhuǎn)移行為的分子機(jī)制，為PTC轉(zhuǎn)移提供干預(yù)靶點(diǎn)，并為開發(fā)有效的治療策略提供理論依據(jù)。

長鏈非編碼RNA（long?non-coding?RNA，lncRNA）是非編碼RNA（non-coding?RNA，ncRNA）中的一種，長度大于200bp，約占ncRNA總數(shù)的80%。越來越多的研究提示lncRNA與人類癌癥的進(jìn)展有關(guān)，如PTC[3]。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis?associated?in?lung?adenocarcinoma?transcript?1，MALAT1）是最早被發(fā)現(xiàn)的lncRNA之一，其基因位于人染色體11q13，序列長度約8.5kb，MALAT1在人類正常組織中廣泛表達(dá)，在其他哺乳動物物種中保守表達(dá)，提示其在發(fā)育和進(jìn)化中具有潛在的重要功能[4]。MALAT1作為一種重要的lncRNA，近年來得到廣泛研究，特別是其在癌癥發(fā)展、轉(zhuǎn)移、治療和預(yù)后評估等方面的作用[5-9]。已有研究表明，MALAT1通過轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)和細(xì)胞活力，如各種上游調(diào)控因子可與啟動子結(jié)合，激活MALAT1的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致MALAT1在不同類型癌癥中的表達(dá)上調(diào)[10]。本研究以MALAT1為研究對象，探討MALAT1在人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞系TPC-1中的表達(dá)情況，及其對TPC-1細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響。

1??材料與方法

1.1??材料

人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞株TPC-1（武漢普諾賽生命科技有限公司）；人正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞株Nthy-ori3-1（北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司）；RPMI?1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；RNA提取試劑盒（E.Z.N.A.?TM?HP?total?RNA?kit）（美國Omega?Bio-Tek公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（transcriptor?first?strand?cDNA）（美國Thermofisher公司）；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase?chain?reaction，PCR）預(yù)混液（fast?SYBR?green?PCR?master?mix）（美國Roche公司）；MALAT1干擾小RNA（small?interfering?RNA，siRNA）干擾序列及轉(zhuǎn)染試劑（廣州市銳博生物科技有限公司）；MALAT1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate?dehydrogenase，GAPDH）引物（上海生工生物工程有限公司）；CCK-8試劑盒（上海尚寶生物科技有限公司）；Transwell小室、人工基膜（matrigel膠）（美國?Corning公司）。

1.2??細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

將TPC-1細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI?1640完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%?CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化，1∶2～1∶3的比例傳代。

取對數(shù)期的TPC-1細(xì)胞隨機(jī)分為3組，即對照組、MALAT1沉默對照組（si-NC組），MALAT1沉默組（si-MALAT1組）。在轉(zhuǎn)染前1d，將TPC-1細(xì)胞進(jìn)行傳代，且更換為無雙抗完全培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后均勻接種于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度約70%時，再行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。對照組細(xì)胞僅加入等量的無雙抗完全培養(yǎng)基，其余兩組按照轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染后的6孔板置于37℃、5%?CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，24h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3??反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時熒光定量PCR

應(yīng)用RNA提取試劑盒提取TPC-1細(xì)胞系、Nthy-ori3-1細(xì)胞系及各實(shí)驗(yàn)組總RNA并測定其濃度及純度，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA（–20℃保存）。使用Fast?SYBR?green?PCR?master?mix通過引物序列進(jìn)行擴(kuò)增。每組設(shè)置3個復(fù)孔，使用GAPDH作為內(nèi)部對照。采用2–ΔΔCt法確定轉(zhuǎn)染效率，并分析每個樣品的基因相對表達(dá)差異。PCR擴(kuò)增引物見表1。qPCR熱循環(huán)條件：總反應(yīng)體系20μl，95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，60℃退火1min，72℃延伸10min，進(jìn)行40個循環(huán)。使用7500實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行定量PCR檢測。

1.4??CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

根據(jù)試劑說明書，將TPC-1細(xì)胞接種于96孔板（細(xì)胞密度為5×105/孔），24h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染并分組即對照組、si-NC組、si-MALAT1組，置于37℃、5%?CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24h、48h、72h后每孔加入10μl?CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱孵育2h后使用酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）測定每孔450nm波長下的吸光度（optical?density，OD）值，每組設(shè)置3個復(fù)孔，最終整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5??Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲

用無血清的RPMI?1640重懸細(xì)胞并接種于涂有Matrigel基質(zhì)凝膠的24孔板小室上室，下室添加含10%血清的RPMI?1640培養(yǎng)基，將裝有Transwell小室的24孔板置于37℃、5%?CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，24h后24孔板小室下室用多聚甲醛固定20min，結(jié)晶紫染色15min，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate?buffered?saline，PBS）洗滌3次后用棉簽擦去濾膜表面的細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個高倍視野（×100）觀察，并計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞平均數(shù)，每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.6??劃痕試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移

將對數(shù)生長期的TPC-1細(xì)胞懸液接種于6孔板（細(xì)胞密度為5×106/孔），將細(xì)胞分為3組即對照組、si-NC組、si-MALAT1組，待細(xì)胞長滿后用100μl移液器槍頭對每孔垂直劃痕，PBS洗滌3次，將6孔板置于37℃、5%?CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，于0h、12h、24h分別在倒置光學(xué)顯微鏡下對各孔細(xì)胞拍照，隨機(jī)觀察5個高倍視野（×100），計(jì)算細(xì)胞運(yùn)動面積，每組設(shè)置3個復(fù)孔。使用Image?J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7??統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用GraphPad?Prism?8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，3組間數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2??結(jié)果

2.1??MALAT1在TPC-1細(xì)胞中的表達(dá)情況

定量反轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative?reverse?transcriptase-?mediated?PCR，qRT-PCR）結(jié)果顯示：與Nthy-ori3-1細(xì)胞相比，TPC-1細(xì)胞中MALAT1相對表達(dá)水平顯著升高[（1.008±0.406）vs.（0.500±0.200）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.56，P<0.01），見圖1。

2.2??沉默MALAT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率檢測

qRT-PCR結(jié)果顯示：對照組、si-NC組、si-MALAT1組MALAT1表達(dá)含量分別為1.03±0.09、1.00±0.01、0.48±0.03，3組細(xì)胞的MALAT1表達(dá)含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=122.50，P<0.01）。與對照組和si-NC組相比，si-MALAT1組MALAT1表達(dá)含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），對照組與si-NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示MALAT1沉默效果顯著，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，見圖2。

2.3??沉默MALAT1對TPC-1細(xì)胞增殖的影響

通過CCK-8法檢測沉默MALAT對TPC-1細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，與對照組和si-NC組相比，si-MALAT1組的細(xì)胞增殖能力在24h、48h、72h均明顯降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.001），見表2、圖3。

2.4??沉默MALAT1對TPC-1細(xì)胞侵襲的影響

通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測TPC-1細(xì)胞的侵襲能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組、si-NC組和si-MALAT1組TPC-1細(xì)胞侵襲數(shù)量分別為（140.33±6.35）個、（140.00±2.65）個、（97.67±5.69）個。3組TPC-1細(xì)胞侵襲數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=68.02，P<0.01）。與對照組、si-NC組比較，si-MALAT1組TPC-1細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），對照組與si-NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖4。

2.5??沉默MALAT1對TPC-1細(xì)胞遷移的影響

利用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測TPC-1細(xì)胞的遷移能力，劃痕12h后，對照組、si-NC組和si-MALAT1組的遷移率分別為（36.73±1.32）%、（37.17±3.46）%和（28.05±4.32）%，3組細(xì)胞遷移率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.65，P<0.05）。si-MALAT1組的細(xì)胞遷移能力低于對照組和si-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），對照組與si-NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；同樣劃痕24h后，對照組、si-NC組和si-MALAT1組的遷移率分別為（62.16±0.79）%、（62.26±0.80）%、（51.40±6.68）%，3組細(xì)胞遷移率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.65，P<0.05）。si-MALAT1組的細(xì)胞遷移能力仍低于對照組和si-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），對照組與si-NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖5。

3??討論

盡管PTC生存率較高，但隨著病情進(jìn)展，腫瘤難以完全切除、高風(fēng)險(xiǎn)和對放化療不敏感使晚期PTC患者預(yù)后不良[13]。因此，研究TC的發(fā)病機(jī)制有助于提高TC的早期診斷和開發(fā)新療法，改善患者的生活質(zhì)量和預(yù)后，降低TC患者的病死率。

MALAT1最初被確定為非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后標(biāo)志物[14]。相關(guān)研究表明，MALAT1在其他癌癥的發(fā)生發(fā)展中也起重要作用。在各種癌癥中，MALAT1的表達(dá)通常是上調(diào)的。上調(diào)MALAT1可增加細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，下調(diào)MALAT1可減少細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，MALAT1的過表達(dá)促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，且MALAT1已被確定為食管癌進(jìn)展和預(yù)后的生物標(biāo)志物[16-17]。在胃癌中MALAT1的高水平表達(dá)促進(jìn)癌癥的發(fā)展和腹膜轉(zhuǎn)移[18]。在胰腺癌的臨床研究中，MALAT1的異常表達(dá)被確定為其臨床進(jìn)展和預(yù)后的不利預(yù)測因素[19]。MALAT1在骨肉瘤中顯著上調(diào)，可通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-?kinase-protein?kinase?B，PI3K/PKB）信號通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[20]。高表達(dá)的MALAT1與宮頸癌患者不良預(yù)后顯著相關(guān)[21]。下調(diào)MALAT1通過調(diào)節(jié)SOX9基因抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[22]。因此，MALAT1對PTC細(xì)胞TPC-1的增殖、侵襲及遷移能力的影響是本研究的重點(diǎn)。

本研究中，筆者采用qRT-PCR技術(shù)檢測MALATI在TPC-1細(xì)胞中的表達(dá)情況及在沉默MALAT1后TPC-1細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的變化。結(jié)果提示：TPC-1細(xì)胞中MALAT1高表達(dá)；沉默MALAT1后，TPC-1細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力均顯著降低。由此可見，MALAT1在人PTC細(xì)胞中高表達(dá)并對癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力起促進(jìn)作用。

本研究尚存在一定的局限性，首先，筆者僅在人PTC一個細(xì)胞系（TPC-1）進(jìn)行MALAT1的表達(dá)分析，未選取其他細(xì)胞系進(jìn)行檢測；其次，未進(jìn)行MALAT1對PTC細(xì)胞其他生物學(xué)行為的影響，如上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等；此外，本研究只進(jìn)行體外研究，MALAT1對PTC細(xì)胞生物學(xué)功能影響的機(jī)制還需要通過體內(nèi)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，通過沉默MALAT1可抑制TPC-1細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力，本研究為PTC的治療提供新的分子基礎(chǔ)和理論依據(jù)，有望成為PTC治療的潛在臨床靶點(diǎn)。

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